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Immunology and Infection

Prüfung für anorganisches Polyphosphat in Bakterien

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58818
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Summary

Wir beschreiben eine einfache Methode für schnelle Quantifizierung von anorganischen Polyphosphat in verschiedenen Bakterien, einschließlich gramnegative und grampositive mykobakteriellen Arten.

Abstract

Anorganisches Polyphosphat (Polypen) ist eine biologische Polymer in den Zellen aus allen Bereichen des Lebens gefunden und ist erforderlich für die Virulenz und die Stress-Reaktion in vielen Bakterien. Es gibt eine Vielzahl von Methoden zur Quantifizierung PolyP in biologischen Materialien, von die viele arbeitsintensive oder unsensibel, ihre Nützlichkeit zu begrenzen sind. Wir stellen Ihnen hier eine optimierte Methode zur Quantifizierung der PolyP in Bakterien, über eine Kieselsäure Membran Spalte Extraktion optimiert für schnelle Verarbeitung von mehreren Proben, Verdauung der PolyP mit dem PolyP-spezifische Exopolyphosphatase ScPPX und Erkennung von der daraus resultierende freie Phosphat mit einem sensiblen Ascorbinsäure-basierte farbmetrischen Assay. Dieses Verfahren ist einfach, kostengünstig und ermöglicht zuverlässige PolyP Quantifizierung in unterschiedlichen Bakterienarten. Wir präsentieren Ihnen repräsentative PolyP Quantifizierung von Gram-negativen Bakteriums (Escherichia coli), grampositive Milchsäure-Bakterien (Lactobacillus Reuteri) und der mykobakteriellen Spezies (Mycobacterium Smegmatis). Wir sind auch ein einfaches Protokoll für Nickel Affinitätsreinigung mg-Mengen von ScPPX, die derzeit nicht im Handel erhältlich.

Introduction

Anorganisches Polyphosphat (Polypen) ist eine lineare Biopolymer Phosphoanhydride verknüpft Phosphat-Einheiten, die in allen Bereichen des Lebens1,2,3gefunden wird. In verschiedenen Bakterien ist PolyP essentiell für Stress-Reaktion, Beweglichkeit, Biofilmbildung, Zellzyklus-Kontrolle, Antibiotika-Resistenz und Virulenz4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studien der PolyP Stoffwechsel in Bakterien haben daher das Potenzial, grundlegende Einblicke in die Fähigkeit der Bakterien verursachen Krankheiten und gedeihen in unterschiedlichen Umgebungen. In vielen Fällen sind jedoch die verfügbaren Methoden zur Quantifizierung PolyP in Bakterienzellen ein limitierender Faktor in diesen Studien.

Es gibt mehrere Methoden, die derzeit zur Messung der PolyP Ebenen in biologischem Material. Diese Methoden beinhalten in der Regel zwei verschiedene Schritte: Extrahieren von Polypen und Quantifizierung der PolyP präsentieren in diesen Extrakten. Die aktuelle Gold-Standard-Methode, entwickelt für die Hefe Saccharomyces Cerevisiae von Bru und Kollegen12, Extrakte Polypen zusammen mit DNA und RNA mit Phenol und Chloroform, gefolgt von Ethanol Niederschlag, Behandlung mit Deoxyribonuclease (DNase) und Ribonuklease (RNase) und Verdauung der daraus resultierenden gereinigten Polypen mit S. Cerevisiae PolyP-abbauenden Enzyms Exopolyphosphatase (ScPPX)13 bis freie Phosphat, nachgeben, die dann quantifiziert wird mit einem Malachit Grün-basierte kolorimetrischen Probe. Dieses Verfahren ist sehr quantitative aber arbeitsintensiv, Begrenzung der Anzahl der Proben, die in einem einzigen Experiment verarbeitet werden können, und ist nicht optimiert für bakterielle Proben. Andere haben berichtet, Extrahieren von PolyP aus einer Vielzahl von Zellen und Geweben mit Kieselsäure Perlen ("Glassmilk") oder Kieselsäure Membran Spalten6,14,15,16,17, 18. Diese Methoden extrahieren nicht effizient kurzkettigen PolyP (weniger als 60 Phosphat Einheiten)12,14,15, zwar von weniger Belang für Bakterien, die in der Regel gedacht werden, um in erster Linie zu synthetisieren ist langkettige PolyP3. Ältere Methoden der PolyP Extraktion mit starken Säuren19,20 sind nicht mehr weit verbreitet, da Polypen unter sauren Bedingungen12instabil ist.

