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Immunology and Infection

Ensayando para el polifosfato inorgánico en bacterias

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58818
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Summary

Describimos un método simple para la rápida cuantificación de polifosfato inorgánico en diversas bacterias, incluyendo especies gramnegativas, grampositivas y micobacterias.

Abstract

Polifosfato inorgánico (pólipo) es un polímero biológico encontrado en las células de todos los dominios de la vida y es necesaria para la virulencia y la respuesta de estrés en muchas bacterias. Hay una gran variedad de métodos para la cuantificación polyP en materiales biológicos, muchos de los cuales son mano de obra intensiva o insensible, limitando su utilidad. Aquí presentamos un método optimizado para la cuantificación de pólipo en bacterias, usando una extracción de columna de membrana de silicona optimizada para el procesamiento rápido de múltiples muestras, digestión de pólipo con el específico de pólipo exopolyphosphatase ScPPX y detección de la fosfato libre resultante con un sensible análisis colorimétrico basado en ácido ascórbico. Este procedimiento es sencillo, barato y permite la cuantificación confiable de pólipo en diversas especies bacterianas. Se presenta la cuantificación de pólipo representativo de la bacteria gram-negativa (Escherichia coli), la bacteria del ácido láctico Gram-positivas (Lactobacillus reuteri) y las especies de micobacterias (Mycobacterium smegmatis). También incluimos un protocolo simple para la purificación de la afinidad del níquel de cantidades de mg de ScPPX, que no está actualmente disponible en el mercado.

Introduction

Polifosfato inorgánico (pólipo) es un biopolímero lineal de unidades de fosfato phosphoanhydride-ligado que se encuentra en todos los ámbitos de la vida1,2,3. En diversas bacterias, pólipo es esencial para la respuesta de estrés, motilidad, formación de biopelículas, control del ciclo celular, resistencia antibiótica y virulencia4,5,6,7,8 ,9,10,11. Estudios de metabolismo del polyP en bacterias por lo tanto tienen el potencial para producir penetraciones fundamentales en la capacidad de las bacterias que causan enfermedad y prosperan en ambientes diversos. En muchos casos, sin embargo, los métodos disponibles para cuantificación de pólipo en las células bacterianas son un factor limitante en estos estudios.

Hay varios métodos usados actualmente para medir los niveles de pólipo en materiales biológicos. Estos métodos generalmente involucran dos pasos distintos: extracción de pólipos y cuantificar el pólipo presentes en esos extractos. El método estándar de oro actual, desarrollado para la levadura Saccharomyces cerevisiae por Bru y colaboradores12, pólipo extractos junto con ADN y ARN con fenol y cloroformo, seguido por la precipitación del etanol, el tratamiento con Desoxirribonucleasa (DNasa) y ribonucleasa (Rnasa) y digestión del pólipo purificado resultante con la S. cerevisiae degradantes pólipo enzima exopolyphosphatase (ScPPX)13 fosfato libre, que luego se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico basados en verde malaquita. Este procedimiento es altamente cuantitativa pero que requieren mucho trabajo, limitar el número de muestras que puede procesar en un solo experimento y no está optimizado para las muestras bacterianas. Otras personas han reportado extracción de pólipo de una variedad de células y tejidos utilizando granos de sílice "(glassmilk del) o silicona membrana columnas6,14,15,16,17, 18. Estos métodos no extraer eficientemente pólipo (menos de 60 unidades de fosfato) de cadena corta12,14,15, aunque esto está de menos preocupación por las bacterias, que generalmente se cree que sintetizan principalmente Pólipo de cadena larga3. Los métodos antiguos de extracción de pólipo usando ácidos fuertes19,20 se ya no utilizan, ya que el pólipo es inestable bajo condiciones ácidas12.

