Summary
यहां हम दो प्रोटोकॉल, विशिष्ट विकास दर को मापने के लिए एक और कोशिका के लिए अंय रोटावायरस की बाध्यकारी क्षमता पट्टिका परख और RT-qPCR का उपयोग कर प्रस्तुत करते हैं । इन प्रोटोकॉल रोटावायरस उपभेदों के बीच phenotypes में अंतर की पुष्टि के लिए उपलब्ध हैं ।
Abstract
रोटावायरस शिशु दस्त के लिए मुख्य etiological कारक है । यह एक डबल-कतरा (डी एस) आरएनए वायरस और एक आनुवंशिक रूप से विविध जनसंख्या रूपों, quasispecies के रूप में जाना जाता है, उनके उच्च उत्परिवर्तन दर के कारण । यहां, हम वर्णन कैसे विशिष्ट विकास दर को मापने के लिए और सेल-रोटावायरस के अपने phenotypes के रूप में बाध्यकारी क्षमता । रोटावायरस trypsin के साथ इलाज के लिए सेल रिसेप्टर पहचान और फिर MA104 सेल संस्कृति में inoculated है । supernatant, जिसमें वायरल जिन्न शामिल हैं, में रहकर एकत्र होता है । पट्टिका परख के लिए वायरस titer (पट्टिका बनाने इकाई: pfu) प्रत्येक एकत्र supernatant की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है । विशिष्ट विकास दर संशोधित Gompertz मॉडल के लिए pfu/एमएल के समय-पाठ्यक्रम डेटा फिटिंग द्वारा अनुमानित है । सेल की परख में बाध्यकारी, एक 24-अच्छी तरह से थाली में MA104 कोशिकाओं रोटावायरस से संक्रमित है और रोटावायरस सोखना के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए सेल रिसेप्टर्स के लिए मशीन । एक कम तापमान मेजबान सेल पर हमला करने से रोटावायरस नियंत्रित । virions को दूर करने के लिए धोने के बाद, आरएनए सीडीएनए संश्लेषण और रिवर्स-प्रतिलेखन मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-qPCR) के बाद सेल रिसेप्टर्स से जुड़ी virions से निकाला जाता है. इन प्रोटोकॉल वायरल उपभेदों के बीच phenotypic मतभेदों की जांच के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
आरएनए वायरस एक आनुवंशिक रूप से विविध जनसंख्या, quasispecies1के रूप में जाना जाता है, क्योंकि उनके उत्परिवर्तन दर,2 जो डीएनए की तुलना में अधिक है आधारित जीवों के रूप में । quasispecies में जनसंख्या संरचना उत्परिवर्तन, चयन दबाव, और आनुवंशिक बहाव सहित जनसंख्या आनुवंशिक कारकों से प्रभावित है । एक आनुवंशिक वंश के भीतर उपभेदों आनुवंशिक विविधता की वजह से अलग phenotypes दिखा सकते हैं । उदाहरण के लिए, Rachmadi एट अल. दिखाया गया है कि मुक्त क्लोरीन संवेदनशीलता murine नोरोवायरस उपभेदों है कि एक पट्टिका-शुद्ध तनाव S7-PP33से उत्पंन के बीच अलग था ।
Rotaviruses (जीनस रोटावायरस reoviridae परिवार में) गैर quasispecies2के गठन डी एस आरएनए वायरस हैं । जनसंख्या आनुवंशिक कारकों के अलावा ऊपर वर्णित है, जीनोम reassortment रोटावायरस की आनुवंशिक विविधता को प्रभावित करता है क्योंकि इस वायरस के 11 खंडों जीनोम4है । Rotaviruses कारण दस्त मुख्य रूप से शिशुओं के बीच, और २०१३ में शिशु की मृत्यु के बारे में अनुमानित थे २५०,०००5. दो टीके कई देशों में उपयोग में हैं और रोटावायरस संक्रमण के बोझ को कम करने में कारगर रहे हैं, लेकिन कुछ शोधकर्ताओं ने अब वैक्सीन की मौजूदगी की चर्चा-एस्केप म्यूटेंट6,7,8, 9. इन म्यूटेंट के लक्षण वर्णन के लिए टीका-भागने तंत्र को समझना जरूरी है.