Es gibt auch eine Vielzahl von gemeldeten Methoden zur Quantifizierung PolyP. Zu den häufigsten ist 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), ein Fluoreszenzfarbstoff mehr normalerweise verwendet, um DNA zu beflecken. DAPI-PolyP komplexe haben unterschiedliche Fluoreszenz Emission und Erregung Maxima als DAPI-DNA-komplexen21,22, aber es gibt erheblichen Störungen von anderen zellulären Komponenten, einschließlich RNA, Nukleotide und Inosit Phosphate12,15,16,23, Verringerung der Spezifität und Sensitivität der PolyP Messungen mit dieser Methode. Alternativ können Polypen und Adenosin-diphosphat (ADP) in Adenosintriphosphat (ATP) mit gereinigtem Escherichia coli umgewandelt werden Polypen Kinase (PPK) und die daraus resultierende ATP quantifiziert mit Luciferase14,17 ,18. Dies erlaubt den Nachweis sehr kleiner Mengen von Polypen, aber erfordert zwei enzymatische Reaktionsschritte und sowohl Luciferin und sehr reine ADP, die teure Reagenzien sind. ScPPX, die speziell Übersichten PolyP in freie Phosphat6,12,13,24, die mit einfacheren Methoden, aber ScPPX erkannt werden kann durch DNA und RNA12gehemmt wird, Meißel-DNase und RNase-Behandlung von Polypen-haltigen Extrakten. Weder die PPK als auch die ScPPX sind im Handel erhältlich, und PPK Reinigung ist relativ komplex25,26.

PolyP in Zelle Lysates oder Extrakte kann auch visualisiert werden auf Polyacrylamid-Gele von DAPI negative Färbung27,28,29,30, eine Methode, die erlaubt die Beurteilung der Kettenlänge, sondern ist niedrig-Durchsatz und schlecht quantitative.

Wir berichten nun einen schnell, preiswert, Medium-Durchsatz PolyP-Assay, der schnelle Quantifizierung der PolyP Ebenen in unterschiedlichen Bakterienarten ermöglicht. Diese Methode beginnt mit der Lyse der Bakterienzellen bei 95 ° C in 4 M Guanidin erfolgt (GITC)14 um zelluläre Phosphatasen, gefolgt von einer Kieselsäure Membran Spalte Extraktion optimiert für schnelle Bearbeitung mehrerer Proben zu inaktivieren. Der daraus resultierende PolyP-haltiger Extrakt wird dann mit einem großen Überschuss von ScPPX, wodurch die Notwendigkeit für DNase und RNase-Behandlung verdaut. Wir sind ein Protokoll für einfache Nickel Affinitätsreinigung mg-Mengen von ScPPX. PolyP abgeleitet frei Phosphat ist schließlich mit einem einfach, sensible, Ascorbinsäure-basierte kolorimetrischen Probe24 quantifiziert und normiert auf zelluläre Gesamtprotein. Diese Methode vereinfacht die Messung der PolyP in Bakterienzellen, und wir zeigen seine Verwendung mit repräsentativer Arten von Gram-negativen Bakterien, grampositive Bakterien und Mykobakterien.

