Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Assaying for uorganiske Polyphosphate i bakterier

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58818
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Summary

Vi beskriver en enkel metode for rask kvantifisering av uorganiske polyphosphate i forskjellige bakterier, inkludert Gram-negative Gram-positive og mycobacterial art.

Abstract

Uorganiske polyphosphate (polypp) er en biologisk polymer i celler fra alle livsområder og kreves for virulens og stressrespons i mange bakterier. Det finnes en rekke metoder for å kvantifisere polypp i biologisk materiale, hvorav mange er arbeidskrevende eller ufølsomme, begrenser deres nytten. Vi presenterer her en strømlinjeformet metode for polypp kvantifisering i bakterier, bruker en silica membran kolonnen utvinning optimalisert for rask behandling av flere eksempler, fordøyelsen av polypp med polypp-spesifikke exopolyphosphatase ScPPX og oppdagelsen av den resulterende gratis fosfat med en følsom askorbinsyre-baserte kolorimetrisk analysen. Denne fremgangsmåten er enkel, billig, og gir pålitelig polypp kvantifisering i ulike bakterie-art. Vi presenterer representant polypp kvantifisering Gram-negative bakterien (Escherichia coli), Gram-positive melkesyre bakterien (Lactobacillus reuteri) og den mycobacterial arten (Mycobacterium smegmatis). Vi har også en enkel protokoll for nikkel affinitet rensing av mg mengder ScPPX, som er ikke kommersielt tilgjengelig.

Introduction

Uorganiske polyphosphate (polypp) er en lineær Research phosphoanhydride knyttet fosfat enheter som finnes i alle domener livet1,2,3. I ulike bakterier er polypp avgjørende for stressrespons, motilitet, biofilm formasjon, celle målesyklus, antibiotikaresistens og virulens4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studier av polypp metabolismen i bakterier derfor har potensial til å gi grunnleggende innsikt i evnen av bakterier forårsaker sykdommen og trives i ulike miljøer. I mange tilfeller er imidlertid metodene tilgjengelig for kvantifisere polypp i bakterieceller en begrensende faktor i disse studiene.

Det finnes flere metoder som brukes til å måle polypp nivåer i biologisk materiale. Disse metodene omfatter vanligvis to forskjellige trinn: utpakking polypp og kvantifisere polyP stede i disse ekstrakter. Den gjeldende gull standard metode, utviklet for gjær Saccharomyces cerevisiae med Bru og kolleger12ekstrakter polypp DNA og RNA med fenol og kloroform, etterfulgt av etanol nedbør, behandling med deoxyribonuclease (DNase) og ribonuclease (RNase), og fordøyelsen av resulterende renset polyP med S. cerevisiae polypp-nedverdigende enzymet exopolyphosphatase (ScPPX)13 å gi gratis fosfat, som er deretter kvantifisert ved hjelp av en malakitt grønn-baserte kolorimetrisk analysen. Denne fremgangsmåten er svært kvantitative men arbeidskrevende, begrense antall eksempler som kan behandles i ett enkelt eksperiment, og er ikke optimalisert for bakteriell prøver. Andre har rapportert utpakking polypp fra en rekke celler og vev silica perler ("glassmilk") eller silica membran kolonner6,14,15,16,17, 18. Disse metodene ikke effektivt pakke ut korte kjeden polypp (mindre enn 60 fosfat enheter)12,14,15, men dette er mindre bekymring for bakterier, som er vanligvis antatt å syntetisere primært langkjedede polypp3. Eldre metoder polypp ekstraksjon med sterke syrer19,20 er ikke lenger utbredt, siden polypp er ustabile under Sure forhold12.

Det er også en rekke rapporterte metoder for å kvantifisere polypp. Blant de vanligste er 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), en fluorescerende farge flere vanligvis brukes stain DNA. DAPI-polypp komplekser har forskjellige fluorescens eksitasjon og utslipp maxima enn DAPI-DNA komplekser21,22, men det er betydelige forstyrrelser fra andre cellulære komponenter, inkludert RNA, nukleotider og inositol fosfater12,15,16,23, redusere spesifisitet og følsomhet av polypp målinger med denne metoden. Alternativt polypp og adenosindifosfat (ADP) kan konverteres til adenosin trifosfat (ATP) bruker renset Escherichia coli polypp kinase (PPK) og resulterende ATP kvantifisert bruk luciferase14,17 ,18. Dette gjør påvisning av svært små mengder polypp, men krever to enzymatiske reaksjonen trinn og både luciferin og svært ren ADP, som er dyre reagenser. ScPPX spesielt fordøyer polypp i gratis fosfat6,12,13,24, som kan oppdages ved hjelp av enklere metoder, men ScPPX er hemmet av DNA og RNA12, nødvendiggjør DNase og RNase behandling av polypp inneholder ekstrakter. PPK verken ScPPX er kommersielt tilgjengelige PPK rensing er relativt komplisert25,26.

Polypp i celle lysates eller ekstrakter kan også visualiseres på polyakrylamid gels DAPI negative flekker27,28,29,30, en metode som tillater vurdering av chain lengden, men er lav gjennomstrømming og dårlig kvantitative.

Vi nå rapporterer om en rask, billig, medium gjennomstrømming polypp analysen som tillater rask kvantifisering av polypp nivåer i ulike bakterie-art. Denne metoden starter ved lysing bakterieceller 95 ° c i 4 M guanidine isothiocyanate (GITC)14 for å deaktivere mobilnettet phosphatases, etterfulgt av en silica membran kolonnen utvinning optimalisert for rask behandling av flere eksempler. Den resulterende polypp inneholder ekstrakt er deretter fordøyd med en stor overskudd av ScPPX, eliminerer behovet for DNase og RNase. Vi inkluderer en protokoll for enkel nikkel affinitet rensing av mg mengder ScPPX. Endelig er polypp-avledet gratis fosfat kvantifisert med en enkel, følsom, askorbinsyre-baserte kolorimetrisk analysen24 og normalisert totale mobilnettet protein. Denne metoden strømlinjeformer måling av polypp i bakterielle celler, og vi viser bruken med representant arter av Gram-negative bakterier, Gram-positive bakteriene og mykobakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. rensende gjær Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Forandre E. coli protein overuttrykte belastningen BL21(DE3)31 med plasmider pScPPX26 electroporation32 eller kjemisk forandring33.
  2. Vaksinere 1 L lysogeny kjøttkraft (LB) som inneholder 100 µg mL-1 ampicillin i en 2 L unbaffled bolle med en enkelt koloni av BL21(DE3) som inneholder pScPPX2 og Inkuber overnatting på 37 ° C uten riste, til en absorbans ved 600 nm (en600) av ca 0.3, målt i et spektrofotometer.
  3. Start kulturen risting (180 rpm) og ruge i 30 min ved 37 ° C, hvor cellene vokse til en A600 av 0.4 - 0,5.
  4. Legg isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til en siste konsentrasjon av 1 mM og en ekstra 100 µg mL-1 ampicillin, så ruge 4 h på 37 ° C med skjelvende på 180 rpm.
    Merk: Denne overuttrykte protokollen genererer mye løselig ScPPX. Men ScPPX overuttrykte er svært tilgivende, og en rekke andre vanlige protein overuttrykte protokoller har blitt brukt med hell rense ScPPX.
  5. Overføre cellene til en 1 L sentrifuge flaske og høste dem av sentrifugering for 20 min 5000 x g på 4 ° C. Fjern nedbryting og overføre celle pellets til en 50 mL konisk rør.
    Merk: Cellen pellets kan lagres på ubestemt tid på-80 ° C.
  6. Tine pellet på is, så resuspend det i 9 mL av 50 mM HEPES og 0,5 M NaCl 5 mM imidazole (pH 8) for et totalt volum på ca 10 mL.
  7. (Siste konsentrasjoner) 1 mg mL-1 lysozyme, 2 mM MgCl2og 50 enheter mL-1 i en RNA og DNA-nedverdigende endonuclease (se Tabell for materiale) og Inkuber i 30 min på is.
    Merk: ScPPX binder nucleic syrer (data ikke vist), så nuclease behandling er viktig under renselsen.
  8. En sonicator med en microtip (se Tabell for materiale), lyse cellene av 2 sykluser av sonication på isen over 50% makt, pulserende 5 s på og 5 s, med 2 min hvile mellom sykluser.
    Merk: Bruk passende hørselsvern under sonication. Tilsvarende saken med overuttrykte en rekke celle lysis metoder er akseptable for ScPPX rensing.
  9. Fjerne uløselig rester av sentrifugering den lysate etter 20 min på 20.000 x g på 4 ° C. Filtrere resulterende nedbryting (ca 10 mL) gjennom en 0,8 µm pore størrelse celluloseacetat sprøyte filter.
  10. Laste inn lysate på en nikkel-ladet 5 mL chelaterande kolonne (se Tabell for materiale) en peristaltiske pumpe eller en stor sprøyte.
  11. Skyll kolonnen med 50 mL av 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazole (pH 8).
  12. Skyll kolonnen med 50 mL av 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazole (pH 8).
  13. Elute ScPPX med 50 mM HEPES og 0,5 M NaCl 0,5 M imidazole (pH 8), samle 15 1-mL fraksjoner. Teste disse elueringsrør fraksjoner for proteininnhold med Bradford protein analysen34 (se Tabell for materiale) og kjøre en SDS side gel35 for å bekrefte hvilke fraksjoner inneholder renset ScPPX (molekylvekt = 45 kDa).
  14. Basseng fraksjoner som inneholder rent ScPPX og justerer konsentrasjonen av grupperte protein om 2 mg mL-1 med 50 mM HEPES og 0,5 M NaCl. Høyere protein konsentrasjoner kan utløse i neste trinn.
  15. Utveksle renset ScPPX i lagring buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, 10% [v/v] glyserol) av dialyse. Plassere grupperte ScPPX brøker i en forseglet lengde på 12.000-14.000 Da molekylvekt cutoff dialyse membran rør (se Tabell for materiale) og avbryte 1 L lagring buffer med kontinuerlig stirring på 4 ° C for minst 4 h. Gjenta dette trinnet med friske lagring buffer for totalt 3 buffer endringer.
  16. Overføre renset, dialyzed protein til en sentrifuge rør eller rør og sentrifuge for 20 min 20.000 x g på 4 ° C fjerne alle uløselig aggregat. Nøye overføre nedbryting til en ren 15 mL konisk rør.
  17. Justere konsentrasjonen av det renset ScPPX til 1 mg mL-1 med lagring buffer, legge til 0,1% (w/v) protease-fri bovin serum albumin (BSA, siste konsentrasjon), og butikken for inntil 6 måneder på 4 ° C.
    Merk: ScPPX mister mer enn 90% av sin aktivitet når den er frosset13.

2. høsting prøver for Polyphosphate utvinning

  1. Vokse bakterier under forhold rundt for å bestemme polypp innhold. For denne protokollen, kan du vokse Lactobacillus reuteri36 overnatting på 37 ° C uten risting i malic enzym induksjon (MEI) middels37 uten cystein (MEI-C).
  2. Høste nok celler med sentrifugering i en 1,5 mL microcentrifuge tube til totalt 50-100 µg mobilnettet protein (se trinn 3 nedenfor). For E. colier 1 mL av en logg fase kultur på en A600 av 0,2 - 0,4. For L. reuterier 1 mL av en over natten kultur. Juster etter behov for andre arter av interesse.
  3. Fjerne nedbryting fra cellen pellets.
  4. Resuspend celle pellets i 250 µL av GITC lyseringsbuffer (4 M guanidine isothiocyanate, 50 mM Tris-HCl, pH 7) og lyse av inkubasjon ved 95 ° C i 10 min. Store lysates på-80 ° C.
    Merk: Være konsekvent med lyseringstid, siden utvidet inkubasjon ved høy temperatur kan føre nedbrytning av polypp ved hydrolyse38. Lysates kan lagres på ubestemt tid på-80 ° C.
    FORSIKTIG: Guanidine isothiocyanate er et chaotropic salt bør være håndteres med hansker og avhendes som spesialavfall.

3. måle proteininnholdet i cellen Lysates

  1. Forberede BSA standarder som inneholder 0, 0,1, 0,2 og 0,4 mg mL-1 av BSA i GITC lyseringsbuffer.
    Merk: Det er viktig å gjøre BSA standarder i GITC, siden GITC påvirker farge utviklingen av Bradford analysen. BSA standarder kan lagres på ubestemt tid på 20 ° C.
  2. Aliquot 5 µL av tinte cellen til godt blandet lysates og BSA standarder skille brønner i en klar 96-brønns plate.
  3. Legge til 195 µL av Bradford reagens34 hver brønn og måle absorbans ved 595 nm (en595) i en plate-leser (se Tabell for materiale).
  4. Beregne hvor mye protein i hver brønn ved sammenligning BSA standardkurven, bruke formelen y = mx + b, hvor y er en595, x er µg av BSA, m er stigningstallet til standardkurven og b er y-skjæringspunktet av standardkurve. Multiplisere den resulterende verdien av 0,05 å bestemme den totale mg protein i hver prøve.

4. utdrager Polyphosphate

  1. Legge til 250 µL av 95% etanol hver GITC-lysed eksempel og vortex å blande.
  2. Gjelder at blanding for en silica membran spinn kolonne og sentrifuge for 30 s 16,100 x g.
  3. Forkaste gjennomflytsenhet, og deretter legge 750 µL av 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% etanol og sentrifuge for 30 s 16,100 x g.
  4. Kast gjennomflytsenhet og sentrifuger i 2 minutter på 16,100 x g.
  5. Plasser kolonnen i et rent 1,5 mL microfuge rør og legge 150 µL 50 mm Tris-HCl (pH 8).
  6. Inkuber ved romtemperatur for 5 min, så elute polyP av sentrifugering i 2 minutter på 8000 x g.
    Merk: Hvis du vil, eluates kan lagres på 20 ° C i minst 1 uke.

5. fordøye Polyphosphate

  1. Klargjør standarder som inneholder 0, 5, 50 eller 200 µM kalium fosfat i 50 mM Tris-HCl (pH 8).
    Merk: Kalium fosfat standarder kan lagres på ubestemt tid ved romtemperatur.
  2. Aliquot 100 µL av hver fosfat standard og utdraget polypp prøver i separate brønner av en klar 96-brønns plate.
  3. Forberede en master mix inneholder (per prøve): 30 µL 5 x ScPPX reaksjon buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM ammonium acetate, pH 7.5)13, 19 µL av H2O og 1 µL av renset ScPPX (1 mg mL-1).
  4. Legge til 50 µL av master mix hver brønn av 96-brønns plate. Inkuber i 15 min på 37 ° C.
    Merk: Eventuelt fordøyd polypp prøvene kan lagres på 20 ° C på ubestemt tid.

6. oppdage gratis fosfat24

  1. Klargjør oppdagelsen løsning base ved oppløsning 0.185 g antimon kalium tartrate i 200 mL vann, legge til 150 mL 4 N H2så4, deretter legge 1.49 g ammonium heptamolybdate. Rør for å oppløse og deretter bringe til et endelig antall 456 mL. Filtrere løsningen for å fjerne partikler og lagre beskyttet mot lys i 4 ° C i opptil 1 måned.
  2. Forberede en lager løsning av 1 M askorbinsyre. Lagre beskyttet mot lys i 4 ° C i opptil 1 måned.
  3. Forberede en fersk arbeider lager av gjenkjenning løsning hver dag ved å blande 9,12 mL oppdagelsen løsning base med 0,88 mL 1 M askorbinsyre. Tillate oppdagelsen løsningen å komme til romtemperatur før bruk.
  4. Legge 50 µL av gjenkjenning løsning til hver prøve og standard i 96-brønnen platen og ruge ved romtemperatur i ca 2 minutter å tillate farge utvikling.
  5. Måle absorbans ved 882 nm med en plate leseren og beregne fosfat konsentrasjonen av hvert utvalg sammenligning til kalium fosfat standardkurven.
    FORSIKTIG: Gjenkjenning løsningen inneholder giftige salter og sterke syrer. Bruk hansker og behandle overflødig løsning som giftig avfall.

7. beregning av mobilnettet Polyphosphate innhold

  1. Konverter fosfat-konsentrasjonene som er fastsatt i trinn 6.5 til nanomoles av polypp-avledet fosfat avkortet hele lysate i henhold til følgende formel:
    nmol polypp = 1,5 x (µM fosfat / 10)
    Merk: Standard kurve-basert metode i trinn 6 avgjør konsentrasjonen av fosfat (i µM) i hver 100 µL polypp prøve aliquoted i trinn 5.2. Slik konverterer denne konsentrasjonen til et antall nmol, 100 µL deles på 106 å gi et volum i L, multiplisert med konsentrasjonen (µmol L-1), og deretter multipliseres med 1000 (antall nmol i en µmol). Dette reduserer å dele konsentrasjonen av 10. Totalt ekstrakt volumet i trinn 4 er 150 µL, så det er nødvendig å multiplisere resultatverdien med 1,5 til å beregne nmol av fosfat i hele ekstrakt.
  2. Normalisere mobilnettet polypp innhold totale mobilnettet protein ved å dele nmol polypp mg totale proteinet i hvert utvalg i trinn 3.4. Polypp nivåer er uttrykt i form av konsentrasjonen av enkelte polypp-avledet gratis fosfat.
    Merk: I noen tilfeller hvor mye polypp-avledet fosfat i et utvalg kan falle utenfor lineær rekke fosfat standardkurven (trinn 6.5). Hvis polyP er svært høy, det overskytende polypp inneholder eluate fra trinn 4.6 kan fortynnes 1:10 eller 1: 100, behov og deretter målt igjen som beskrevet i trinn 5 til 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De viktigste trinnene av protokollen er diagrammed i forenklet form i figur 1.

For å demonstrere bruk av denne protokollen med Gram-negative bakterier, vill-type E. coli var MG165539 vokst til midten av Logg fase i LB rik medium på 37 ° C med skjelvende (200 rpm), deretter skylles og ruges i en ekstra 2 timer morpholinopropanesulfonate-bufret (MOPPER) minimal middels40 inneholder 4 g L-1 glukose og 0,1 mM K2HPO4, en tilstand kjent å indusere produksjon av polypp14,29. Som vist i figur 2A, fant vi ingen polypp i vill-type E. coli dyrkes i LB og 192 ± 14 (gjennomsnittlig ± standardavvik [SD]) nmol polypp mg-1 totalt protein i MOPPER, konsekvent med tidligere rapporter14,29 . Som forventet, en ∆ppk mutant6, som mangler polypp kinase41, produsert ingen polypp i enten medium, produsert en ∆ppx mutant6, som mangler exopolyphosphatase42, omtrent samme mengde Polypp som vill-type, og en ∆phoB mutant29, som er defekt i fosfat transport, produsert betydelig mindre polypp enn vill-type14,29,43.

Viser bruk av denne protokollen med Gram-positive bakteriene, vill-type L. reuteri ATCC PTA 647536 og en isogenic ppk1 null mutant mangler polypp kinase, bygget ved hjelp av oligo-rettet recombineering44, var voksen overnatting i MEI-C på 37 ° C uten å riste. Som vist i figur 2B, vill-type akkumulert 51 ± 6 nmol polypp mg-1 totalt protein under disse forholdene, mens ppk1 mutant finnes mindre enn dette beløpet. L. reuteri inneholder en andre polypp kinase, kodet av ppk2 genet45, som antagelig kontoer for polyP presentere i ppk1 null mutant.

Mycobacterium smegmatis belastning SMR546 ble dyrket til midten av Logg fase i Hartmans-de Bont (HdB) middels47, og skylt og utvannet femling i HdB eller HdB med 2% etanol for å demonstrere bruk av denne protokollen med mykobakterier. Disse kulturene ble deretter ruges natten på 37 ° C med skjelvende (180 rpm). Som vist i figur 2C, i fravær av etanol, akkumulert M. smegmatis 141 ± 52 nmol polypp mg-1 totalt protein, mens etanol behandlingen resulterte i en tre-fold økning til 437 ± 102 nmol polypp mg-1 totalt protein. Dette resultatet var ventet, ettersom etanol har tidligere rapportert å heve polypp nivåer i M. smegmatis48.

Figure 1
Figur 1: Diagram av polyphosphate utvinning og måling prosedyren. De vesentlige skritt av polypp kvantifisering protokollen er illustrert. Bakteriell celle pellets er lysed på 95 ° C i GITC (guanidine isothiocyanate). Liten dele lysates er assayed for proteininnhold med Bradford analysen. Polypp trekkes bruker silica membran kolonner og deretter fordøyd med ScPPX. Den resulterende gratis fosfat er kvantifisert bruker askorbinsyre analysen. Totalt polypp-avledet fosfat er normalisert totale protein for hvert utvalg. En595 = absorbans ved 595 nm; En882 = absorbans ved 882 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant resultater med forskjellige bakterier. (A) E. coli MG1655 vill-type og isogenic ∆ppk∆ppxog ∆phoB mutanter var dyrket på 37 ° C med skjelvende (200 rpm) en600 = 0,2 - 0,4 i rike LB medium (svart sirkler) og deretter flyttet til minimal middels (MOPS inneholder 4 g L-1 glukose og 0,1 mM K2HPO4) 2 h (hvite sirkler, n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC PTA 6475 (sirkler) og en isogenic ppk1 null mutant (trekanter) var vokst over natten på 37 ° C i MEI-C medium uten risting (n = 3, ± SD). (C) M. smegmatis SMR5 ble dyrket på 37 ° C med skjelvende (180 rpm) en600 = 1 i HdB medium med (lukkede ruter) eller uten (åpne ruter) 2% etanol (n = 3, ± SD). Polypp nivåer er uttrykt i form av konsentrasjonen av enkelte polypp-avledet gratis fosfat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her forenkler og akselererer kvantifisering av polypp i forskjellige bakterier, med et vanlig sett med 24 prøver tar ca 1,5 t fullt behandle. Dette tillater rask screening av prøver og analyse av mutant biblioteker og forenkler kinetic eksperimenter måle akkumulering av polypp over tid. Vi har vist at protokollen fungerer effektivt på representanter for tre ulike rekker: proteobacteria, firmicutes, og actinobacteria, som er beryktet for sin elastiske, vanskelig å lyse cellevegger49.

Påvisning av polyP av fordøyelse med ScPPX er mer og mer følsom enn fluorescens oppdagelsen med DAPI, og er billigere og mer teknisk grei enn konvertering av polypp til ATP ved hjelp PPK. Selv om ScPPX er hemmet av DNA og RNA12, har vi overvinne dette med en stor overskudd av enzymet (1 µg per prøve) å oppnå komplett fordøyelsen selv i bakterier som inneholder mer enn 6000 nmol polypp mg-1 protein29. Andre publiserte metoder bruk 10 til 15 ng av ScPPX per reaksjon12,24. Våre Protokoll for ScPPX rensing gir vanligvis mer enn 5 mg ren ScPPX per liter overuttrykte kultur, som er nok for mer enn 5000 analyser. Vi har funnet at flere forskjellige protokoller for nikkel-affinitet rensing av hans-merket proteiner fungerer godt for å rense ScPPX overexpressed fra pScPPX2 (data ikke vist), og det er en rekke slike protokoller tilgjengelig for både labs med varierende tekniske kapasitet.

Tidligere protokoller bruker ScPPX fordøyelsen for polypp deteksjon har ofte stolt på malakitt grønn-baserte kolorimetrisk analyser å kvantifisere gratis fosfat6,12. Disse analyser er følsomme, men vanligvis krever nøye timet sekvensiell tillegg av to eller tre separate reagenser å gjøre nøyaktige målinger24,50,51. Askorbinsyre-basert oppdagelsen systemet brukes her24 har en større lineær rekke oppdagelsen enn malakitt grønne uten tap av følsomhet, bare involverer tillegg av en enkelt reagens og ikke krever nøyaktige timing.

Det er flere trinn som er avgjørende for å lykkes i denne protokollen. Første, bakteriell prøver bør være lysed i GITC umiddelbart etter høsting, å sikre at polypp nivåer ikke endrer etter prøvetaking og raskt deaktivere mobilnettet phosphatases. Andre ikke ruge GITC lysates ved 95 ° C i mer enn 10 min, og lagre dem umiddelbart etterpå ved-80 ° C å minimere mulig polypp hydrolyse. Tredje, vær forsiktig når pipettering prøver i 96-brønnen platene for protein eller fosfat mål ikke å plaske eller dryppe alt fra ett utvalg til et annet. Kolorimetrisk analyser, spesielt for fosfat, er meget følsom, og små mengder forurensning kan sterkt forskyve resultatene. Endelig har noen reagenser i denne protokollen (dvs. ScPPX, oppdagelsen løsning) begrenset holdbarhet. Forberede frisk ScPPX hver 6 måneder og frisk oppdagelsen løsning hver måned.

En begrensning av vår metode er at silika kolonner ikke binde polypp mindre enn 60 fosfat enheter lenge godt12,14,15. Selv om bakterier vanligvis syntetisere det meste langkjedede polypp3, anbefaler vi foreløpig eksperimenter ved hjelp av polyakrylamid gel geleelektroforese27,30 å vurdere kjedelengde i bakteriell artene før du bruker Vår fremgangsmåte. For arter der kort-kjeden polypp utgjør en betydelig del av polypp, våre protokollen er ikke riktig og vi anbefaler utpakking polyP av en annen metode (f.eks, fenol-kloroform utvinning12), og vil også anbefale supplere ScPPX fordøyelsen med kommersielt tilgjengelig S. cereviseae har pyrophosphatase (PPA1)24, siden ScPPX ikke fordøye pyrophosphate13 og dette proporsjonalt høyere påvirkning på målinger av kortere-kjeden Polypp. Som et alternativ til ScPPX, acid hydrolyse38 kan brukes til å hydrolyze polypp gratis fosfat, men dette vil kreve DNase, RNase og rensing for å sikre at bare polypp-avledet fosfat var måles. I noen tilfeller kan det være nyttig å bruke en alternativ utvinning metoden for å teste om effektiviteten av polypp ekstraksjon med GITC varierer mellom stammer eller betingelser, spesielt med bakterier har tykke cellen vegger, som mykobakterier. Hvis polyP under grensen for påvisning av denne analysen er viktig for studier av en bestemt art, kan det være nødvendig å bruke en annen oppdagelse plan, som bruker PPK konvertere polypp til ATP, som kan oppdages ved hjelp av svært følsomt kommersielt tilgjengelige luciferase-baserte analyser14,17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble støttet av University of Alabama i Birmingham instituttet for mikrobiologi oppstart midler og NIH grant R35GM124590 (å MJG) og NIH grant R01AI121364 (til FW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  33. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 143 Polyphosphate stressrespons exopolyphosphatase Gram-negative bakterier Gram-positive bakteriene mykobakterier
Assaying for uorganiske Polyphosphate i bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pokhrel, A., Lingo, J. C.,… More

Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter