Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kørsler til uorganiske Polyphosphate i bakterier

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58818
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Summary

Vi beskriver en simpel metode til hurtig kvantificering af uorganiske polyphosphate i forskellige bakterier, herunder gramnegative, Gram-positive og mykobakterielle.

Abstract

Uorganiske polyphosphate (polyP) er en biologisk polymer fundet i celler fra alle områder af livet, og der kræves for virulens og stressrespons i mange bakterier. Der er en række forskellige metoder til at kvantificere polyP i biologiske materialer, hvoraf mange er enten arbejdskrævende eller ufølsom, begrænser deres anvendelighed. Vi præsenterer her en strømlinet metode til polyP kvantificering i bakterier, ved hjælp af en silica membran kolonne udvinding optimeret til hurtig behandling af flere prøver, fordøjelsen af polyP med polyP-specifikke exopolyphosphatase ScPPX og detektion af den resulterende fri phosphat med en følsom ascorbinsyre-baserede kolorimetriske assay. Denne procedure er enkel, billig, og giver mulighed for pålidelige polyP kvantificering i forskellige bakteriearter. Vi præsenterer repræsentative polyP kvantificering af Gram-negative bakterien (Escherichia coli), Gram-positive mælkesyre bakterie (Lactobacillus reuteri) og den mykobakterielle arter (Mycobacterium smegmatis). Vi har også omfatte en enkel protokol for nikkel affinitet rensning af mg mængder af ScPPX, som pt. ikke er kommercielt tilgængelige.

Introduction

Uorganiske polyphosphate (polyP) er en lineær polymer af phosphoanhydride-linked fosfat enheder, der findes i alle områder af livet1,2,3. I forskellige bakterier er polyP afgørende for stressrespons, motilitet, Biofilmdannelse, celle cyklus kontrol, antibiotikaresistens og virulens4,5,6,7,8 ,9,10,11. Undersøgelser af polyP metabolisme i bakterier har derfor potentialet til at give grundlæggende indsigt i evnen af bakterier til at forårsage sygdom og trives i forskellige miljøer. I mange tilfælde, men er metoder til kvantificering polyP i bakterieceller en begrænsende faktor i disse undersøgelser.

Der er flere metoder, der i øjeblikket anvendes til at måle polyP niveauer i biologiske materialer. Disse metoder indebærer typisk to adskilte trin: udvinding polyP og kvantificere polyP til stede i disse uddrag. Den nuværende guld standard metode, udviklet for gær Saccharomyces cerevisiae af Bru og kolleger12, ekstrakter polyP sammen med DNA og RNA ved hjælp af phenol og kloroform, efterfulgt af ethanol udfældning, behandling med deoxyribonuclease (DNase) og ribonuklease (RNase) og fordøjelse af de resulterende renset polyP med S. cerevisiae polyP-nedbrydende enzym exopolyphosphatase (ScPPX)13 at give fri phosphat, som derefter kvantificeres ved hjælp af en Malakit grønt-baserede kolorimetriske assay. Denne procedure er meget kvantitative men arbejdskrævende, begrænsning af antallet af prøver, der kan behandles i en enkelt eksperiment, og ikke er optimeret til bakteriel prøver. Andre har rapporteret udvinding polyP fra en række celler og væv ved hjælp af silica perler ("glassmilk") eller silica membran kolonner6,14,15,16,17, 18. Disse metoder ikke effektivt udtrække kortkædede polyP (mindre end 60 fosfat enheder)12,14,15, selv om dette er af mindre betydning for bakterier, som er generelt menes at syntetisere primært langkædede polyP3. Ældre metoder af polyP udvinding ved hjælp af stærke syrer19,20 er ikke længere almindeligt anvendt, da polyP er ustabil under sure forhold12.