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Protocol

1. reinigen Hefe Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Die E. Coli Protein Überexpression Belastung BL21(DE3)31 mit Plasmid pScPPX26 durch Elektroporation32 oder chemische Umwandlung33zu verwandeln.
  2. 1 L Lysogeny Brühe (LB), enthält 100 µg mL-1 Ampicillin in einem 2 L unbaffled Kolben mit einer einzigen Kolonie von BL21(DE3) mit pScPPX2 zu impfen und Inkubation über Nacht bei 37 ° C ohne schütteln, bis eine Extinktion bei 600 nm (ein600) von ca. 0,3, wie in einem Spektralphotometer gemessen.
  3. Starten Sie die Kultur schütteln (180 u/min) und inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C, während welcher Zeit die Zellen, ein A-600 von 0,4 wachsen - 0,5.
  4. Eine Endkonzentration von 1 mM und eine zusätzliche 100 µg mL-1 Ampicillin Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) hinzufügen, und klicken Sie dann 4 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 180 u/min inkubieren.
    Hinweis: Dieses Protokoll Überexpression erzeugt eine große Menge an löslichen ScPPX. Jedoch ScPPX Überexpression ist sehr nachsichtig und eine Vielzahl von anderen gängigen Protein Überexpression Protokolle wurden verwendet, um ScPPX erfolgreich zu reinigen.
  5. Übertragen Sie die Zellen auf eine Zentrifuge Flasche 1 L und Ernte sie durch Zentrifugieren für 20 min bei 5000 X g bei 4 ° C. Entfernen des Überstands und die Zelle Pellet auf eine 50 mL konische Rohr übertragen.
    Hinweis: Zelle Pellets können auf unbestimmte Zeit bei-80 ° c gelagert werden
  6. Das Pellet auf Eis auftauen, dann in 9 mL 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl und 5 mM Imidazol (pH 8) für ein Gesamtvolumen von ca. 10 mL aufzuwirbeln.
  7. (Endkonzentrationen) 1 mg mL-1 Lysozym, 2 mM MgCl2und 50 Einheiten mL-1 eine RNA und DNA erniedrigender Endonuklease hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
    Hinweis: ScPPX bindet Nukleinsäuren (Daten nicht gezeigt), so Nuklease Behandlung während der Reinigung unerlässlich ist.
  8. Mit einem Sonikator mit einem Microtip (siehe Tabelle der Materialien), lösen Sie die Zellen von 2 Zyklen der Beschallung auf Eis bei 50 % Leistung, pulsieren 5 s ein und 5 s, mit einer 2 min Pause zwischen den Zyklen.
    Hinweis: Verwenden Sie geeigneten Gehörschutz während der Beschallung. In ähnlicher Weise auf den Fall mit Überexpression, eine Vielzahl von Zelle Lysis Methoden sind für ScPPX Reinigung zulässig.
  9. Entfernen Sie die unlöslichen Ablagerungen durch Zentrifugieren lysate für 20 min bei 20.000 x g bei 4 ° c Filtern Sie den daraus resultierende Überstand (ca. 10 mL) durch einen 0,8 µm Pore Größe Celluloseacetat Spritze Filter.
  10. Laden der lysate auf eine Nickel-geladene 5 mL chelatisierenden Spalte (siehe Tabelle der Materialien) mit einer peristaltischen Pumpe oder eine große Spritze.
  11. Spülen Sie die Spalte mit 50 mL 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl 5 mM Imidazol (pH 8).
  12. Spülen Sie die Spalte mit 50 mL 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 20 mM Imidazol (pH 8).
  13. Eluieren Sie ScPPX mit 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl und 0,5 M Imidazol (pH 8), sammeln von 15 1-mL-Fraktionen. Testen Sie diese Elution Fraktionen für Eiweißgehalt mit Bradford Protein Assay34 (siehe Tabelle der Materialien), und führen Sie eine SDS-PAGE Gel35 um zu bestätigen, welche Fraktionen gereinigten ScPPX enthalten (Molekulargewicht = 45 kDa).
  14. Bündeln Sie die Fraktionen mit reinen ScPPX zu und passen Sie die Konzentration der gepoolten Protein zu ca. 2 mg mL-1 mit 50 mM HEPES und 0,5 M NaCl. Im nächsten Schritt können höhere Proteinkonzentrationen auszufällen.
  15. Tauschen Sie die gereinigten ScPPX in Speicher-Puffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, 10 % [V/V] Glycerin) durch Dialyse. Zusammengefasste ScPPX Brüche in einer versiegelten Länge von 12.000-14.000 Da Molekulargewicht cutoff Dialyse Membran Schlauch (siehe Tabelle der Materialien) und aussetzen in 1 L Puffer speichern unter ständigen Rühren bei 4 ° C für mindestens 4 Std. Wiederholen Sie diesen Schritt mit frischen Puffer für eine Gesamtmenge von 3 Puffer Änderungen speichern.
  16. Übertragen Sie das gereinigte, dialysierten Protein ein Zentrifugenröhrchen oder Röhren und Zentrifuge für 20 min bei 20.000 x g bei 4 ° C, unlösliche Aggregate zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand sorgfältig auf eine saubere 15 mL konische Rohr.
  17. Passen Sie die Konzentration des gereinigten ScPPX auf 1 mg mL-1 mit Puffer speichern, fügen Sie 0,1 % (w/V) Protease-freie Rinderserumalbumin (BSA; Endkonzentration) und Speicher für bis zu 6 Monate bei 4 ° C.
    Hinweis: ScPPX verliert mehr als 90 % seiner Tätigkeit, wenn es gefroren13ist.

(2) Ernte Proben für Polyphosphat Extraktion

  1. Wachsen Sie Bakterien unter den Bedingungen von Interesse für die Bestimmung der PolyP Inhalt. Wachsen Sie für dieses Protokoll Lactobacillus Reuteri36 über Nacht bei 37 ° C ohne schütteln Apfelsäure Enzym Induktion (MEI) mittlere37 ohne Cystein (MEI-C).
  2. Sammle genügend Zellen durch Zentrifugation in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf 50 – 100 µg des zellulären Proteins (siehe Schritt 3 unten). Dies ist für E. Coli, 1 mL einer Log-Phase-Kultur auf eine A-600 von 0,2 - 0,4. Das ist für L. Reuteri1 mL einer Übernacht-Kultur. Passen Sie ggf. für andere Arten von Interesse.
  3. Vollständig zu entfernen den Überstand von der Zelle Pellets.
  4. Aufschwemmen Sie der Zelle Pellets in 250 µL GITC Lyse Puffer (4 M Guanidin erfolgt, 50 mM Tris-HCl, pH 7) und lösen Sie durch Inkubation bei 95 ° C für 10 min. Store Lysates bei-80 ° C.
    Hinweis: Seien Sie konsequent mit der Lyse Zeit, da längere Inkubation bei hoher Temperatur zur Verschlechterung der PolyP durch Hydrolyse38führen kann. Lysates können auf unbestimmte Zeit bei-80 ° c gelagert werden
    Achtung: Guanidin-Herstellung ist ein chaotropen Salz sollte mit Handschuhen behandelt und als Sondermüll entsorgt.

3. Messung des Eiweißgehalts der Zelle Lysates

  1. Bereiten Sie BSA-Normen mit 0, 0,1, 0,2 und 0,4 mg mL-1 der BSA in GITC Lyse Puffer vor.
    Hinweis: Es ist wichtig die BSA Standards GITC, da GITC die Farbentwicklung der Bradford-Test beeinflusst machen. BSA Standards können auf unbestimmte Zeit bei-20 ° c gelagert werden
  2. Aliquoten 5 µL der aufgetauten, gut gemischte Zelle Lysates und BSA Standards, Brunnen in einer klaren 96-Well-Platte zu trennen.
  3. Fügen Sie 195 µL Bradford-Reagenz-34 in jede Vertiefung und Messung der Extinktion bei 595 nm (eine595) in einem Teller-Reader (siehe Tabelle der Materialien).
  4. Berechnen Sie die Menge an Protein in jede Vertiefung im Vergleich zur BSA standard Kurve, mit der Formel y = Mx + b, wo y ist eine595, X µg von BSA, m ist die Steigung der Standardkurve, und b ist der y-Achsenabschnitt der Standardkurve. Multiplizieren Sie den resultierenden Wert mit 0,05 bis die Gesamt mg Protein in jeder Probe zu bestimmen.

4. extrahieren Polyphosphat

  1. Fügen Sie 250 µL von 95 % Ethanol zu jeder Probe GITC lysiert und Vortex mischen.
  2. Gelten diese Mischung für eine Kieselsäure Membran Spin Spalte und Zentrifuge für 30 s bei 16.100 x g.
  3. Die Flow-through zu verwerfen, dann fügen Sie 750 µL 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 % Ethanol und Zentrifuge für 30 s bei 16.100 x g.
  4. Entsorgen Sie durchströmten und Zentrifuge für 2 min bei 16.100 x g.
  5. Die Spalte in einem sauberen 1,5 mL Microfuge Rohr geben Sie und 150 µL 50 mM Tris-HCl (pH 8).
  6. In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie, dann eluieren Sie PolyP durch für 2 min bei 8.000 x g zentrifugieren.
    Hinweis: Falls gewünscht, können die Eluate bei-20 ° C für mindestens 1 Woche gespeichert werden.

(5) verdauen Polyphosphat

  1. Bereiten Sie Normen mit 0, 5, 50 oder 200 µM Kalium Phosphat in 50 mM Tris-HCl (pH 8 vor).
    Hinweis: Kalium-Phosphat-Standards können auf unbestimmte Zeit bei Raumtemperatur gelagert werden.
  2. Aliquoten 100 µL der einzelnen Phosphat standard und extrahiert PolyP Proben in separaten Vertiefungen einer klaren 96-Well-Platte.
  3. Bereiten Sie eine master-Mix mit (pro Probe): 30 µL 5 X ScPPX Reaktion Puffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM Ammoniumacetat, pH 7,5)13, 19 µL H2O und 1 µL des gereinigten ScPPX (1 mg mL-1).
  4. Geben Sie 50 µL der master-Mix in jedes der 96-Well-Platte. 15 min bei 37 ° c inkubieren
    Hinweis: Falls gewünscht, können die verdaute PolyP Proben bei-20 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.

6. Nachweis von freien Phosphat24

  1. Bereiten Sie Erkennung Lösung Basis durch Auflösen von 0,185 g Antimon-Kalium-Tartrat in 200 mL Wasser, 150 mL 4 N H2SO4, dann Zugabe von 1,49 g Ammonium Heptamolybdate. Rühren Sie auflösen und dann zu einem Endvolumen von 456 mL bringen. Filtern Sie die Lösung, um Partikel zu entfernen und zu speichern, lichtgeschützt bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
  2. Bereiten Sie eine Stammlösung 1 M Ascorbinsäure. Speicher für bis zu 1 Monat lichtgeschützt bei 4 ° C.
  3. Bereiten Sie einen frischen arbeiten bestand von Angriffsermittlungslösung jeden Tag durch das Mischen von 9,12 mL Angriffsermittlungslösung Basis mit 0,88 mL 1 M Ascorbinsäure. Lassen Sie die Erkennung Lösung vor Gebrauch auf Raumtemperatur kommen.
  4. Jede Probe und Standard in der 96-Well-Platte 50 µL Detection-Lösung hinzu und Inkubation bei Raumtemperatur für ca. 2 min zur Farbentwicklung zu ermöglichen.
  5. Messung der Extinktion bei 882 nm mit einem Teller-Lesegerät und berechnen die Phosphat-Konzentration von jeder Probe im Vergleich zu der Kalium-Phosphat-Standardkurve.
    Achtung: Die Erkennung-Lösung enthält giftige Salze und starken Säuren. Tragen Sie Handschuhe und behandeln Sie überschüssige Lösung als Sondermüll zu.

7. Berechnung der zellulären Polyphosphat Inhalt

  1. Konvertieren Sie die Phosphat-Konzentrationen in Schritt 6.5 Nanomoles PolyP abgeleitet Phosphat in jeder ganze Zelle lysate nach folgender Formel ermittelt:
    Nmol Polypen = 1,5 X (µM Phosphat / 10)
    Hinweis: Die standard-Kurve-basierte Methode in Schritt 6 bestimmt die Konzentration von Phosphat (in µM) in jeder 100 µL PolyP Probe regelmÄÑig im Schritt 5.2. Um diese Konzentration auf eine Reihe von Nmol konvertieren, 100 µL ist geteilt durch 106 um ein Volumen in L, multipliziert mit der Konzentration (µmol L-1), dann multipliziert mit 1.000 (die Anzahl der Nmol in einem µmol). Dies reduziert die Konzentration durch 10 dividiert. Das Gesamt-Extrakt Volumen vorbereitet in Schritt 4 ist 150 µL so 1,5 Nmol von Phosphat in den gesamten Extrakt vorhanden berechnen den resultierenden Wert multipliziert werden muß.
  2. Normalisieren Sie zellulären PolyP Inhalt zu zellulären Gesamtprotein geteilt Nmol PolyP durch mg Gesamt-Protein in jeder Probe in Schritt 3.4 bestimmt. PolyP Ebenen sind durch die Konzentration der einzelnen Polypen abgeleitet freie Phosphat ausgedrückt.
    Hinweis: In einigen Fällen kann die Menge der PolyP abgeleitet Phosphat in einer Probe vorhanden außerhalb des linearen Bereichs der Standardkurve Phosphat (Schritt 6.5) fallen. Wenn die Polypen sehr hoch sind, kann das überschüssige PolyP-haltigen Eluat aus Schritt 4.6 verdünnter 01:10 oder 1: 100, bei Bedarf und dann wieder wie in den Schritten 5 bis 7 beschrieben gemessen.

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Representative Results

In vereinfachter Form in Abbildung 1sind die wichtigsten Schritte des Protokolls diagrammed.

Veranschaulichen die Verwendung dieses Protokolls mit Gram-negativen Bakterien, Wildtyp E. Coli war MG165539 gewachsen, Mid Log-Phase im Reich LB-Medium bei 37 ° C mit schütteln (200 u/min), dann gespült und für weitere 2 h in inkubiert Morpholinopropanesulfonate-gepuffert (MOPS) minimale mittlere40 mit 4 g L-1 Glukose und 0,1 mM K2HPO4, eine Bedingung bekannt, Produktion von PolyP14,29zu induzieren. Wie in Abbildung 2A, erkannt wir keine Polypen in Wildtyp E. Coli gewachsen in LB und 192 ± 14 (Mittelwert ± Standardabweichung [SD]) Nmol PolyP mg-1 Gesamtprotein im MOPS, konsistent mit früheren Berichten14,29 . Wie erwartet ein ∆Ppk mutierten6, welche Mängel PolyP Kinase41, produziert keine Polypen in jedem Medium, produziert ein ∆Ppx mutierten6, die Exopolyphosphatase42fehlt, etwa die gleiche Menge an PolyP als der Wildtyp und einem ∆PhoB mutierten29, die in Phosphat Transport defekt, produziert deutlich weniger Polypen als der Wildtyp14,29,43.

Die Verwendung dieses Protokolls mit Gram-positiven Bakterien, Wildtyp L. Reuteri demonstrieren waren ATCC PTA 647536 und einer isogenen ppk1 null Mutant fehlt PolyP-Kinase, konstruiert unter der Regie von Oligo Restriktionsenzymen44, gestiegen, über Nacht in MEI-C bei 37 ° C ohne schütteln. Wie in Abbildung 2 b, der Wildtyp kumulierte 51 ± 6 Nmol PolyP mg-1 Gesamt-Protein unter diesen Bedingungen gezeigt, während die ppk1 mutierten kleiner als Hälfte diese Menge enthalten. L. Reuteri enthält eine zweite PolyP-Kinase kodiert, indem die ppk2 gen45, die vermutlich entfallen die Polypen in der ppk1 -null-Mutante präsentieren.