También hay una variedad de métodos reportados para la cuantificación del pólipo. Entre las más comunes es 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), un colorante fluorescente más típicamente usado para teñir ADN. Complejos de DAPI-pólipo tienen maxima de excitación y de emisión de fluorescencia diferentes a DAPI-ADN complejos21,22, pero hay considerable interferencia de otros componentes celulares, incluyendo el ARN, nucleótidos y inositol los fosfatos12,15,16,23, reducción de la especificidad y sensibilidad de las mediciones de pólipo realizadas con este método. Alternativamente, se pueden convertir en trifosfato de adenosina (ATP) mediante purificada Escherichia coli pólipo y Adenosín difosfato (ADP) cinasa de pólipo (PPK) y el ATP resultante cuantificadas usando luciferasa14,17 ,18. Esto permite la detección de cantidades muy pequeñas de pólipo, pero requiere dos pasos de la reacción enzimática y luciferin y ADP muy puro, que son reactivos caros. ScPPX específicamente resúmenes de pólipo de fosfato libre6,12,13,24, que pueden detectarse mediante métodos más simple, pero ScPPX es inhibida por el DNA y el RNA12, necesidad tratamiento de DNasa y Rnasa de pólipo que contiene extractos. Ni PPK ni ScPPX están comercialmente disponibles, y purificación de PPK es relativamente complejo25,26.

Pólipo en lysates de la célula o extractos también puede ser visualizado en geles de poliacrilamida por negativo27,28,29,30, un método que permite la evaluación de la longitud de la cadena, pero es la coloración de DAPI bajo rendimiento y mal cuantitativa.

Ahora divulgamos un ensayo rápido, barato, medio rendimiento pólipo que permite la cuantificación rápida de pólipo niveles en diversas especies bacterianas. Este método comienza por lisis de las células bacterianas a 95 ° C de (GITC) el isotiocianato de guanidina 4 M14 para inactivar fosfatasas celulares, seguidas por una extracción de columna de membrana de sílice optimizada para el procesamiento rápido de múltiples muestras. El extracto que contiene el pólipo resultante luego se digiere con un exceso de ScPPX, eliminando la necesidad para el tratamiento de DNasa y Rnasa. Incluimos un protocolo para la purificación de afinidad níquel directa de cantidades de mg de ScPPX. Finalmente, derivado de pólipo libre fosfato es cuantificado con un ensayo colorimétrico simple, sensible, basada en el ácido ascórbico24 y normalizado a la proteína celular total. Este método optimiza la medición del polyP en células bacterianas, y demostrar su uso con especies representativas de las bacterias Gram negativas, bacterias Gram-positivas y micobacterias.

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Protocol

1. purificación de levadura Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Transformar la tensión de sobreexpresión de proteína de e. coli BL21(DE3)31 con el plásmido pScPPX26 por electroporación32 o33de la transformación química.
  2. Inocular 1 L de caldo de lisogenia (LB) que contiene 100 ampicilina de μg mL-1 en un matraz de 2 L unbaffled con una sola Colonia de BL21(DE3) que contienen pScPPX2 e incubar durante la noche a 37 ° C sin agitación, a una absorbancia de 600 nm (un600) de aproximadamente 0.3, medido en un espectrofotómetro.
  3. Iniciar la cultura de agitación (180 rpm) e incubar durante 30 min a 37 ° C, tiempo durante el cual las células se crecen a un A600 de 0.4 - 0.5.
  4. Añadir isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM y un adicional 100 μg mL-1 ampicilina, luego incubar durante 4 h a 37 ° C con agitación a 180 rpm.
    Nota: Este protocolo de sobre-expresión genera una gran cantidad de ScPPX soluble. Sin embargo, la sobreexpresión de ScPPX es muy indulgente, y se han utilizado una variedad de otros protocolos comunes de la sobreexpresión de la proteína a purificar con éxito ScPPX.
  5. Transferir las células a una botella de centrífuga de 1 L y cosecha por centrifugación durante 20 minutos a 5000 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante y transferir el precipitado de células a un tubo cónico de 50 mL.
    Nota: Gránulos de la célula pueden almacenarse indefinidamente a-80 ° C.
  6. Descongelar la pelotilla en el hielo, luego resuspender en 9 mL de 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl e imidazol 5 mM (pH 8) para un volumen total de aproximadamente 10 mL.
  7. Añadir lisozima de (concentraciones finales) 1 mg mL-1 , 2 mM de MgCl2y 50 unidades mL-1 de una endonucleasa de degradación de RNA y DNA (véase Tabla de materiales) e incubar por 30 min en hielo.
    Nota: ScPPX se une a los ácidos nucleicos (datos no mostrados), por tratamiento de nucleasa es esencial durante la purificación.
  8. Utilizando un sonicador con una micropunta (véase Tabla de materiales), lyse las células por 2 ciclos de sonicación en hielo al 50% de potencia, pulsación 5 s s a y 5, con un descanso de 2 minutos entre los ciclos.
    Nota: Use protección auditiva adecuada durante la sonicación. Igualmente para el caso de sobreexpresión, una variedad de métodos de lisis de células son aceptables para la purificación del ScPPX.
  9. Eliminar la suciedad insoluble por centrifugación el lisado por 20 min a 20.000 x g a 4 ° C. Filtrar el sobrenadante resultante (aproximadamente 10 mL) a través de un filtro de jeringa de acetato de celulosa de 0,8 μm poro tamaño.
  10. El lisado en cargado de níquel 5 mL quelantes columna de carga (véase Tabla de materiales) usando una bomba peristáltica o una jeringa grande.
  11. Enjuagar la columna con 50 mL de imidazol de 5 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 50 mM (pH 8).
  12. Enjuagar la columna con 50 mL de imidazol de 20 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 50 mM (pH 8).
  13. Responsables ScPPX con 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl e imidazol de 0,5 M (pH 8), que recoge 15 fracciones de 1 mL. Prueba estas fracciones elución para contenido proteínico con la proteína de Bradford ensayo34 (véase Tabla de materiales) y un gel de SDS-PAGE35 para confirmar que fracciones contienen ScPPX purificada (peso molecular = 45 kDa).
  14. Las fracciones que contiene pura ScPPX de la piscina y ajustar la concentración de la proteína combinada sobre 2 mg mL-1 con 50 mM HEPES y 0,5 M de NaCl. Concentraciones más altas de proteínas pueden precipitar en el paso siguiente.
  15. Intercambiar la ScPPX purificada en búfer de almacenamiento (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, glicerol al 10% [v/v]) por diálisis. Combinado ScPPX de fracciones en una longitud sellada de 12.000-14.000 Da peso molecular límite diálisis membrana de la tubería (véase Tabla de materiales) y suspender en 1 L de tampón de almacenamiento con continua agitación a 4 ° C por al menos 4 h. Repita este paso con dulce buffer de almacenamiento para un total de 3 cambios de tampón.
  16. Transferencia de la proteína purificada, dializada, a un tubo de centrífuga o tubos y centrifugar durante 20 minutos a 20.000 x g a 4 ° C para eliminar cualquier agregados insolubles. Cuidadosamente transfiera el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mL limpio.
  17. Ajustar la concentración de la ScPPX purificada a 1 mg mL-1 con el tampón para almacenamiento, Añadir 0.1% (p/v) libre de proteasa de seroalbúmina bovina (BSA; concentración final) y almacenar hasta por 6 meses a 4 ° C.
    Nota: ScPPX pierde más del 90% de su actividad cuando es congelado13.

2. recolección de muestras para la extracción de polifosfato

  1. Crecen las bacterias en las condiciones de interés para la determinación de contenido de pólipo. De este protocolo, cultivar Lactobacillus reuteri36 durante la noche a 37 ° C sin agitación en medio de inducción (MEI) de enzima málico37 sin cisteína (MEI-C).
  2. Suficientes células por centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a 50 – 100 μg de proteína celular total de la cosecha (véase paso 3 más abajo). Para e. coli, se trata de 1 mL de una cultura de la fase de registro en un A600 de 0.2 - 0.4. De L. reuteri, esto es 1 mL de un cultivo durante la noche. Ajustar según sea necesario para otras especies de interés.
  3. Eliminar completamente el sobrenadante de los gránulos de la célula.
  4. Resuspender el pellet celular en 250 μl de tampón de lisis GITC (isotiocianato de guanidina de 4 M, 50 mM Tris-HCl, pH 7) y lyse por incubación a 95 ° C durante 10 minutos lisados tienda a-80 ° C.
    Nota: Ser coherente con el tiempo de lisis, ya que la incubación prolongada a altas temperaturas puede causar degradación del pólipo por hidrólisis38. Lisados pueden almacenarse indefinidamente a-80 ° C.
    PRECAUCIÓN: Isotiocianato de guanidina es una sal caotrópico y debe ser manejado con guantes y desechado como residuos peligrosos.

3. el contenido de proteína de Lysates de la célula de medición

  1. Preparar normas de BSA que contiene 0, 0.1, 0.2 y 0.4 mg mL-1 de BSA en tampón de lisis GITC.
    Nota: Es importante que los estándares de la BSA en GITC, desde GITC influye en el desarrollo del color del ensayo de Bradford. Normas de la BSA pueden almacenarse indefinidamente a-20 ° C.
  2. Alícuota y 5 μl de lisados de células descongeladas, bien mezclado y de las normas de la BSA para separar pozos de una placa de 96 pocillos claro.
  3. Añadir 195 μl de reactivo de Bradford34 a cada pozo y medir la absorbancia a 595 nm (un595) en un lector de placas (véase Tabla de materiales).
  4. Calcular la cantidad de proteína en cada pozo por comparación con la curva estándar de BSA, usando la fórmula y = mx + b, donde y es un595, x es μg de BSA, m es la pendiente de la curva estándar, y b es la intersección de la curva estándar. Multiplicar el valor resultante por 0.05 para determinar el mg total de proteína en cada muestra.

4. extracción de polifosfato

  1. Añadir 250 μl de etanol al 95% para cada muestra lisada GITC y vortex para mezclar.
  2. Esa mezcla se aplican a una columna de spin de membrana de silicona y centrifugar durante 30 s a 16.100 x g.
  3. Deseche el flujo a través, luego agregar 750 μl de 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% de etanol y centrifugar por 30 s a 16.100 x g.
  4. Deseche el flujo y centrifugar durante 2 min a 16.100 x g.
  5. Colocar la columna en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL y agregar 150 μL de 50 mM Tris-HCl (pH 8).
  6. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego eluir pólipo por centrifugación durante 2 min a 8.000 x g.
    Nota: Si lo desea, los eluatos pueden almacenarse a-20 ° C durante al menos 1 semana.

5. digerir polifosfato

  1. Preparar estándares que contienen 0, 5, 50 o fosfato de potasio de 200 μm en 50 mM Tris-HCl (pH 8).
    Nota: Normas de fosfato de potasio pueden almacenarse indefinidamente a temperatura ambiente.
  2. Alícuotas de 100 μl de cada fosfato estándar y extrae muestras de pólipo en pocillos distintos de una placa de 96 pocillos claro.
  3. Preparar una mezcla maestra que contiene (por muestra): 30 μl de 5 x ScPPX reacción buffer (100 mM Tris-HCl 25 mM MgCl2acetato de amonio 250 mM, pH 7,5)1319 μl de H2O y 1 μl de ScPPX purificada (1 mg mL-1).
  4. Añadir 50 μl de la master mix a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Incubar por 15 min a 37 ° C.
    Nota: Si lo desea, las muestras digeridas pólipo pueden almacenarse a-20 ° C indefinidamente.

6. detección de fosfato libre24

  1. Preparar solución de detección de base disolviendo 0,185 g de tartrato de antimonio y potasio en 200 mL de agua, agregar 150 mL de 4 N H2hasta4, entonces agregando 1,49 g de heptamolibdato de amonio. Revuelva para disolver y luego llevar a un volumen final de 456 mL. Filtrar la solución para eliminar partículas y almacenar protegido de la luz a 4 ° C durante 1 mes.
  2. Prepare una solución de ácido ascórbico de 1 M. Almacenar protegido de la luz a 4 ° C durante 1 mes.
  3. Preparar una acción de trabajo fresca de solución de detección cada día mezclando 9,12 mL de solución de detección de base con 0,88 mL de ácido ascórbico de 1 M. Deje que la solución de detección llegue a temperatura ambiente antes de usar.
  4. Añadir 50 μl de solución de detección para cada muestra y el patrón en la placa de 96 pocillos e incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 minutos permitir el desarrollo del color.
  5. Medir la absorbancia a 882 nm con un lector de placas y calcular la concentración de fosfato de cada muestra en comparación a la curva estándar de fosfato de potasio.
    PRECAUCIÓN: La solución de detección contiene ácidos fuertes y sales tóxicas. Utilice guantes y tratar el exceso de solución como residuos tóxicos.

7. calcular el contenido celular de polifosfato

  1. Convertir las concentraciones de fosfato en paso 6.5 nanomoles de fosfato derivado de pólipo en cada célula entera lisado según la siguiente fórmula:
    Pólipo de nmol = 1.5 x (fosfato de μm / 10)
    Nota: El método basado en la curva estándar en el paso 6 determina la concentración de fosfato (en μm) en cada 100 μl de muestra pólipo alícuotas en el paso 5.2. Para convertir esta concentración en un número de nmol, 100 μl se divide por 106 para dar un volumen en L, multiplicado por la concentración (μmol L-1), a continuación, multiplicado por 1.000 (el número de nmol en un μmol). Esto reduce a dividiendo la concentración por 10. El volumen total del extracto preparado en el paso 4 es 150 μL, por lo que es necesario multiplicar el valor resultante por 1,5 para calcular la nmol de fosfato presente en el extracto entero.
  2. Normalizar el contenido celular del pólipo a la proteína celular total dividiendo el pólipo nmol por el mg de proteína total en cada muestra se determinó en el paso 3.4. Niveles de pólipo se expresan en términos de la concentración de fosfato libre derivados de pólipos individual.
    Nota: En algunos casos, la cantidad de derivados de pólipo fosfato presente en una muestra puede caer fuera del rango lineal de la curva estándar de fosfato (paso 6.5). Si los niveles de pólipo están muy altos, el efluente que contiene el pólipo exceso de paso 4.6 puede ser diluido 1:10 o 1: 100, según sea necesario y luego mide otra vez como se describe en los pasos 5 a 7.

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Representative Results

Los pasos del Protocolo se muestra un diagrama en forma simplificada en la figura 1.

Para demostrar el uso de este protocolo con bacterias Gram-negativas, tipo salvaje de e. coli MG165539 fue crecido en fase logarítmica media en rico medio LB a 37 ° C con agitación (200 rpm), luego enjuagar e incubado por un adicional 2 h en morpholinopropanesulfonate-buffered (MOPS) mínimo medio40 que contiene 4 g L-1 de glucosa y 0,1 mM K2HPO4, una condición conocida para inducir la producción de pólipo14,29. Como se muestra en la figura 2A, no se detectaron ningún pólipo de tipo salvaje de e. coli crecido en LB y 192 ± 14 (media ± desviación estándar [SD]) nmol pólipo mg-1 proteína total en fregonas, consistentes con informes anteriores14,29 . Como era de esperar, un ∆ppk mutante6, que no tiene pólipos quinasa41, no producido ningún pólipo en cualquier medio, un ∆ppx mutante6, que carece de exopolyphosphatase42, produce aproximadamente la misma cantidad de Pólipo como el tipo salvaje y un ∆phoB mutante29, que tiene un defecto en el transporte de fosfato, produjeron significativamente menos pólipo que el tipo salvaje14,29,43.

Para demostrar el uso de este protocolo con bacterias Gram-positivas, tipo L. reuteri ATCC PTA 647536 y un mutante nulo isogénicas ppk1 falta kinase de pólipo, construido con oligo-dirigido recombineering44, fueron crecido durante la noche en MEI-C a 37 ° C sin agitación. Como se muestra en la figura 2B, el salvaje-tipo acumulados 51 ± 6 nmol pólipo mg-1 proteína total bajo estas condiciones, mientras que el mutante ppk1 contenía menos de la mitad de esta cantidad. L. reuteri contiene una segunda cinasa de pólipo, codificada por el ppk2 gen45, que probablemente representa el pólipo en el mutante nulo ppk1 .

Para demostrar el uso de este protocolo con micobacterias, Mycobacterium smegmatis cepa SMR546 se cultivaba a fase media logarítmica en medio Hartmans de Bont (HdB)47, luego enjuagados y diluida cinco veces en HdB o HdB con 2% de etanol. Estas culturas fueron luego se incubaron durante la noche a 37 ° C con agitación (180 rpm). Como se muestra en la figura 2, en ausencia de etanol, M. smegmatis había acumulado 141 ± 52 nmol pólipo mg-1 proteína total, mientras que el etanol tratamiento dio lugar a un aumento triple a ± 437 102 nmol pólipo mg-1 total de proteína. Este resultado era esperado, ya que el etanol se ha divulgado previamente para elevar niveles de pólipo en M. smegmatis48.

Figure 1
Figura 1: diagrama del procedimiento de extracción y medición de polifosfato. Se ilustran los pasos esenciales del Protocolo de cuantificación de pólipo. Gránulos de la célula bacteriana son lisis a 95 ° C en GITC (isotiocianato de guanidina). Pequeñas alícuotas de los lisados se analizan para contenido de proteína mediante el ensayo de Bradford. Pólipo es extraído utilizando columnas de membrana de silicona y luego digerido con ScPPX. El fosfato libre resultante se cuantifica usando el análisis de ácido ascórbico. Fosfato total derivados del pólipo se normaliza a la proteína total para cada muestra. Un595 = absorbancia a 595 nm. Un882 = absorbancia a 882 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representante resulta con diversas bacterias. (A) ∆ tipo salvaje e isogénicas de e. coli MG1655ppk, ∆ppxy ∆phoB mutantes fueron cultivadas a 37 º C con agitación (200 rpm) a una600 = 0.2 - 0.4 en medio LB Rico (círculos negros) y luego a un medio mínimo (MOPS contiene 4 g L-1 de glucosa y 0,1 mM K2HPO4) por 2 h (círculos de color blanco; n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC PTA 6475 (círculos) y un mutante nulo isogénicas ppk1 (triángulos) fueron cultivadas durante la noche a 37 ° C en medio de MEI-C sin agitación (n = 3, ± SD). (C) M. smegmatis SMR5 se cultivan a 37 ° C con agitación (180 rpm) a una600 = 1 en medio de la HdB (plazas cerradas) o sin (plazas abiertas) 2% de etanol (n = 3, ± SD). Niveles de pólipo se expresan en términos de la concentración de fosfato libre derivados de pólipos individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo descrito aquí simplifica y acelera la cuantificación de los niveles de pólipo en diversas bacterias, con un conjunto típico de 24 muestras tomando aproximadamente 1,5 h a totalmente proceso. Esto permite la detección rápida de muestras y análisis de bibliotecas mutantes y simplifica experimentos cinéticos miden la acumulación de pólipo en el tiempo. Hemos demostrado que el protocolo funcione eficazmente a los representantes de tres filos diferentes: proteobacteria, firmicutes y actinobacteria, que son conocidos por su resistente, difícil de lisar las paredes celulares49.

Detección de pólipos por digestión con ScPPX es más específico y más sensible que la detección de fluorescencia con DAPI y es más barato y técnicamente más sencillo que la conversión de pólipo a ATP con PPK. Aunque ScPPX es inhibida por el DNA y el RNA12, hemos superado esto utilizando un gran exceso de enzima (1 μg por muestra) para lograr la digestión completa incluso en las bacterias que contiene más de 6.000 nmol pólipo mg-1 proteína29. Otros métodos publicados utilice 10 a 15 ng de ScPPX por reacción12,24. Nuestro protocolo para la purificación de ScPPX rinde típicamente más de 5 mg de ScPPX puro por litro de cultura sobreexpresión, que es suficiente para los ensayos de más de 5.000. Hemos encontrado que varios protocolos distintos para la purificación de níquel-afinidad de las proteínas su etiquetado trabajan bien para purificar ScPPX overexpressed de pScPPX2 (datos no mostrados), y hay una amplia variedad de tales protocolos disponibles para laboratorios con diferentes capacidades técnicas.

Protocolos anteriores mediante digestión de ScPPX para la detección de pólipos han confiado a menudo en ensayos colorimétricos basados en verde de Malaquita cuantificar fosfato libre6,12. Estos ensayos son sensibles, pero típicamente requieren cuidadosamente cronometrado adición secuencial de dos o tres reactivos independientes para hacer mediciones precisas24,50,51. El sistema de detección basado en ácido ascórbico utilizado aquí24 tiene una gama más ancha lineal de detección de verde de Malaquita sin pérdida de sensibilidad, sólo implica la adición de un reactivo simple y no requiere precisa tiempo.

Hay varios pasos que son esenciales para el éxito de este protocolo. Las muestras primeras, bacterianas deben lisis en GITC inmediatamente después de la cosecha, para asegurar que los niveles del pólipo no cambian después del tiempo de muestreo y para inactivar rápidamente fosfatasas celulares. En segundo lugar, no incubar GITC lisados a 95 ° C durante más de 10 minutos y almacenarlos inmediatamente luego a-80 ° C para minimizar la hidrólisis posible pólipo. En tercer lugar, tenga cuidado al pipetear las muestras en placas de 96 pocillos para las mediciones de proteína o fosfato no a salpicaduras o goteo desde una muestra a otra. Los ensayos colorimétricos, particularmente para el fosfato, son muy sensibles, y pequeñas cantidades de contaminación fuertemente pueden sesgar los resultados. Finalmente, algunos reactivos utilizados en el presente Protocolo (es decir, ScPPX, solución de detección) tienen una limitada vida útil. Preparar ScPPX fresco cada 6 meses y fresco solución de detección de cada mes.

Una limitación de nuestro método es que columnas de sílice no vinculan a pólipo 60 menos de fosfato unidades largo muy bien12,14,15. Aunque las bacterias sintetizan típicamente sobre todo pólipo de cadena larga3, recomendamos experimentos preliminares usando poliacrilamida gel electroforesis27,30 para evaluar la longitud de la cadena en una determinada especie bacteriana antes de usar nuestro procedimiento. Especies donde constituye una fracción substancial de la piscina de pólipo pólipo de cadena corta, nuestro protocolo no es apropiado y recomendamos extraer el pólipo por un método diferente (por ejemplo, la extracción de fenol-cloroformo12) y también recomendaría que complementa la digestión ScPPX con comercios S. cereviseae pirofosfatasa (PPA1)24, ya que ScPPX no digiere pirofosfato13 y esto tiene un impacto proporcionalmente mayor en medidas de cadena más corta polyP. Como alternativa a ScPPX, hidrólisis ácida38 podría utilizarse para hidrolizar el pólipo para liberar fosfato, pero esto requiere pasos adicionales de DNasa, RNasa y purificación para asegurar que se midió sólo pólipo-derivado fosfato. En algunos casos, puede ser útil utilizar un método alternativo de extracción para comprobar la eficiencia de la extracción de pólipo con GITC varía entre cepas o condiciones, particularmente con las bacterias tienen paredes celulares gruesas, como las micobacterias. Si los niveles del pólipo por debajo del límite de detección de este ensayo son importantes para los estudios de una determinada especie, puede ser necesario utilizar un esquema de detección diferentes, como el uso de PPK para convertir el pólipo en ATP, que puede ser detectado usando extremadamente sensible ensayos disponibles en el mercado de luciferase14,17,18.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este proyecto fue apoyado por la Universidad de Alabama en Birmingham Departamento de Microbiología Inicio fondos y NIH subsidio R35GM124590 (MJG) y NIH subsidio R01AI121364 (FW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000

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References

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Ensayando para el polifosfato inorgánico en bacterias
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Pokhrel, A., Lingo, J. C.,… More

Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).

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