Der er også en række rapporterede metoder til kvantificering polyP. Blandt de mest almindelige er 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), et fluorescerende farvestof mere typisk bruges til at plette DNA. DAPI-polyP komplekser har forskellige fluorescens excitations- og maxima end DAPI-DNA komplekser21,22, men der er en betydelig indblanding fra andre cellulære komponenter, herunder RNA, nukleotider og inositol fosfater12,15,16,23, reducere specificiteten og følsomheden af polyP målinger foretaget ved hjælp af denne metode. Alternativt, polyP og adenosin ud (ADP) kan omdannes til adenosin trifosfat (ATP) ved hjælp af renset Escherichia coli polyP kinase (PPK) og den deraf følgende ATP kvantificeres ved hjælp af luciferase14,17 ,18. Dette giver mulighed for påvisning af meget små mængder af polyP, men kræver to enzymatisk reaktion skridt og både luciferin og meget ren ADP, som er dyre reagenser. ScPPX specielt fordøjer polyP i gratis fosfat6,12,13,24, som kan påvises ved hjælp af enklere metoder, men ScPPX er hæmmet af DNA og RNA-12, nødvendiggør DNase- og RNase behandling af polyP-holdige ekstrakter. Hverken PPK eller ScPPX er kommercielt tilgængelige, og PPK rensning er relativt komplekse25,26.

PolyP i cellelysater eller ekstrakter kan også være visualiseret på polyacrylamidgeler af DAPI negative farvning27,28,29,30, en metode, der tillader vurdering af kædelængde, men er lav-overførselshastighed og dårligt kvantitative.

