Summary
Her præsenterer vi to protokoller, en til at måle den specifikke vækstrate og den anden for celle-bindende evne af rotavirus ved hjælp af plaque assay og RT-qPCR. Disse protokoller er tilgængelige for at bekræfte fænotyper forskellene mellem rotavirus stammer.
Abstract
Rotavirus er den største ætiologiske faktor for infantile diarré. Det er en dobbelt-strenget (ds) RNA-virus og danner en genetisk forskellige befolkning, kendt som quasispecies, på grund af deres høje Mutationshastighed. Her, beskriver vi hvordan man kan måle den specifikke vækstrate og celle-bindende evne af rotavirus som sin fænotyper. Rotavirus er behandlet med trypsin at genkende celle receptoren og derefter inokuleres i MA104 cellekultur. Supernatanten, herunder viral descendenter, er indsamlet sporadisk. Plaque analysen bruges til at bekræfte virus titer (plak-dannende enhed: pfu) af hver indsamlet supernatanten. Den specifikke vækstrate anslås ved at montere tidsforløb data på pfu/mL, den modificerede Gompertz model. I analysen af celle-bindende er MA104 celler i en 24-godt plade inficeret med rotavirus og inkuberes i 90 min. ved 4 ° C for rotavirus adsorption til cellereceptorer. Lav temperatur når den tilbageholder rotavirus fra invaderende vært-cellen. Efter vask for at fjerne ubundne virioner, er RNA udvundet af virioner tilknyttet cellereceptorer efterfulgt af cDNA syntese og omvendt-transskription kvantitativ PCR (RT-qPCR). Disse protokoller kan anvendes for at undersøge de fænotypiske forskelle blandt viral stammer.
Introduction
RNA-vira danne en genetisk forskellige befolkning, kendt som quasispecies1, på grund af deres Mutationshastighed,2 som er højere end i DNA-baserede organismer. Befolkningsstrukturen i quasispecies påvirkes af befolkningen genetiske faktorer, herunder mutation, udvælgelse pres og genetisk drift. Stammer inden for en enkelt genetiske afstamning kan vise forskellige fænotyper på grund af den genetiske mangfoldighed. For eksempel viste Rachmadi et al., fri klor følsomhed var forskellig blandt murine norovirus stammer, der stammer fra en plaque-renset stamme S7-PP33.
Rotaviruses (slægten rotavirus i reoviridae familie) er ikke-kappebærende ds RNA virus danner quasispecies2. Ud over de befolkning genetiske faktorer beskrevet ovenfor, påvirker genom resortering den genetiske mangfoldighed af rotavirus fordi denne virus har 11 segmenterede genomer4. Rotaviruses forårsage diarré hovedsageligt blandt spædbørn, og børnedødelighed i 2013 blev anslået omkring 250.0005. To vacciner er i brug i flere lande og har været effektive til at reducere byrden af rotavirus-infektion, men nogle forskere diskuterer nu tilstedeværelsen af vaccine-undslippe mutanter6,7,8, 9. karakterisering af disse mutanter er vigtigt at forstå mekanismerne, vaccine-escape.
Vi præsenterer her, protokoller for to assays til evaluering af specifikke vækstrate og celle-bindende evne af rotavirus for at forstå de fænotypiske forskelle blandt stammer/mutanter. Vækstkurven af rotaviruses har været præsenteret i tidligere rapporter10, men vækst parametre såsom-specifik tilvækst er normalt ikke måles. En celle-bindende analyse gennemført tidligere indebærer den immunfluorescent farvning teknik11. Her viser vi lettere metoder til brug af plaque assay og RT-qPCR, som tillader os at kvantitativt diskutere forskellen i viral fænotyper. Disse metoder er hensigtsmæssige for karakterisering af rotavirus fænotyper og kan endelig bidrage til opbygningen af nye vacciner effektiv for flere genotyper.
Protocol
1. medium forberedelse
- For at gøre en cellekulturmedium (serum-holdige medium), skal du tilføje 4,7 g af Eagle's MEM pulver til 500 mL destilleret vand. Autoklave ved 120 ° C i 20 min. og lad det medium afkøle til stuetemperatur. Tilføje føtal bovint serum (endelig koncentration: 10%), L-glutamin (2 mM), Penicillin Streptomycin (1%) og natriumhydrogencarbonat (1,125 g/L). Opbevares ved 4 ° C i 1 måned.
- Forberede den serumfrit medium virus formeringsmateriale som beskrevet i trin 1.1, men uden den føtale bovint serum. Opbevares ved 4 ° C i 1 måned.
- Plaque assay, sterilisere 100 mL af Eagle's MEM medium (ikke-holdige phenol rød) ved autoklavering. Lad mediet, afkøles til stuetemperatur, og derefter tilføje 2% FBS, 2% Penicillin Streptomycin, 4 mM L-glutamin, og 2,25 g/L NaHCO3. Opbevares ved 4 ° C.
- Plaque assay, sterilisere 100 mL 2,5% agarosegel af autoklave. Forberede gelen samme dag plaque-analysen er gennemført. Gemme gel på 47 ° C i et vandbad.
2. celle kultur
- Fjerne en cryotube indeholdende MA104 cellelinjer fra objektbeholderen flydende kvælstof. Placere cryotube i et vandbad ved 37 ° C at tø cellerne. Der tilsættes 1 mL af cellesuspension til 20 mL serum, der indeholder mediet i en kolbe på T75. Inkuber kolben i et varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 eller 3 dage.
Bemærk: Den sidste celle koncentration i suspension er ca. 106 celler/mL. - Når cellen éncellelag når 80% confluency, Fjern supernatanten og cellerne vaskes to gange med 5 mL af 1 x Dulbecco's PBS (fosfatbufferet saltopløsning).
- Kolben tilsættes 4 mL 0,05% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 5 min at løsrive celler fra kolben. Overføre cellesuspension til en 15 mL rør og centrifugeres ved 190 x g i 5 min.
- Supernatanten og resuspend pelleted cellerne (106 celler) i 1 mL serum-holdige medium parat i 1.1. Fortynd de resuspenderede celler på 100 med mediet.
- Tilføj 3 mL fortyndet cellesuspension til hver brønd 6-godt (for plaque assay) eller 24-godt plader (for celle-bindende analysen), henholdsvis. Inkuber plader i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp i 2 eller 3 dage.
Bemærk: En T75 kolbe er velegnet til at indsamle tidsforløb prøver, fordi prøven rumfang supernatant (1 mL) kan ignoreres i forhold til den samlede supernatanten volumen (30 mL). I mellemtiden, smitsomme titer af virus i hver supernatanten er målt af plaque assay, der normalt gennemføres ved hjælp af en 6-godt plade. En 24-godt plade er udnyttet til celle-bindende assay.
3. specifik tilvækst af Rotavirus
Bemærk: Rhesus rotavirus (RRV, genotype: G3P[3]) er udnyttet i denne protokol, fordi RRV kan hurtigt og nemt danner plaques med MA104 celler.
- Sted et rør, der indeholder 1 mL virussuspension (107 pfu/mL) i et serumfrit medium opbevares ved-80 ° C i et vandbad ved 37 ° C til at tø. Tilsættes 1 µg/µL trypsin fra svin bugspytkirtlen 1 mL virussuspension (endelige trypsin koncentration er 4 µg/mL) og derefter vortex. Inkuber virussuspension ved 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp i 30 min.
Bemærk: Trypsin fra andre kilder kan bruges, men effekten på rotavirus smitteevne skal være testet på forhånd. - Fortyndes de aktiverede virussuspension med et serumfrit medium til at justere mangfoldigheden af infektion (MOI) til 0,1 pfu/celle.
- Tilsættes 1 mL fortyndet virussuspension til MA104 cellelinjer (80% sammenflydende) i en T75 kolben 3 dage efter cellen plating (2.1), inkuberes ved 37 ° C i 1 time og forsigtigt ryst kolben hver 15 min.
- Derefter tilsættes 30 mL af en serumfrit medium indeholdende 0,13 µg/mL trypsin fra et svin bugspytkirtlen kolben. Inkuber i kolben på 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp.
- Saml 1 mL af supernatanten i kolben på 0, 6, 12, 18, 24 og 36 (eller 48) h efter infektionen (hpi) og erstatte supernatanten i 1,5 mL rør med pipette.
- Gennemføre fryse (-80 ° C) og smelte i vandbad på 37 ° C-normalprogrammet tre gange. Derefter centrifugeres rør på 12.600 x g i 10 min. ved 4 ° C. Indsamle supernatanten.
- Filtrer supernatanten med destilleret 0,2 µm filter til at fjerne den celle fraktion. Gemme supernatanten-80 ° C i køleskabet indtil gælder plaque analyse til måling af virus titer.
- Placer de rør, der indeholder den indsamlede supernatanten (trin 3.5) i vandbad ved 37 ° C. Tilføjes en 1 mL af 10-fold fortyndede prøve 4 µg/mL trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
- Under 30 min inkubation i 3,8, til at begynde plaque analyse til måling af virus titer fremstillet af tid kursus prøver (trin 3.5), MA104 cellerne vaskes to gange i en 6-godt plade med 2 mL 1 x PBS efter fjernelse af serum-holdige medium.
- Seriefremstillede fortyndes de rugede prøver med et serumfrit medium og podes 1 mL af det fortyndede prøve i hver brønd. Inkuber plade for 90 min. ved 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp, og Ryst forsigtigt plade hver 15 min.
- Efter inkubation, skal du fjerne inokulat fra 6-godt plade. Tilføj 4 µg/mL trypsin til medium forberedt i (trin 1.3). Forsigtigt men straks tilføje 3 mL af substratet blandet med agarosegel (forholdet er 1:1) til hver brønd.
- Holde pladen ved stuetemperatur i mere end 10 min (indtil agarosegel bliver fast), og der inkuberes i 2 dage ved 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp.
Bemærk: Hæld medium blandet med agar fra kanten af brønden. - Der tilsættes 1 mL af 0.015% neutral rød opløsningen fortyndes med 1 x PBS i hvert hul, og der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp. Fjerne farven efter 3 h og inkuberes i 1 dag på 37 ° C og 5% CO2 under mættet damp.
- Den næste dag, tælle antallet af plaques i hver brønd og beregne pfu/mL. Nøje kontrollere celle sammenløbet før plaque analysen at forsikre plaque numre.
4. celle-bindende Assay
Bemærk: Denne protokol er baseret på Gillings rapport13.
- Tilføje 1 µg/µL trypsin fra et svin bugspytkirtlen til 1 mL virussuspension (endelige trypsin koncentration er 4 µg/mL) og derefter vortex (på samme måde som 2.1). Fortynd virussuspension med et serumfrit medium til at justere MOI 1 pfu/celle.
- Derefter, vaske MA104 cellerne to gange på 24-godt plade med 1 ml af Tris-bufferet saltvand (TBS; 2,53 g/L Tris base, 6,54 g/L NaCl, 0,3 g/L KCl, 0.046 g/l Na2HPO4 til 1 L med destilleret vand).
- Podes 100 µL fortyndede virussuspension til hver brønd med en 24-godt plade med celler, og der inkuberes ved 4 ° C til 90 min, med blid ryster hver 15 min.
- Fjern virus inokulum og cellerne vaskes to gange med 1 mL af TBS. Hen til uddrag dobbelt-strenget (ds) RNA af rotavirus, tilføje 140 µL 1 x PBS og 560 µL af RNA ekstraktionsbuffer (Se Tabel af materialer) til hver brønd. Bland tilstrækkeligt med en pipette (omkring 10 x, eller indtil DIS eller forurenende stof i celler i bufferen ikke er set).
- Efter at inddrive den dobbelt strandede RNA (dsRNA) efter producentens protokol, placere de 1,5 mL rør indeholdende dsRNA ekstrakt på en varme blok ved 95 ° C i 5 min at denaturere dsRNA, og derefter straks sted rør på is og Inkuber i mere end 2 min.
- Syntetisere cDNA ved hjælp af en reverse transkription kit (Se Tabel af materialer). Tilføje 4 µL af denatureret viral RNA løsning til en PCR rør indeholdende 16 µl af blanding (tabel 1) og bland det forsigtigt med en pipette for ikke at generere bobler. Spin ned rørene.
- Udføre reverse transkription med en termisk cycler under den betingelse, der er vist i tabel 2. Hvis cDNA ikke anvendes straks, gemme PCR rør indeholdende cDNA ved-20 ° C i op til 1 år.
- Bruge primere for kvantitativ PCR (fremad 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3' omvendt; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 og en sonde, indsætte en quencher (qPCR sonder; 5'- / FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA /-3'), rettet mod den 963 – 1049 region af NSP3 genom segment af rotavirus (ST3 stamme, GenBank: X81436).
Bemærk: Quencher indsættes i sonden designet af Zeng et al.14 - Fortynd den standard plasmid seriefremstillede (101 106 eksemplarer/ml) med PCR-klasse vand til qPCR blanding (tabel 3) og gøre det master mix (20 µL/prøve) for qPCR efter tabel 4.
- Tilføj 20 µL af den master mix til en 96-brønd PCR plade fordybning, og derefter blande 5 µL cDNA prøver eller 5 µL af den standard plasmid af pipettering 10 gange. Start reaktion af qPCR systemet ifølge de betingelser, der er vist i tabel 4.
- For at beregne rotavirus genom bundet til MA104 celle overflade, udføre lineær regression mellem Ct værdier og kendte genom antallet af en standard plasmid, og anslå genom prøvenummer. Derefter beregne forholdet mellem virion numre binding til celler (Gt) til dem i den indledende inokulum (G0).
Representative Results
En oversigt over to protokoller for specifikke vækstrate og celle-bindende assay af plaque-renset RRV stammer er vist i figur 1A og 2A, henholdsvis.
I analysen for de specifikke vækstrate når den endelige virus titer mere end 107 pfu/mL når formeringsmateriale på T75 kolben. Hvis den maksimale koncentration er lavere end 107 pfu/mL, MA104 cellen kan ikke være blevet Konfluerende eller RRV blev ikke aktiveret godt af trypsin. Nogle vækst modeller er til rådighed til vurdering af den specifikke vækstrate ved hjælp af den smitsomme enhedsdataene. I denne protokol, er de modificerede Gompertz model12 ansat som eksempel;
hvor N0 (104 pfu/mL i denne undersøgelse) og Nt (104 til 108 pfu/mL) er den virus smitsom titer (pfu/mL) på 0 og t (eksempel: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, henholdsvis A er den asymptotiske værdi [log (N∞/n0 )] (eksempel: 3-4), μ er den specifikke vækstrate [1/h], e er Napiers konstant og λ er den mellemliggende periode [h]. Model parametre er fremstillet af funktionen Problemløser af analysesoftwaren, der minimerer summen af kvadrater af differencen mellem de observerede og modelleret. I eksemplet i figur 1B, den specifikke vækstrate (µ) skønnes for at være 0.197 [1/h] og den mellemliggende periode (λ) er 6.61 [h] ved at anvende de mindste kvadraters metode til en modificeret Gompertz model, og relative virus titer på den stationære fase til den indledende titer ( Log skala) (A) er 3.15 [log (N∞/n0)]. Vi har testet 6 rotavirus kloner i alt, og de anslåede værdier af den specifikke vækstrate varierede fra 0,19 til 0,27 [1/h]. Disse anslået værdier er pålidelige, fordi bestemmelse værdier i model fitting lig mere end 0,98.
RRV virioner binding til celle overflader var omkring 103 kopier/mL (bindende effektivitet var omkring 1%) ved hjælp af en 24-godt plade til celle-bindende assay (figur 2B). Analysen foregår normalt tre gange for hver prøve, og hvis en stor varians i kopi nummer er observeret i en prøve, kan opstå nogle problemer såsom over vask og utilstrækkelig aktivering af RRV af trypsin. Ct værdi af qPCR overstiger ca 36,0 er ikke at foretrække og anses for at være under en detektionsgrænse i vores qPCR tilstand.
| Volumen / 1 reaktion | |
| 5 x PrimeScript Buffer | 4.0 ΜL |
| PrimeScript RT enzym Mix jeg | 1,0 ΜL |
| Oligo dT Primer | 1,0 ΜL |
| Tilfældige 6 mers | 4.0 ΜL |
| Ionbyttet destilleret vand | 6,0 ΜL |
| ssRNA prøven | 4.0 ΜL |
| I alt | 20,0 ΜL |
Tabel 1: Master mix sammensætning for cDNA syntese af rotavirus genom.
| Temperatur [° C] | Tid |
| 37 | 15 min |
| 42 | 15 min |
| 85 | 5 s |
| 4 | ∞ |
Tabel 2: Reaktion betingelse for cDNA syntese af rotavirus genom.
| Volumen/1 reaktion | |
| Premix Taq | 12,5 ΜL |
| Videresende primer (10 µM) | 0,5 ΜL |
| Omvendt primer (10 µM) | 0,5 ΜL |
| Sonden (10 µM) | 0,5 ΜL |
| Reference farvestof II | 0,5 ΜL |
| Ionbyttet destilleret vand | 5.5 ΜL |
| cDNA prøve | 5.0 ΜL |
| I alt | 25 ΜL |
Tabel 3: Master mix sammensætning for kvantitativ PCR af rotavirus et genom.
| Temperatur [° C] | Tid | |
| 95 | 5 min | |
| 94 | 20 s | 45 cyklus |
| 60 | 1 min | |
| 72 | 5 min |
Tabel 4: Reaktion betingelse for kvantitativ PCR af rotavirus et genom.
Figur 1: skematisk oversigt over vurdering af rotavirus vækst og vækstkurven af rotavirus. (A) de smitsomme enhed af rotavirus måles med plaque assay. (B) kurve (blå linje) var en indbyrdes tilnærmelse af den modificerede Gompertz model baseret på observerede data i vores laboratorium (hvid cirkel). Den specifikke vækstrate [µ]; 0.197 [h-1], mellemliggende periode (λ); 6.61 [h], relative virus titer på den stationære fase til den indledende titer (log skala) (en); 3.15 [log (N∞/n0)]. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk oversigt og repræsentativt resultat af celle-bindende analysen af fem RRV stammer renset fra plaques i vores laboratorium. (A) A celle kultur plade podet med rotavirus er inkuberes ved 4 ° C for hæmme virus invasion i celler. Efter inkubation og fjerne de ubundne viruspartikler til celler, kvantificere antallet af genomer stammer fra bundne viruspartikler til cellens overflade med RT-qPCR. (B) et resultat af celle-bindende assay blev vist som bindende effektivitet (%), som var forholdet mellem bundne viruspartikler til de tilstedeværende i inokulat. Fed bar: median, slutningen af kasser: kvartil afvigelse, slutningen af linjen: maksimums- og minimumsmængder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vores protokol til måling af de specifikke vækstrate er lettere end tidligere og kan tilpasses til andre vira, medmindre deres celle kultur system endnu ikke er blevet etableret. I denne undersøgelse, brugte vi RRV (G3P[3]) fordi denne stamme kan danne plaques lettere end menneskelige rotaviruses når du bruger MA104 cellelinjer. Nogle menneskelige rotavirus stammer ikke kan danne plak i denne cellelinje. Derfor, i stedet for analysen plaque fokus danner enhed (FFU) assay15 eller median vævskultur infektiøse dosis (TCID50) analysen kan anvendes til mange rotavirus stammer16. Den præsenterede protokol til bestemmelse af de specifikke vækstrate kan bruges til andre virustyper men er ikke egnet til vira som ingen etableret celle kultur system er etableret. Før du starter eksperimentet for den specifikke vækstrate, det er bedre at vide på forhånd, når virus smitsom titer begynder at stige og når den stationære fase i en foreløbig prøve. Hvis for mange plaques er til stede, bør plaque analysen udføres igen efter skiftende fortynding satsen af virus prøver. Timer efter infektionen (hpi) til at indsamle prøver er også vigtige, fordi hældningen af den eksponentielle vækstfase kan være undervurderet, hvis den rette tidspunkt at nå frem til den stationære fase er savnet. I tilnærmelsen af den modificerede Gompertz model, bør en determinationskoefficienten altid beregnet og tjekket. Hvis fitness til den modificerede Gompertz model er lav, kan andre vækst modeller såsom modificeret logistisk model12 være at foretrække.
I håndtering celler, når du fjerner medium eller virus inokulat, skal PBS for vask eller Agarosen gel for plaque assay straks tilføjet til hver godt af en celle kultur plade til at forhindre celler fra tørhed. På samme tid, skal du forsigtigt hældes PBS eller Agarosen celler ikke at løsrive fra brøndene. Dette trin er det vigtigste i begge assays (trin 3,9 og 3.11). Hvis plak analysen har for mange prøver, anbefaler vi inddele agarosegel (100 mL hver maksimalt anbefales) i flere mellemstore flasker og holde flaskerne varme indtil lige før brug siden Agarosen gel er størknet i ca 10 min på værelse temperatur. Da trypsin er sårbare over for høje temperaturer17, bør en trypsin løsningen føjes til en medium og Agarosen for plaque analysen efter passende afkøling.
I celle-bindende assay, skal inkubation i virus binding til celler gøres ved 4 ° C at forhindre invasion af celler. Ifølge Gillings metode13er celler tilbøjelige til tørring ved lave temperaturer, så blid ryster er nødvendigt hvert 15 min under inkubation. RNA udvinding kit udnyttet her kan erstatte andre kits. Hældningen af standardkurven i RT-qPCR bør være ca 3.3, og determinationskoefficienten bør være mere end 0,98. I forhold til fluorescens mikroskop til at visualisere lokalisering af virus i celler, er analysen hurtigere og nemmere at bruge fordi binding af fluorescerende stoffer til vira ikke er nødvendigt.
For nylig, menneskelige tarm enteroid (HIE), udviser en lignende cellulære sammensætning og funktion som menneskelige mave-tarm epitel, er blevet tilgængelig for rotavirus formering18. Brugen af HIE kan gøre det muligt at evaluere de specifikke vækstrate og celle-bindende evne til ikke-bestemmelse stammer af rotavirus. Også, begge forsøg beskrives her kan anvendes til evaluering af narkotika virkninger på begge fænotyper19. Protokollerne præsenteres her gøre det muligt at kvantitativt diskutere ændringer i fænotype parameterværdier af rotavirus stammer under varierede forhold.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af "The sanitet værdi kæden: designe sanitet systemer som Eco-værdi fællesskabssystemet" projekt, forskningsenhed for menneskeheden og naturen (RIHN, projekt No.14200107).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | qPCR | |
| Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Plaque assay |
| Disodium Hydrogenphosphate | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Cell binding assay |
Eagle's MEM "Nissui"  |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Cell culture |
Eagle's MEM "Nissui"  |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Plaque assay |
| EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture |
| Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 10437028 | Cell culture and Plaque assay |
| Forward / Reverse primers | Eurofins Genomics | qPCR | |
| L-Glutamine, 200 mM Solution | Gibco | 2530081 | Cell culture and Plaque assay |
| Neutral Red | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Plaque assay |
| PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Cell culture and Plaque assay |
| Penicillin-Streptomycin, Liguid | Gibco | 15140122 | Cell culture and Plaque assay |
| Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Cell binding assay |
| Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
| PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA synthesis |
| PrimeTime qPCR Probes | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | RNA extraction |
| Sodium Bicarbonate | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Cell culture and Plaque assay |
| Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Cell binding assay |
| Tissue culture plates 24-well plate | TPP | 92024 | Cell binding assay |
| Tissue culture plates 6-well plate | TPP | 92006 | Plaque assay |
| Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Cell binding assay |
| Trypsin from porcine pancrease | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Activate for rotavirus |
| Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| Vertical 96-Well Thermal Cycler | Applied Biosystems | cDNA synthesis |
References
- Domingo, E. Rna Virus Mutations. Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).
- Gouvea, V., Brantly, M. Is rotavirus a population of reassortants? Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).
- Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).
- Ghosh, S., Kobayashi, N. Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects. Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. 2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).
- Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines. Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).
- Santos, N., Hoshino, Y. Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine. Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).
- Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread. Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).
- Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland. Vaccine. 35, 156-163 (2017).
- Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins. Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).
- Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells. Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).
- Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).
- Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis. Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).
- Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition. Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).
- Brüssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis. Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).
- Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O., Willassen, N. P. Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin. Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).
- Saxena, K., Blutt, S. E., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).
- Yin, Y., Bijvelds, M., et al. Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids. Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).