Um die Verwendung dieses Protokolls mit Mykobakterien zu demonstrieren, wurde Mycobacterium Smegmatis Stamm SMR546 Hartmans de Bont (HdB) mittlere47, dann gespült und verwässerte das Fünffache in HdB oder HdB mit 2 % Ethanol angebaut, Mid Log-Phase. Diese Kulturen wurden dann über Nacht bei 37 ° C mit schütteln (180 u/min) inkubiert. Wie in Abbildung 2gezeigt, in der Abwesenheit von Ethanol, angesammelt M. Smegmatis 141 ± 52 Nmol PolyP mg-1 Gesamt-Protein, während Ethanol Behandlung 102 Nmol PolyP mg-1 Gesamt-Protein eine Verdreifachung 437 ± geführt. Dieses Ergebnis war zu erwarten, da Ethanol zuvor gemeldet wurde, PolyP Ebenen M. Smegmatis48zu erheben.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung Polyphosphat Extraktion und Messung Verfahren. Die wesentlichen Schritte des Protokolls PolyP Quantifizierung werden dargestellt. Bakterienzelle Pellets sind bei 95 ° C im GITC (Guanidin erfolgt) lysiert. Kleine aliquoten die Lysates sind für den Eiweißgehalt unter Verwendung des Bradford-Tests untersucht. PolyP wird abgesaugt, mit Kieselsäure Membran Spalten und dann mit ScPPX verdaut. Die daraus resultierende freie Phosphat wird quantifiziert mit der Ascorbinsäure-Test. Insgesamt PolyP abgeleitet Phosphat ist in Gesamt-Protein für jede Probe normalisiert. Eine595 = Extinktion bei 595 nm; Ein882 = Extinktion bei 882 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Vertreter führt mit verschiedenen Bakterien. (A) E. Coli MG1655 Wildtyp und isogenen ∆Ppk, ∆Ppxund ∆PhoB Mutanten wurden angebaut, bei 37 ° C mit schütteln (200 u/min) auf einem600 = 0,2 - 0,4 im Reich LB-Medium (schwarze Kreise) und dann verschoben auf minimaler Medium (MOPS mit 4 g L-1 Glukose und 0,1 mM K2HPO4) 2 h (weiße Kreise; n = 3, ± SD). (B) L. Reuteri ATCC PTA 6475 (Kreise) und eine isogenen ppk1 null-Mutante (Dreiecke) waren Erwachsene über Nacht bei 37 ° C in MEI-C Medium ohne schütteln (n = 3, ± SD). (C) M. Smegmatis SMR5 wurde angebaut, bei 37 ° C mit schütteln (180 u/min) auf einem600 = 1 in HdB Medium mit (geschlossene Quadrate) oder ohne (offene Quadrate) 2 % Äthanol (n = 3, ± SD). PolyP Ebenen sind durch die Konzentration der einzelnen Polypen abgeleitet freie Phosphat ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Das hier beschriebene Protokoll vereinfacht und beschleunigt die Quantifizierung der PolyP Ebenen in unterschiedlichen Bakterien mit einem typischen Satz von 24 Proben nehmen ca. 1,5 h vollständig verarbeiten. Dies ermöglicht eine schnelle Screening von Proben und Analyse der mutierten Bibliotheken und vereinfacht kinetische Experimente, die die Ansammlung von Polypen im Laufe der Zeit zu messen. Wir haben bewiesen, dass das Protokoll effektiv auf Vertreter der drei verschiedene Stämme funktioniert: Proteobakterien, Firmicuten, und Actinobacteria, sind berüchtigt für ihre robust und schwer zu lösen Sie Zellwände49.

Nachweis von Polypen durch Vergärung mit ScPPX ist spezifischer und empfindlicher als Fluoreszenz-Detektion mit DAPI und ist billiger und technisch unkompliziert als Umwandlung von Polypen zu ATP mit PPK. Obwohl ScPPX von DNA und RNA12gehemmt wird, haben wir dies überwinden, mit einem sehr großen Überschuss des Enzyms (1 µg pro Probe), komplette Verdauung auch in Bakterien, enthält mehr als 6.000 Nmol PolyP mg-1 Protein29zu erreichen. Anderen veröffentlichten Methoden Gebrauch 10 bis 15 ng von ScPPX pro Reaktion12,24. Unser Protokoll zur ScPPX Reinigung ergibt in der Regel mehr als 5 mg reines ScPPX pro Liter Überexpression Kultur, das reicht für mehr als 5.000 Assays. Wir haben festgestellt, dass mehrere unterschiedliche Protokolle für Nickel-Affinität Reinigung des His-Tags Proteine funktionieren gut in ScPPX überexprimiert von pScPPX2 zu reinigen (Daten nicht gezeigt), und es gibt eine Vielzahl solcher Protokolle zur Verfügung Labors mit unterschiedlichen technische Kapazitäten.

Frühere Protokolle mit ScPPX Verdauung für die Erkennung von Polypen Vertrauen oft auf Malachit Grün-basierte farbmetrischen Assays, freie Phosphat6,12zu quantifizieren. Diese Tests sind empfindlich, aber in der Regel werden sorgfältig zeitlich aufeinanderfolgende Zugabe von zwei oder drei separaten Reagenzien, genaue Messungen24,50,51zu machen. Die Ascorbinsäure-basierte Detektionssystem verwendet hier24 hat eine breitere linearen Bereich der Erkennung als Malachitgrün ohne Verlust der Sensibilität, betrifft nur die Zugabe von einem einzigen Reagens und erfordert keine präzise Zeitmessung.

Es gibt mehrere Schritte, die entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls sind. Erste, bakterielle Proben sollte sofort nach der Ernte in GITC lysiert werden, um sicherzustellen, dass Polypen Ebenen nicht nach dem Zeitpunkt der Probenahme ändern und zelluläre Phosphatasen rasch inaktivieren. Zweitens nicht GITC Lysates bei 95 ° C für mehr als 10 min inkubieren, und speichern Sie sie sofort danach bei-80 ° C möglich PolyP Hydrolyse zu minimieren. Drittens: Seien Sie vorsichtig beim Pipettieren der Proben in 96-Well-Platten für Protein oder Phosphat Messungen nicht zu spritzen oder Tropfen alles von eine Probe in ein anderes. Die farbmetrischen Assays, besonders für Phosphat, sind sehr empfindlich, und geringe Mengen an Verunreinigungen können die Ergebnisse stark verzerren. Schließlich haben einige Reagenzien, die in diesem Protokoll (d. h. ScPPX, Angriffsermittlungslösung) Haltbarkeit begrenzt. Frische ScPPX vorbereiten, alle 6 Monate und frisch Angriffsermittlungslösung jeden Monat.

Eine Einschränkung unserer Methode ist, dass Kieselsäure Spalten nicht PolyP weniger als 60 Phosphat Einheiten lange sehr gut12,14,15 binden. Obwohl Bakterien in der Regel meist langkettigen PolyP3synthetisieren, empfehlen wir Vorversuchen mit Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese27,30 Kettenlänge in einem bestimmten Bakterienarten vor der Verwendung zu bewerten Unser Verfahren. Für Arten wo kurzkettige PolyP einen wesentlichen Teil der PolyP Pool macht, unser Protokoll eignet sich nicht und wir empfehlen Polypen zu kassieren, indem eine andere Methode (z.B. Phenol-Chloroform Extraktion12), und würde auch empfehlen zur Ergänzung der ScPPX Verdauung mit handelsüblichen S. Cereviseae hat Pyrophosphatase (PPA1)24, da ScPPX nicht Pyrophosphat13 und dies verdauen wird eine proportional größere Wirkung auf Messungen der kürzere Kette PolyP. Als Alternative zu ScPPX saure Hydrolyse38 Hydrolyseneigung Polypen um Phosphat frei verwendet werden könnten, aber dazu müssten zusätzliche DNase, RNase und Reinigung Schritte um sicherzustellen, dass nur Polypen abgeleitet Phosphat gemessen wurde. In einigen Fällen ist es möglicherweise sinnvoll, eine alternative Methode zu verwenden, um zu testen, ob die Effizienz der PolyP Extraktion mit GITC zwischen Stämmen oder Bedingungen, insbesondere mit Bakterien bekannt variiert, Dicke Zellwände wie Mykobakterien haben. Wenn Polypen unterhalb der Nachweisgrenze des Assays für Studien einer bestimmten Art wichtig sind, kann es sein erforderlich, verwenden Sie eine verschiedene Erkennung Schema, wie die Verwendung von PPK umzuwandeln PolyP in ATP, die extrem sensibel mit nachgewiesen werden können handelsübliche Luciferase basierende Assays14,17,18.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Dieses Projekt wurde von der University of Alabama bei Birmingham Institut für Mikrobiologie Start Fonds und NIH Grant R35GM124590 (MJG) und NIH Grant R01AI121364 (FW) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 143 Polyphosphat Stress-Reaktion Exopolyphosphatase Gram-negativen Bakterien grampositive Bakterien Mykobakterien
Prüfung für anorganisches Polyphosphat in Bakterien
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Pokhrel, A., Lingo, J. C.,… More

Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).

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