Nu rapporterer vi en hurtig, billig, medium-overførselshastighed polyP assay, der giver mulighed for hurtig kvantificering af polyP niveauer i forskellige bakteriearter. Denne metode begynder ved lysing bakterieceller ved 95 ° C i 4 M guanidin isothiocyanat (GITC)14 for at inaktivere cellulære fosfataser, efterfulgt af en silica membran kolonne udvinding optimeret til hurtig behandling af flere prøver. Den resulterende polyP-holdige ekstrakt er derefter fordøjes med et stort overskud af ScPPX, eliminerer behovet for DNase- og RNase behandling. Vi medtager en protokol for ligetil nikkel affinitet rensning af mg mængder af ScPPX. Endelig er polyP-afledte gratis fosfat kvantificeret med en enkel, følsomme, ascorbinsyre-baserede kolorimetriske assay24 og normaliseret til samlede cellulære protein. Denne metode strømliner måling af polyP i bakterieceller, og vi demonstrere brugen med repræsentative arter af Gram-negative bakterier, Gram-positive bakterier og mykobakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. rensende gær Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Transformer E. coli protein overekspression stamme BL21(DE3)31 med plasmidet pScPPX26 af elektroporation32 eller kemisk omdannelse33.
  2. Podes 1 L lysogeny bouillon (LB) indeholdende 100 µg mL-1 ampicillin i en 2 L unbaffled kolben med en enkelt koloni af BL21(DE3) indeholdende pScPPX2 og inkuberes natten over ved 37 ° C uden rystende, at en absorbans på 600 nm (en600) af cirka 0,3, som måles i et spektrofotometer.
  3. Start kultur ryster (180 rpm) og Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C, i hvilket tidsrum cellerne vil vokse til et A600 af 0,4 - 0,5.
  4. Tilføje isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til en endelig koncentration på 1 mM og en yderligere 100 µg mL-1 ampicillin, derefter inkuberes i 4 timer ved 37 ° C under omrystning på 180 rpm.
    Bemærk: Denne overekspression protokol genererer en stor mængde af opløselige ScPPX. Men ScPPX overekspression er meget tilgivende, og en række andre fælles protein overekspression protokoller har været vant til med held rense ScPPX.
  5. Overføre cellerne til en 1 L centrifuge flaske og høste dem ved centrifugering i 20 min. på 5000 x g ved 4 ° C. Fjern supernatanten og overføre celle pellet til en 50 mL konisk slange.
    Bemærk: Celle pellets kan opbevares på ubestemt tid ved-80 ° C.
  6. Tø pellet på is, så resuspend det i 9 mL 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl og 5 mM imidazol (pH 8) til et samlet volumen på ca. 10 mL.
  7. Tilføje (endelige koncentrationer) 1 mg mL-1 Lysozym, 2 mM MgCl2og 50 enheder mL-1 i en RNA og DNA nedværdigende liv1975 (Se Tabel af materialer) og der inkuberes i 30 min på is.
    Bemærk: ScPPX binder nukleinsyrer (data ikke vist), så nukleasen behandling er vigtigt under rensningen.
  8. Ved hjælp af en sonikator med en microtip (Se Tabel af materialer), lyse celler af 2 cyklusser af sonikering på isen ved 50% effekt, pulserende 5 s på og 5 s ud, med en 2 min hvile mellem cyklusser.
    Bemærk: Brug egnede høreværn under sonikering. Ligeledes til tilfældet med overekspression, en række celle lysis metoder er acceptabelt for ScPPX rensning.
  9. Fjerne uopløselige snavs ved centrifugering af lysate i 20 min. på 20.000 x g ved 4 ° C. Filtrere den resulterende supernatanten (ca. 10 mL) gennem en 0,8 µm pore størrelse celluloseacetat sprøjte filter.
  10. Læg lysate på en nikkel-opkrævet 5 mL chelaterende kolonne (Se Tabel af materialer) ved hjælp af enten en peristaltisk pumpe eller en stor sprøjte.
  11. Skylles kolonnen med 50 mL af 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazol (pH 8).
  12. Skylles kolonnen med 50 mL af 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazol (pH 8).
  13. Elueres ScPPX med 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl og 0,5 M imidazol (pH 8), indsamle 15 1 mL fraktioner. Teste disse eluering brøker for protein indhold med Bradford protein assay34 (Se Tabel af materialer) og køre en SDS-PAGE gel35 for at bekræfte, hvilke fraktioner indeholder renset ScPPX (Molekylær vægt = 45 kDa).
  14. Pool fraktioner der indeholder ren ScPPX og justere koncentrationen af de poolede protein til omkring 2 mg mL-1 med 50 mM HEPES og 0,5 M NaCl. Højere protein koncentrationer kan udfældes i næste trin.
  15. Veksle den renset ScPPX til opbevaring buffer (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 50 mM KCl, 10% [v/v] glycerol) af dialyse. Poolet ScPPX fraktioner i en forseglet længde på 12.000-14.000 Da molekylvægt cutoff dialyse membran slanger (Se Tabel af materialer) og suspendere i 1 L opbevaring buffer med kontinuerlig omrøring ved 4 ° C for mindst 4 h. gentage dette trin med friske opbevaring buffer for et samlet beløb på 3 buffer ændringer.
  16. Overføre den renset, dialysebehandling protein til et centrifugeglas eller rør og centrifugeres i 20 min. på 20.000 x g ved 4 ° C til at fjerne enhver uopløselige aggregater. Omhyggeligt overføre supernatanten til en ren 15 mL konisk slange.
  17. Justere koncentrationen af den renset ScPPX til 1 mg mL-1 med opbevaring buffer, tilsættes 0,1% (w/v) protease-fri bovint serumalbumin (BSA; slutkoncentration) og butik i op til 6 måneder ved 4 ° C.
    Bemærk: ScPPX mister mere end 90% af sin aktivitet, når det er frosset13.

2. høst prøver til Polyphosphate udsugning

  1. Vokse bakterier på betingelser af interesse for bestemmelse af polyP indholdet. For denne protokol, vokse Lactobacillus reuteri36 natten over ved 37 ° C uden rystelser i æblesyre enzym induktion (MEI) medium37 uden cystein (MEI-C).
  2. Høste nok celler ved centrifugering i 1,5 mL microcentrifuge rør til i alt 50 – 100 µg af cellulære proteiner (Se trin 3 nedenfor). For E. coli, dette er 1 mL af en log fase kultur på en A600 på 0,2 - 0,4. For L. reuterier 1 mL af en overnight kultur. Justere som nødvendigt for andre arter af interesse.
  3. Helt Fjern supernatanten fra celle pellets.
  4. Resuspend celle pellets i 250 µL af GITC lysisbuffer (4 M guanidin isothiocyanat, 50 mM Tris-HCl, pH 7) og lyse ved inkubering ved 95 ° C i 10 min. butik lysates ved-80 ° C.
    Bemærk: Være i overensstemmelse med lysis time, da udvidede inkubation ved høje temperaturer kan resultere i forringelse af polyP ved hydrolyse38. Lysates kan opbevares på ubestemt tid ved-80 ° C.
    Forsigtig: Guanidin isothiocyanat er et chaotropic salt og bør håndteres med handsker og bortskaffes som farligt affald.