यहां, हम दो परख के लिए विशिष्ट विकास दर और सेल रोटावायरस के बंधन की क्षमता के मूल्यांकन के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए उपभेदों के बीच phenotypic मतभेदों को समझने के लिए/म्यूटेंट । rotaviruses की वृद्धि वक्र पिछले रिपोर्ट10में प्रस्तुत किया गया है, लेकिन इस तरह के विशिष्ट वृद्धि दर के रूप में वृद्धि मापदंडों आमतौर पर मापा नहीं कर रहे हैं । एक सेल बाध्यकारी परख पहले आयोजित immunofluorescent धुंधला तकनीक11शामिल है । हम यहां पट्टिका परख और आर टी-qPCR, जो हमें मात्रात्मक वायरल phenotypes में अंतर पर चर्चा करने की अनुमति का उपयोग कर के आसान तरीके दिखाओ । इन तरीकों रोटावायरस phenotypes के लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त है और अंततः नए टीके के निर्माण के लिए कई पादी के लिए प्रभावी योगदान कर सकते हैं ।
Protocol
1. मध्यम तैयारी
- एक सेल कल्चर मीडियम (सीरम युक्त माध्यम) बनाने के लिए, ईगल की मेम पाउडर के ४.७ ग्राम को आसुत जल के ५०० मिलीलीटर में जोड़ें । 20 मिनट के लिए १२० डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव और मध्यम कमरे के तापमान को शांत करते हैं । भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़ें (अंतिम एकाग्रता: 10%), L-Glutamine (2 मिमी), पेनिसिलिन Streptomycin (1%) और सोडियम बिकारबोनिट (१.१२५ g/ 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- कदम १.१ में वर्णित के रूप में वायरस के प्रसार के लिए सीरम मुक्त माध्यम तैयार है, लेकिन भ्रूण गोजातीय सीरम के बिना । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- पट्टिका परख के लिए, ईगल की मेम मध्यम (गैर युक्त phenol लाल) autoclaving द्वारा १०० मिलीलीटर निष्फल । मध्यम ठंडा करने के लिए कमरे के तापमान, और फिर जोड़ें 2% FBS, 2% पेनिसिलिन Streptomycin, 4 मिमी l-Glutamine, और २.२५ g/l NaHCO3. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- पट्टिका परख के लिए, आटोक्लेव द्वारा २.५% agarose जेल के १०० मिलीलीटर निष्फल । जेल तैयार उसी दिन पट्टिका परख आयोजित की जाती है । एक जल स्नान में ४७ ° c पर जेल की दुकान ।
2. सेल संस्कृति
- तरल नाइट्रोजन संग्राहक से MA104 कक्ष रेखाओं वाले cryotube को निकालें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी में स्नान में cryotube जगह गल कोशिकाओं । एक T75 कुप्पी में सीरम युक्त मध्यम के 20 मिलीलीटर के लिए सेल निलंबन की 1 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ ° c और 5% 2 या 3 दिनों के लिए2 सह पर एक मशीन में कुप्पी मशीन ।
नोट: निलंबन में अंतिम कोशिका एकाग्रता के बारे में 106 कोशिकाओं/एमएल है । - एक बार सेल monolayer ८०% के प्रवाह तक पहुंचता है, supernatant हटाने और 1x Dulbecco के पंजाबियों (फास्फेट बफर खारा) के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लो ।
- ०.०५% trypsin-EDTA के 4 मिलीलीटर जोड़ें कुप्पी और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन को कुप्पी से कोशिकाओं को अलग करने के लिए । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए १९० x g पर केंद्रापसारक ।
- supernatant त्यागें और १.१ में तैयार किए गए माध्यम से सीरम युक्त मध्यम के 1 मिलीलीटर में छर्रों कोशिकाओं (106 कोशिकाओं) resuspend । resuspend कोशिकाओं पर १००-मध्यम के साथ गुना पतला ।
- 6 के प्रत्येक अच्छी तरह से पतला सेल निलंबन के 3 मिलीलीटर जोड़ें (पट्टिका परख के लिए) या 24 अच्छी तरह से प्लेटें (सेल के लिए-बाध्यकारी परख), क्रमशः । एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% 2 या 3 दिनों के लिए संतृप्त वाष्प के तहत सह2 में प्लेटें ।
नोट: एक T75 कुप्पी समय-पाठ्यक्रम के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए उपयुक्त है क्योंकि supernatant (1 एमएल) के नमूने की मात्रा कुल supernatant मात्रा (30 एमएल) की तुलना में नजरअंदाज किया जा सकता है । इस बीच, प्रत्येक supernatant में वायरस के संक्रामक titer पट्टिका परख है, जो आम तौर पर एक 6-अच्छी तरह से थाली का उपयोग किया जाता है द्वारा मापा जाता है । एक 24 अच्छी तरह से थाली सेल बाध्यकारी परख के लिए उपयोग किया जाता है ।
3. रोटावायरस की विशिष्ट वृद्धि दर
नोट: रीसस रोटावायरस (RRV, जीनोटाइप: G3P [3]) इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है क्योंकि RRV MA104 कोशिकाओं के साथ तेजी से और आसानी से फार्म पट्टिकाएं कर सकते हैं ।
- एक सीरम मुक्त माध्यम में 1 मिलीलीटर वायरस निलंबन (107 pfu/एमएल) से युक्त एक ट्यूब प्लेस ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में ८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । 1 µ g/µ l trypsin को सुअर का अग्ंयाशय से 1 मिलीलीटर के वायरस के निलंबन (अंतिम trypsin एकाग्रता 4 µ g/एमएल) और उसके बाद भंवर में जोड़ें । ३७ ° c और 5% सह2 पर वायरस निलंबन मशीन 30 मिनट के लिए संतृप्त भाप के नीचे ।
नोट: अंय स्रोतों से Trypsin इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन रोटावायरस infectivity पर प्रभाव को अग्रिम में परीक्षण की जरूरत है । - एक सीरम मुक्त माध्यम के साथ सक्रिय वायरस निलंबन पतला संक्रमण (MOI) की बहुलता को समायोजित करने के लिए ०.१ pfu/
- MA104 सेल लाइनों को पतला वायरस निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें (८०% धाराप्रवाह) एक T75 कुप्पी में 3 दिनों के बाद सेल चढ़ाना (२.१), 1 ज के लिए ३७ ° c पर मशीन, और धीरे से कुप्पी हर 15 मिनट हिला ।
- फिर, एक सुअर का अग्ंयाशय से trypsin की कुप्पी के लिए ०.१३ µ g/एमएल युक्त एक सीरम मुक्त माध्यम के 30 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ ° c और 5% सह संतृप्त भाप के तहत2 पर कुप्पी मशीन ।
- supernatant की कुप्पी में 0, 6, 12, 18, 24, और ३६ पर 1 मिलीलीटर ले लीजिए (और/४८) एच के बाद संक्रमण (hpi) और १.५ मिलीलीटर एक पिपेट का उपयोग कर ट्यूबों में supernatant की जगह ।
- (-८० डिग्री सेल्सियस) फ्रीज आचरण और ३७ डिग्री सेल्सियस चक्र तीन बार में एक पानी स्नान में पिघला । फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १२,६०० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक । supernatant लीजिए.
- कक्ष अंश को निकालने के लिए supernatant को आसुत ०.२ µm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें । स्टोर फ्रिज में supernatant-८० ° c यह वायरस titer को मापने के लिए पट्टिका परख करने के लिए आवेदन जब तक ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में एकत्र supernatant (चरण ३.५) युक्त ट्यूबों प्लेस । 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 गुना पतला नमूना और गर्मी की एक 1 मिलीलीटर के लिए 4 µ g/एमएल trypsin जोड़ें ।
- ३.८ में 30 मिनट की मशीन के दौरान, समय पाठ्यक्रम के नमूनों से प्राप्त वायरस titer को मापने के लिए पट्टिका परख शुरू करने के लिए (३.५ कदम), MA104 कोशिकाओं को धो दो बार 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ एक 6-अच्छी तरह से प्लेट को हटाने के बाद सीरम युक्त मध्यम ।
- प्रश्नपत्र एक सीरम मुक्त माध्यम के साथ मशीन के नमूनों को पतला और एक अच्छी तरह से पतला नमूना के 1 मिलीलीटर inoculate । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 में संतृप्त भाप के नीचे ९० मिनट के लिए थाली मशीन, और धीरे से थाली हर 15 मिनट हिला ।
- मशीन के बाद, 6-अच्छी तरह से थाली से इनोक्युलम निकालें । (चरण १.३) में तैयार किए गए माध्यम से 4 µ g/mL trypsin जोड़ें । धीरे लेकिन तुरंत agarose जेल के साथ मिश्रित मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ने (अनुपात 1:1 है) के लिए एक अच्छी तरह से ।
- अधिक से अधिक 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट रखें (जब तक agarose जेल ठोस हो जाता है) और 2 दिन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर और 5% सह संतृप्त वाष्प के तहत मशीन ।
नोट: मध्यम को अच्छी तरह से के किनारे से आगर के साथ मिश्रित डालो । - ०.०१५% तटस्थ लाल समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें 1x पंजाबियों के साथ एक अच्छी तरह से पतला और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह संतृप्त भाप के तहत2 में गर्मी । 3 एच के बाद डाई निकालें और 1 दिन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह संतृप्त भाप के तहत2 पर मशीन ।
- अगले दिन, प्रत्येक कुआं में सजीले टुकड़े की संख्या की गणना और pfu/एमएल की गणना । ध्यान पट्टिका को पट्टिका की संख्या को आश्वस्त करने से पहले कक्ष संगम की जांच करें ।
4. सेल-बाध्यकारी परख
नोट: यह प्रोटोकॉल गिल की रिपोर्ट13पर आधारित है ।
- एक सुअर का अग्ंयाशय से 1 µ g/µ l trypsin जोड़ें वायरस निलंबन (अंतिम trypsin एकाग्रता 4 µ जी/एमएल) और फिर भंवर (२.१ में के रूप में एक ही तरीके से) । एक सीरम मुक्त माध्यम के साथ वायरस निलंबन के 1 pfu/सेल के MOI को समायोजित करने के लिए पतला ।
- फिर, MA104 कोशिकाओं को दो बार 24-well प्लेट पर Tris-बफ़र्ड खारा के 1 मिलीलीटर के साथ धो (टीबीएस; २.५३ g/l Tris base, ६.५४ g/l NaCl, ०.३ g/l KCl, ०.०४६ g/l ना2HPO4 आसुत जल के साथ 1 L तक पहुंचने के लिए) ।
- Inoculate १०० µ के एल पतला वायरस निलंबन कोशिकाओं के साथ एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए, और ९० मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, कोमल मिलाते हुए हर 15 मिनट के साथ ।
- वायरस इनोक्युलम निकालें और टीबीएस की 1 मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें । रोटावायरस के डबल असहाय (डी एस) आरएनए निकालने के लिए, एक अच्छी तरह से करने के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें) 1x पंजाब के १४० µ एल और आरएनए निष्कर्षण बफर के ५६० µ एल जोड़ें । एक पिपेट के साथ पर्याप्त रूप से मिश्रण (के बारे में 10x या जब तक धुंध या बफर में कोशिकाओं की contaminant नहीं देखा है) ।
- डबल असहाय आरएनए (dsRNA) निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार उबरने के बाद, १.५ मिलीलीटर ट्यूब ९५ डिग्री सेल्सियस पर एक हीट ब्लॉक पर dsRNA निकालने के लिए 5 मिनट के लिए dsRNA को विकृत करने के लिए जगह है, और फिर तुरंत बर्फ पर ट्यूबों जगह और अधिक 2 के लिए मशीन न्यूनतम.
- एक रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग करके सीडीएनए संश्लेषित ( सामग्री की तालिकादेखें) । एक पीसीआर ट्यूब करने के लिए विकृत वायरल आरएनए समाधान के 4 µ एल जोड़ें (तालिका 1) मिश्रण के 16 µ l युक्त और बुलबुले उत्पन्न करने के लिए नहीं के रूप में एक पिपेट के साथ इसे ध्यान से मिश्रण. ट्यूबों नीचे स्पिन ।
- 2 तालिकामें दिखाया शर्त के तहत एक थर्मल साइकिल चालक के साथ रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करते हैं । यदि सीडीएनए का तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो सीडीएनए से युक्त पीसीआर ट्यूब को 1 वर्ष तक के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
- मात्रात्मक पीसीआर के लिए प्राइमरों का प्रयोग करें (फॉरवर्ड; 5 '-ACCATCTACACATGACCCTC-3 ', रिवर्स; 5 '-GGTCACATAACGCCCC-3 ')14 और एक शमन डालने की जांच (qPCR जांच; 5 '-/FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA/-3 '), लक्ष्यीकरण ९६३ – रोटावायरस के NSP3 जीनोम सेगमेंट के १०४९ क्षेत्र (ST3 तनाव, GenBank: X81436).
नोट: शमन Zeng एट अल14 द्वारा डिजाइन की जांच में डाला जाता है - qPCR मिश्रण (table 3) को पीसीआर ग्रेड वॉटर के साथ मानक प्लाज्मिड प्रश्नपत्र (101 से 106 कॉपी/एमएल) और मास्टर मिक्स (20 µ l/नमूना) qPCR के लिए टेबल 4के बाद पतला करें ।
- मास्टर मिक्स के 20 µ l को अच्छी तरह से एक ९६-well पीसीआर प्लेट में डालिये, और उसके बाद 5 µ l को सीडीएनए के नमूने या 5 µ l को प्लाज्मिड करके मानक pipetting की 10 बार मिक्स कर दीजिये. तालिका 4में दिखाई गई शर्तों के अनुसार qPCR प्रणाली की प्रतिक्रिया प्रारंभ करें ।
- रोटावायरस MA104 सेल सतह से बंधे जीनोम की गणना करने के लिए, सीटी मूल्यों और एक मानक प्लाज्मिड के ज्ञात जीनोम संख्या के बीच रैखिक प्रतिगमन आचरण, और नमूना है जीनोम संख्या का अनुमान है । फिर आरंभिक इनोक्युलम (g0) में उन कक्षों (gt) के लिए बाइंडिंग विरिअन संख्याओं के अनुपात की गणना करें ।
Representative Results
विशिष्ट वृद्धि दर और पट्टिका-शुद्धि RRV उपभेदों के सेल बाइंडिंग परख के लिए दो प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्र 1a और 2a, क्रमशः में दिखाया गया है ।
विशिष्ट विकास दर के लिए परख में, T75 कुप्पी पर प्रचार करते समय अंतिम वायरस titer 107 pfu/एमएल से अधिक पहुंचता है । 107 pfu/एमएल से अधिकतम एकाग्रता कम है, तो MA104 सेल धाराप्रवाह नहीं हो सकता है या RRV trypsin द्वारा अच्छी तरह से सक्रिय नहीं किया गया था । कुछ वृद्धि मॉडल संक्रामक इकाई डेटा का उपयोग कर विशिष्ट वृद्धि दर का आकलन करने के लिए उपलब्ध हैं । इस प्रोटोकॉल में, संशोधित Gompertz मॉडल12 एक उदाहरण के रूप में कार्यरत है;
कहां n0 (104 pfu/एमएल इस अध्ययन में) और एनटी (104 से 108 pfu/एमएल) 0 और टी पर वायरस संक्रामक titer (pfu/एमएल) हैं (उदाहरण: 0, 6, 12, 18, 24, ३६) hpi, क्रमशः, एक asymptotic मान है [लाग (N∞/N0 )] (उदाहरण: 3 से 4), µ है विशिष्ट विकास दर [1/h], e है नेपियर स्थिरांक और λ अंतराल अवधि [h] है । मॉडल पैरामीटर्स, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के सॉल्वर फंक्शन द्वारा प्राप्त किए जाते हैं, जो स्वीकार्य और मॉडल किए गए मानों के बीच अंतर के वर्गों का योग कम करता है. चित्र 1bमें उदाहरण में, विशिष्ट वृद्धि दर (µ) ०.१९७ [1/एच] होने का अनुमान है और अंतराल अवधि (λ) एक संशोधित Gompertz मॉडल के लिए कम से वर्ग विधि लागू करने के द्वारा ६.६१ [h] है, और प्रारंभिक titer करने के लिए स्थिर चरण में संबंधित वायरस titer ( लॉग स्केल) (A) is ३.१५ [लॉग (N∞/N0)]. हम कुल में 6 रोटावायरस क्लोनों का परीक्षण किया है, और विशिष्ट विकास दर के अनुमानित मूल्यों ०.१९ से ०.२७ [1/ ये अनुमानित मान विश्वसनीय हैं क्योंकि मॉडल फिटिंग में निर्धारण मानों का गुणांक ०.९८ से अधिक है.
RRV virions सेल के लिए बाध्यकारी सतहों के बारे में थे 103 प्रतियां/एमएल (बंधन क्षमता के आसपास था 1%) जब सेल के लिए एक 24 अच्छी तरह से प्लेट-बाध्यकारी परख (चित्रा 2 बी) का उपयोग कर । परख आमतौर पर हर नमूने के लिए तीन बार आयोजित की जाती है, और यदि प्रतिलिपि संख्या में एक बड़ा विचरण एक नमूना में मनाया जाता है, जैसे अधिक धोने और trypsin द्वारा RRV के अपर्याप्त सक्रियण के रूप में कुछ समस्याओं हो सकती है । qPCR के बारे में ३६.० से अधिक की सीटी मूल्य बेहतर नहीं है और हमारे qPCR हालत में एक का पता लगाने की सीमा के नीचे माना जाता है ।
| वॉल्यूम/1 प्रतिक्रिया | |
| 5 x PrimeScript बफ़र | ४.० µ l |
| PrimeScript आरटी एंजाइम मिक्स मैं | १.० µ l |
| Oligo डीटी प्राइमर | १.० µ l |
| यादृच्छिक 6 mers | ४.० µ l |
| जुताई आसुत जल | ६.० µ l |
| ssRNA नमुना | ४.० µ l |
| कुल | २०.० µ l |
तालिका 1: रोटावायरस जीनोम के सीडीएनए संश्लेषण के लिए मास्टर मिक्स संरचना ।
| तापमान [° c] | समय |
| ३७ | 15 मिनट |
| ४२ | 15 मिनट |
| ८५ | 5 एस |
| 4 | ∞ |
तालिका 2: रोटावायरस जीनोम के सीडीएनए संश्लेषण के लिए प्रतिक्रिया की स्थिति ।
| वॉल्यूम/1 प्रतिक्रिया | |
| Premix Taq | १२.५ µ l |
| फॉरवर्ड प्राइमरी (10 µ मीटर) | ०.५ µ l |
| रिवर्स प्राइमर (10 µ एम) | ०.५ µ l |
| जांच (10 µ m) | ०.५ µ l |
| संदर्भ डाई द्वितीय | ०.५ µ l |
| जुताई आसुत जल | ५.५ µ l |
| सीडीएनए नमुना | ५.० µ l |
| कुल | 25 µ l |
तालिका 3: रोटावायरस एक जीनोम की मात्रात्मक पीसीआर के लिए मास्टर मिक्स संरचना ।
| तापमान [° c] | समय | |
| ९५ | 5 min | |
| ९४ | 20 एस | ४५ सायकल |
| ६० | 1 min | |
| ७२ | 5 min |
तालिका 4: रोटावायरस एक जीनोम की मात्रात्मक पीसीआर के लिए प्रतिक्रिया की स्थिति ।
चित्रा 1: रोटावायरस विकास और रोटावायरस के विकास वक्र के आकलन के योजनाबद्ध सिंहावलोकन । (क) रोटावायरस की संक्रामक इकाई को पट्टिका परख के साथ मापा जाता है. (ख) वक्र (नीली रेखा) हमारी प्रयोगशाला (वाइट सर्कल) में स्वीकार्य डेटा के आधार पर संशोधित Gompertz मॉडल द्वारा अनुमानित किया गया था । विशिष्ट विकास दर [µ]; ०.१९७ [h-1], अंतराल अवधि (λ); ६.६१ [h], सापेक्षिक वायरस प्रारंभिक titer (लॉग स्केल) (A) में स्थिर चरण पर titer; ३.१५ [लॉग (N∞/N0)] । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: योजनाबद्ध अवलोकन और सेल के प्रतिनिधि परिणाम-पांच RRV हमारी प्रयोगशाला में सजीले टुकड़े से शुद्ध उपभेदों की बाध्यकारी परख । (क) रोटावायरस के साथ एक कोशिका संस्कृति प्लेट inoculated कोशिकाओं में वायरस के आक्रमण को बाधित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीनी है । गर्मी और कोशिकाओं को असीम वायरल कणों को हटाने के बाद, आरटी-qPCR के साथ सेल की सतह के लिए बाध्य वायरल कणों से उत्पन्न जीनोम की संख्या को बढ़ाता है । (ख) कोशिका बाध्यकारी परख के परिणाम बाध्यकारी दक्षता (%), जो इनोक्युलम में मौजूद उन लोगों के लिए बाध्य वायरल कणों का अनुपात था के रूप में प्रदर्शित किया गया था । बोल्ड बार: माध्य, बक्से के अंत: चतुर्थक विचलन, रेखा के अंत: अधिकतम और ंयूनतम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
विशिष्ट विकास दर को मापने के लिए हमारे प्रोटोकॉल पिछले वाले से आसान है और अंय वायरस के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जब तक उनके सेल संस्कृति प्रणाली अभी तक स्थापित नहीं किया गया है । इस अध्ययन में, हम RRV (G3P [3]) का इस्तेमाल किया क्योंकि इस तनाव सजीले टुकड़े मानव rotaviruses से आसानी से फार्म कर सकते हैं जब MA104 सेल लाइनों का उपयोग कर. कुछ मानव रोटावायरस उपभेदों इस सेल लाइन में पट्टिका फार्म नहीं कर सकते । इसलिए, बजाय पट्टिका परख, यूनिट (FFU) परख15 या माध्य ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक (TCID50) परख के गठन के कई रोटावायरस उपभेदों16के लिए लागू किया जा सकता है । विशिष्ट वृद्धि दर निर्धारित करने के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य वायरस प्रकारों के लिए किया जा सकता है लेकिन वायरस के लिए उपयुक्त नहीं है जिसके लिए कोई स्थापित सेल कल्चर सिस्टम स्थापित नहीं है. विशिष्ट विकास दर के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले, यह पहले से पता करने के लिए बेहतर है जब वायरस संक्रामक titer को बढ़ाने के लिए शुरू होता है और एक प्रारंभिक परीक्षण में स्थिर चरण में पहुंचता है । यदि बहुत अधिक पट्टिकाएं मौजूद हों, तो वायरस के नमूनों की कमजोर दर को बदलने के बाद पट्टिका परख फिर से आयोजित की जानी चाहिए । घंटे के बाद संक्रमण (hpi) के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए भी महत्वपूर्ण है क्योंकि घातीय वृद्धि चरण की ढलान को कम करके आंका जा सकता है अगर उचित समय बिंदु को स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए याद किया जाता है । संशोधित Gompertz मॉडल द्वारा सन्निकटन में, दृढ़ संकल्प के एक गुणांक हमेशा की गणना की जानी चाहिए और जाँच की. यदि संशोधित Gompertz मॉडल के लिए फिटनेस कम है, ऐसे संशोधित रसद मॉडल12 के रूप में अंय विकास मॉडल बेहतर हो सकता है ।
हैंडलिंग कोशिकाओं में, जब मध्यम या वायरस इनोक्युलम, धोने या पट्टिका परख के लिए agarose जेल के लिए पंजाबियों तुरंत एक सेल संस्कृति की थाली की एक अच्छी तरह से जोड़ा जाना चाहिए सूखापन से कोशिकाओं को रोकने के लिए । एक ही समय में, आप धीरे से पंजाबियों या agarose कोशिकाओं को कुओं से अलग नहीं डालना चाहिए । यह कदम दोनों परख (चरण ३.९ और ३.११) में सबसे महत्वपूर्ण है । यदि पट्टिका परख भी कई नमूने है, हम agarose जेल (१०० एमएल प्रत्येक अधिकतम सिफारिश की है) कई मध्यम बोतलों में विभाजित करने की सिफारिश और बोतल गर्म रखने के बाद से ही प्रयोग से पहले agarose जेल के बारे में 10 मिनट के भीतर जम जाता है तापमान. चूंकि trypsin उच्च तापमान17की चपेट में है, एक trypsin समाधान पर्याप्त रूप से ठंडा करने के बाद पट्टिका परख के लिए एक मध्यम और agarose को जोड़ा जाना चाहिए ।
सेल में बाध्यकारी परख, कोशिकाओं को बाध्यकारी वायरस के लिए गर्मी 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए कोशिकाओं के आक्रमण को रोकने के लिए । है गिल विधि13के अनुसार, कोशिकाओं को कम तापमान पर सुखाने के लिए प्रवण हैं, तो मिलाते हुए कोमल हर 15 मिनट में आवश्यक है मशीन के दौरान । आरएनए निष्कर्षण यहां का उपयोग किट अंय किट के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है । RT-qPCR में मानक वक्र की ढलान लगभग ३.३ होना चाहिए, और दृढ़ संकल्प के गुणांक से अधिक ०.९८ होना चाहिए । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की तुलना में कोशिकाओं में वायरस के स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए, परख और अधिक तेजी से और आसान उपयोग करने के लिए है क्योंकि वायरस के लिए फ्लोरोसेंट पदार्थों के बंधन आवश्यक नहीं है ।
हाल ही में, मानव आंत्र enteroid (हिे), एक समान सेलुलर संरचना और मानव जठरांत्र उपकला के रूप में समारोह का प्रदर्शन, रोटावायरस प्रचार के लिए उपलब्ध हो गया है18. हिे का उपयोग हमें विशिष्ट वृद्धि दर और रोटावायरस के गैर culturable उपभेदों के सेल-बाध्यकारी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए सक्षम हो सकता है । इसके अलावा, दोनों प्रयोगों यहां वर्णित दोनों phenotypes19पर दवा प्रभाव के मूल्यांकन के लिए लागू किया जा सकता है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल इसे मात्रात्मक विभिंन स्थितियों के तहत रोटावायरस उपभेदों के phenotype पैरामीटर मूल्यों में परिवर्तन पर चर्चा करने के लिए संभव बनाते हैं ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम "स्वच्छता मूल्य श्रृंखला: पारिस्थितिकी के रूप में स्वच्छता प्रणालियों डिजाइनिंग सामुदायिक मूल्य प्रणाली" परियोजना, मानवता और प्रकृति के लिए ResearchInstitute (RIHN, परियोजना No. 14200107) का समर्थन किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | qPCR | |
| Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Plaque assay |
| Disodium Hydrogenphosphate | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Cell binding assay |
Eagle's MEM "Nissui"  |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Cell culture |
Eagle's MEM "Nissui"  |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Plaque assay |
| EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture |
| Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 10437028 | Cell culture and Plaque assay |
| Forward / Reverse primers | Eurofins Genomics | qPCR | |
| L-Glutamine, 200 mM Solution | Gibco | 2530081 | Cell culture and Plaque assay |
| Neutral Red | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Plaque assay |
| PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Cell culture and Plaque assay |
| Penicillin-Streptomycin, Liguid | Gibco | 15140122 | Cell culture and Plaque assay |
| Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Cell binding assay |
| Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
| PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA synthesis |
| PrimeTime qPCR Probes | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | RNA extraction |
| Sodium Bicarbonate | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Cell culture and Plaque assay |
| Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Cell binding assay |
| Tissue culture plates 24-well plate | TPP | 92024 | Cell binding assay |
| Tissue culture plates 6-well plate | TPP | 92006 | Plaque assay |
| Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Cell binding assay |
| Trypsin from porcine pancrease | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Activate for rotavirus |
| Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| Vertical 96-Well Thermal Cycler | Applied Biosystems | cDNA synthesis |
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