3. måling af proteinindholdet i cellelysater

  1. Forberede BSA standarder indeholdende 0, 0,1, 0,2 og 0,4 mg mL-1 for BSA i GITC lysisbuffer.
    Bemærk: Det er vigtigt at gøre BSA standarder i GITC, da GITC påvirker farveudviklingen af Bradford assay. BSA standarder kan gemmes på ubestemt tid på-20 ° C.
  2. Alikvot 5 µL af optøede, godt blandet cellelysater og BSA standarder til at adskille brønde i en klar 96-brønd plade.
  3. Tilføje 195 µL af Bradford reagens34 til hver brønd og måling af absorbans ved 595 nm (en595) i en Pladelæser (Se Tabel af materialer).
  4. Beregn mængden af protein i hver brønd ved sammenligning med BSA standardkurven, ved hjælp af formlen y = mx + b, hvor y er en595, x er µg for BSA, m er hældningen på standardkurven, og b er y-skæringspunktet af standardkurven. Formere den resulterende værdi af 0,05 til at bestemme den samlede mg protein i hver prøve.

4. udvinding Polyphosphate

  1. Tilføje 250 µL af 95% ethanol til hver GITC-mængden prøve og vortex at blande.
  2. Anvende denne blanding til en silica membran spin kolonnen og centrifugeres i 30 s på 16,100 x g.
  3. Kassér gennemstrømnings-og derefter tilføje 750 µL af 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% ethanol, og der centrifugeres for 30 s på 16,100 x g.
  4. Kassér gennemstrømning og centrifugeres i 2 min på 16,100 x g.
  5. Placer kolonnen i en ren 1,5 mL mikrofuge rør og tilsæt 150 µL af 50 mM Tris-HCl (pH 8).
  6. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min og derefter elueres polyP ved centrifugering for 2 min på 8.000 x g.
    Bemærk: Hvis det ønskes, eluater kan opbevares ved-20 ° C i mindst 1 uge.

5. fordøje Polyphosphate

  1. Udarbejde standarder indeholder 0, 5, 50 eller 200 µM kalium fosfat i 50 mM Tris-HCl (pH 8).
    Bemærk: Kalium fosfat standarder kan gemmes på ubestemt tid ved stuetemperatur.
  2. Alikvot 100 µL af hver standard fosfat og ekstraheres polyP prøver i separate brønde i en klar 96-brønd plade.
  3. Forberede en master mix indeholdende (pr. sample): 30 µL af 5 x ScPPX reaktion buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM ammoniumacetat, pH 7,5)13, 19 µL af H2O og 1 µL af renset ScPPX (1 mg mL-1).
  4. Tilsæt 50 µL af de master mix til hver brønd i 96-brønd-pladen. Inkuber i 15 min. ved 37 ° C.
    Bemærk: Hvis det ønskes, fordøjet polyP prøver kan opbevares ved-20 ° C på ubestemt tid.

6. påvisning af frie fosfat24

  1. Forberede påvisning løsning base ved at opløse 0.185 g af antimon kaliumtartrat i 200 mL vand, tilsætning af 150 mL af 4 N H2så4, derefter tilføje 1,49 g ammonium heptamolybdate. Rør til at opløse og derefter bringe en endelige mængden af 456 mL. Filtrer løsning for at fjerne partikler og gemme beskyttet mod lys ved 4 ° C i op til 1 måned.
  2. Forberede en stamopløsning af 1 M ascorbinsyre. Opbevares beskyttet mod lys ved 4 ° C i op til 1 måned.
  3. Forberede en frisk arbejder bestand af påvisning løsning hver dag ved at blande 9.12 mL af påvisning base med 0,88 mL 1 M ascorbinsyre. Tillade afsløring løsning til at komme til stuetemperatur før anvendelse.
  4. Tilføje 50 µL af påvisning løsning til hver prøve og standard i 96-brønd plade og inkuberes ved stuetemperatur i ca 2 min så farveudviklingen.
  5. Måling af absorbans ved 882 nm med en Pladelæser og beregne fosfat koncentration af hver prøve i forhold til kalium fosfat standardkurven.
    Forsigtig: Afsløring løsning indeholder giftige salte og stærke syrer. Bære handsker og behandle overskydende løsning som giftigt affald.

7. beregning af cellulære Polyphosphate indhold

  1. Konvertere fosfat koncentrationerne bestemmes i skridt 6,5 til nanomoles af polyP-afledte fosfat i hver hele cellen lysate efter følgende formel:
    nmol polyP = 1,5 x (µM fosfat / 10)
    Bemærk: Standard kurve-baseret metode i trin 6 bestemmer koncentrationen af fosfat (i µM) i hver 100 µL polyP prøve aliquoted i trin 5.2. For at konvertere denne koncentration til en række nmol, 100 µL divideres med 106 at give et volumen i L, ganget med koncentration (µmol L-1), derefter ganget med 1000 (antallet nmol i en µmol). Dette reducerer at dividere koncentrationen af 10. Den samlede ekstrakt volumen forberedt i trin 4 er 150 µL, så det er nødvendigt at formere den resulterende værdi af 1,5 til at beregne nmol af fosfat i det hele ekstrakt.
  2. Normalisere cellulære polyP indhold til samlede cellulære protein ved at dividere nmol polyP med mg total protein i hver prøve, der bestemmes i trin 3.4. PolyP niveauer er udtrykt i koncentrationen af enkelte polyP-afledte fri phosphat.
    Bemærk: I nogle tilfælde kan mængden af polyP-afledte fosfat findes i en prøve falder uden for det lineære område af fosfat standardkurven (skridt 6,5). Hvis niveauet af polyP er meget høj, overskydende polyP-holdige eluatet fra trin 4.6 kan fortyndes 1:10 eller 1: 100, efter behov, og derefter målt igen som beskrevet i trin 5-7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De vigtigste skridt i protokollen er diagrammed i forenklet form i figur 1.

For at demonstrere brugen af denne protokol med gramnegative bakterier, wild-type E. coli var MG165539 vokset til midten log fase i LB rig medium ved 37 ° C under omrystning (200 rpm), derefter skylles og inkuberes i en yderligere 2 h i morpholinopropanesulfonate-buffer (MOPPER) minimal medium40 indeholdende 4 g L-1 glukose og 0,1 mM K2HPO4, en tilstand kendt for at inducere produktion af polyP14,29. Som vist i figur 2A, opdaget vi ingen polyP i wild-type E. coli vokset i LB og 192 ± 14 (gennemsnit ± standardafvigelse [SD]) nmol polyP mg-1 total protein i MOPS, i overensstemmelse med tidligere rapporter14,29 . Som forventet, en ∆ppk mutant6, hvilke mangler polyP kinase41, produceret ingen polyP i enten medium, produceret en ∆ppx mutant6, som mangler exopolyphosphatase42, omtrent den samme mængde af polyP som wild-type, og en ∆phoB mutant29, som er defekt i fosfat transport, produceret betydeligt mindre polyP end vildtype14,29,43.

For at demonstrere brugen af denne protokol med Gram-positive bakterier, wild-type L. reuteri ATCC PTA 647536 og en isogene ppk1 null mutant mangler polyP kinase, konstrueret ved hjælp af oligo-rettet recombineering44, var dyrkes natten over i MEI-C ved 37 ° C uden rystelser. Som vist i figur 2B, den akkumulerede 51 ± 6 nmol polyP mg-1 samlet vildtypeprotein under disse betingelser, mens ppk1 mutant indeholdt mindre end halvdelen af denne mængde. L. reuteri indeholder en anden polyP kinase, kodet af det ppk2 genet45, som formentlig konti for polyP præsentere i ppk1 null mutant.

For at demonstrere brugen af denne protokol med mykobakterier, var Mycobacterium smegmatis stamme SMR546 vokset til midten log fase Hartmans-de Bont (HdB) medium47, derefter skylles og fortyndes fem gange i HdB eller HdB med 2% ethanol. Disse kulturer var derefter inkuberes natten over ved 37 ° C under omrystning (180 rpm). Som vist i figur 2 c, i mangel af ethanol, akkumuleret M. smegmatis 141 ± 52 nmol polyP mg-1 total protein, mens ethanol behandling resulterede i en tredobbelt stigning til 437 ± 102 nmol polyP mg-1 total protein. Dette resultat var forventet, da ethanol er tidligere blevet rapporteret at ophøje polyP niveauer i M. smegmatis48.

Figure 1
Figur 1: Diagram over polyphosphate udvinding og måling procedure. De afgørende trin i polyP kvantificering protokol er illustreret. Bakteriel celle pellets er mængden ved 95 ° C i GITC (guanidin isothiocyanat). Mindre delprøver af lysates er analyseret for proteinindhold ved hjælp af Bradford assay. PolyP er udvundet ved hjælp af silica membran kolonner og derefter fordøjes med ScPPX. Den resulterende fri phosphat kvantificeres ved hjælp af ascorbinsyre assay. Samlede polyP-afledte fosfat er normaliseret til total protein for hver prøve. En595 = absorbans ved 595 nm; En882 = absorbans ved 882 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentant resultat med forskellige bakterier. (A) E. coli MG1655 wild-type og isogene ∆ppk, ∆ppxog ∆phoB mutanter blev dyrket ved 37 ° C under omrystning (200 rpm) til en600 = 0,2 - 0,4 i rige LB medium (sorte cirkler) og derefter flyttet til minimal medium (MOPPER indeholdende 4 g L-1 glukose og 0,1 mM K2HPO4) for 2 h (hvide cirkler; n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC PTA 6475 (cirkler) og en isogene ppk1 null mutant (trekanter) blev dyrket natten over ved 37 ° C i MEI-C medium uden rystelser (n = 3, ± SD). (C) M. smegmatis SMR5 blev dyrket ved 37 ° C under omrystning (180 rpm) til en600 = 1 i HdB medium med (lukket firkanter) eller uden (åbne pladser) 2% ethanol (n = 3, ± SD). PolyP niveauer er udtrykt i koncentrationen af enkelte polyP-afledte fri phosphat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her forenkler og fremskynder kvantificering af polyP niveauer i forskellige bakterier, med en typisk sæt af 24 prøver at tage omkring 1,5 h fuldt behandle. Dette tillader hurtig screening af prøver og analyser af mutant biblioteker og forenkler kinetic eksperimenter måling ophobning af polyP over tid. Vi har demonstreret, at protokollen fungerer effektivt på repræsentanter for tre forskellige phyla: proteobakterier, firmicutes, og actinobacteria, som er berygtet for deres modstandsdygtige, vanskeligt at lyse cellevægge49.

Påvisning af polyP ved fordøjelsen med ScPPX er mere specifikke og mere følsomme end fluorescens opdagelse hos DAPI, og er billigere og mere teknisk enkel end konvertering af polyP til ATP ved hjælp af PPK. Selv om ScPPX er hæmmet af DNA og RNA12, har vi overvinde dette ved hjælp af et meget stort overskud af enzym (1 µg pr. prøve) at opnå komplet fordøjelsen selv i bakterier, der indeholder mere end 6.000 nmol polyP mg-1 protein29. Andre offentliggjorte metoder brug 10-15 ng af ScPPX pr. reaktion12,24. Vores protokol for ScPPX rensning udbytter typisk mere end 5 mg af ren ScPPX pr. liter overekspression kultur, hvilket er nok til mere end 5.000 assays. Vi har fundet, at flere forskellige protokoller til nikkel-affinitet rensning af hans markeret proteiner fungerer godt til at rense ScPPX overexpressed fra pScPPX2 (data ikke vist), og der er en bred vifte af sådanne protokoller kan tilpasses labs med varierende tekniske kapacitet.

Tidligere protokoller ved hjælp af ScPPX fordøjelse til registrering af polyP har ofte påberåbt sig Malakit grønt-baserede kolorimetriske assays til at kvantificere gratis fosfat6,12. Disse assays er følsomme, men kræver typisk omhyggeligt tidsstyret sekventiel tilsætning af to eller tre separate reagenser til at foretage præcise målinger24,50,51. Den ascorbinsyre-baseret detektionssystem brugte her24 har en bredere lineære område opdagelse end Malakit grønt uden tab af følsomhed, kun omfatter tilføjelse af en enkelt reagens og ikke kræver præcise timing.

Der er flere trin, der er afgørende for succes i denne protokol. Første, bakteriel prøver bør være mængden i GITC umiddelbart efter høstningen, skal sikre, at polyP niveauer ikke ændrer efter tidspunktet for prøveudtagningen og hurtigt inaktivere cellulære fosfataser. Andet, ikke Inkuber GITC lysates ved 95 ° C i mere end 10 min, og gemme dem umiddelbart bagefter ved-80 ° C til at minimere mulige polyP hydrolyse. Tredje, være forsigtig, når du når der afpipetteres prøver i 96-brønd plader til enten protein eller fosfat målinger ikke at plaske eller dryppe noget fra én prøve til en anden. De kolorimetriske assays, især for fosfat, er meget følsomme, og små mængder af forurening kan kraftigt skew resultaterne. Endelig har nogle reagenser, der anvendes i denne protokol (dvs. ScPPX, påvisning løsning) begrænset hylde liv. Forberede friske ScPPX hver 6 måneder og frisk påvisning løsning hver måned.

En begrænsning af vores metode er, at silica kolonner ikke binde polyP mindre end 60 fosfat enheder længe godt12,14,15. Selvom bakterier syntetisere typisk mest langkædede polyP3, anbefaler vi foreløbig eksperimenter ved hjælp af polyacrylamid gel elektroforese27,30 at vurdere kædelængde i en given bakteriearter før du bruger vores procedure. For arter hvor kortkædede polyP udgør en betydelig brøkdel af polyP pool, vores protokol er ikke hensigtsmæssigt, og vi anbefaler udvinding polyP ved en anden metode (f.eks., phenol-chloroform udvinding12), og vil også anbefale supplere ScPPX fordøjelse med kommercielt tilgængelige S. cereviseae har pyrophosphatase (PPA1)24, da ScPPX ikke fordøje pyrofosfat13 og dette et forholdsmæssigt højere indvirkning på målinger af kortere-kæde polyP. Som et alternativ til ScPPX, sur hydrolyse38 kunne bruges til at hydrolysere polyP fri phosphat, men dette ville kræve yderligere DNase, RNase og rensning for at sikre, at kun polyP-afledte fosfat var der måles. I nogle tilfælde kan det være nyttigt at bruge en alternativ ekstraktion metode til at teste, om effektiviteten af polyP ekstraktion med GITC varierer mellem stammer eller betingelser, især med bakterier har tykke cellevægge, f.eks mykobakterier. Hvis niveauet af polyP under påvisningsgrænsen af denne analyse er vigtig for studier af særlige arter, kan det være nødvendigt at bruge en anden påvisningsprotokol, som ved hjælp af PPK konvertere polyP til ATP, som kan påvises ekstremt følsomt ved hjælp af kommercielt tilgængelige luciferase-baserede assays14,17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette projekt blev støttet af University of Alabama i Birmingham Institut for Mikrobiologi start midler og NIH grant R35GM124590 (til MJG) og NIH grant R01AI121364 (til FW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  33. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 143 Polyphosphate stressrespons exopolyphosphatase Gram-negative bakterier Gram-positive bakterier mykobakterier
Kørsler til uorganiske Polyphosphate i bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pokhrel, A., Lingo, J. C.,… More

Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter