Summary
Här presenterar vi två protokoll, en för att mäta den specifika tillväxttakten och den andra för rotavirus med hjälp av plack assay och RT-qPCR cell-bindande förmåga. Dessa protokoll finns tillgängliga för att bekräfta skillnaderna i fenotyper mellan rotavirus stammar.
Abstract
Rotavirus är den viktigaste etiologiska faktorn för infantil diarré. Det är en dubbelsträngat (ds) RNA-virus och bildar en genetiskt olika befolkning, känd som quasispecies, på grund av deras höga mutationshastighet. Här, beskriver vi hur man mäter specifika tillväxttakten och cell-bindande möjligheten av rotavirus som dess fenotyper. Rotavirus är behandlade med trypsin att erkänna cell receptorn och sedan inokuleras i MA104 cellkultur. Supernatanten, inklusive viral avkommor, samlas in periodvis. Plack analysen används för att bekräfta virus titern (plaque-forming unit: pfu) av varje insamlade supernatanten. Den specifika tillväxten uppskattas av passande tid-bandata pfu/ml till den modifierade Gompertz modellen. I analysen av cell-bindande, är MA104 celler i en 24-well platta infekterade med rotavirus och inkuberas i 90 minuter vid 4 ° C för rotavirus adsorption till cellreceptorer. En låg temperatur hindrar rotavirus från invaderande värdcellen. Efter tvättning för att avlägsna obunden virioner, ur RNA virioner bifogas cellreceptorer följt av cDNA syntes och omvänd-Transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR). Dessa protokoll kan användas för att utreda de fenotypiska skillnaderna mellan virusstammar.
Introduction
RNA-virus utgör en genetiskt olika population, känd som quasispecies1, på grund av deras mutationshastighet,2 som är högre än för DNA-baserade organismer. Befolkningsstruktur i quasispecies påverkas av befolkningens genetiska faktorer, inklusive mutation, selektionstryck och genetisk drift. Stammar inom en enda genetiska härstamning kan visa olika fenotyper på grund av den genetiska mångfalden. Rachmadi et al. visade till exempel att fritt klor känslighet var annorlunda bland murina norovirus stammar som härstammar från en plack-renat stam S7-PP33.
Rotavirus (släkte rotavirus i reoviridae familj) är icke-höljebärande ds RNA virus bildar quasispecies2. Utöver befolkningen genetiska faktorer som beskrivs ovan, påverkar genomet genvariation den genetiska mångfalden av rotavirus eftersom detta virus har 11 segmenterade genomen4. Rotavirus orsakar diarré främst bland spädbarn och spädbarn dödsfall i 2013 uppskattades ca 250.0005. Två vacciner används i flera länder och har varit effektiva för att minska bördan av rotavirusinfektion, men vissa forskare nu diskuterar förekomsten av vaccinet-escape mutants6,7,8, 9. karakterisering av dessa mutanter är viktigt att förstå mekanismerna som vaccin-escape.
Här presenterar vi protokoll för två analyser för utvärdering av tillväxthastighet och cell-bindande förmåga av rotavirus för att förstå de fenotypiska skillnaderna bland stammar/mutanter. Tillväxtkurvan av rotavirus har presenterats i tidigare rapporter10, men tillväxten parametrar såsom tillväxthastighet mäts inte vanligtvis. En cell-bindande analysen genomförs innebär tidigare Immunofluorescerande färgning teknik11. Vi visar här enklare metoder för att använda den plack assay och RT-qPCR, som tillåter oss att kvantitativt diskutera skillnaden i viral fenotyper. Dessa metoder är lämpliga för karakterisering av rotavirus fenotyper och kan slutligen bidra till byggandet av nya vacciner effektivt för flera genotyper.
Protocol
1. medium förberedelse
- För att göra en cellodlingsmedium (serum-innehållande medium), tillsätt 4,7 g örnens MEM pulver till 500 mL destillerat vatten. Autoklav vid 120 ° C i 20 min och låt den medelstora svalna till rumstemperatur. Lägg till fostrets bovint serum (slutlig koncentration: 10%), L-glutamin (2 mM), Penicillin Streptomycin (1%) och natriumbikarbonat (1,125 g/L). Förvaras vid 4 ° C i 1 månad.
- Förbereda serumfritt medium för virus förökning som beskrivs i steg 1.1, men utan den fetala bovint serumen. Förvaras vid 4 ° C i 1 månad.
- För plack analysen, sterilisera 100 mL örnens MEM medium (icke-innehållande fenol röd) i autoklav. Låt medlet svalna till rumstemperatur, och sedan lägga till 2% FBS, 2% Penicillin Streptomycin, 4 mM L-glutamin och 2,25 g/L NaHCO3. Förvaras vid 4 ° C.
- För plack analysen, sterilisera 100 mL 2,5% agarosgel av autoklav. Förbereda gelen samma dag plack analysen utförs. Lagra gelen på 47 ° C i ett vattenbad.
2. cellkultur
- Ta bort en cryotube som innehåller MA104 cellinjer från behållaren med flytande kväve. Placera cryotube i ett vattenbad vid 37 ° C Tina cellerna. Tillsätt 1 mL cellsuspension till 20 mL serum-innehållande mediet i en T75 kolv. Inkubera kolven i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2 i 2 eller 3 dagar.
Obs: Slutliga cellkoncentrationen i suspensionen är cirka 106 celler/mL. - När den cell enskiktslager når 80% konfluens, avlägsna supernatanten och tvätta cellerna två gånger med 5 mL av 1 x Dulbecco's PBS (fosfatbuffrad saltlösning).
- Tillsätt 4 mL 0,05% trypsin-EDTA till kolven och inkubera vid 37 ° C i 5 min till lossa cellerna från kolven. Överföra cellsuspensionen till en 15 mL rör och centrifugera vid 190 x g under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleterat cellerna (106 celler) i 1 mL serum-innehållande medium beredda i 1.1. Späd de återsuspenderade cellerna på 100-fold med mediet.
- Tillsätt 3 mL av den utspädda cellsuspensionen till varje brunn 6-väl (för plack analysen) eller 24 brunnar (för cell-bindande analysen), respektive. Inkubera plattorna i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga i 2 eller 3 dagar.
Obs: En T75-kolv passar att samla in proverna som tid-kurs eftersom provvolymen av supernatanten (1 mL) kan ignoreras jämfört med den totala supernatant volymen (30 mL). Under tiden mäts den smittsam titern av viruset i varje supernatanten genom den plack-test, som utförs vanligtvis med en 6-bra platta. En 24-well platta utnyttjas för cell-bindande analysen.
3. särskilda tillväxttakten av Rotavirus
Obs: Rhesus rotavirus (RRV, genotyp: G3P[3]) utnyttjas i detta protokoll eftersom RRV kan snabbt och enkelt bilda plack med MA104 celler.
- Plats en tub innehållande 1 mL virus suspensionen (107 pfu/mL) i ett serumfritt medium lagras vid-80 ° C i ett vattenbad vid 37 ° C Tina. Tillsätt 1 µg/µL trypsin från svin bukspottkörteln till 1 mL av virussuspension (slutliga trypsin koncentration är 4 µg/mL) och sedan vortex. Inkubera virus suspensionen vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga för 30 min.
Obs: Trypsin från andra källor kan användas, men effekten på rotavirus smittsamhet måste testas i förväg. - Späd med aktiverat virus fjädringen med ett serumfritt medium att justera multiplicityen av infektion (MOI) till 0.1 pfu/cell.
- Tillsätt 1 mL utspädd virussuspension till MA104 cellinjer (80% konfluenta) i en T75 kolv 3 dagar efter cellen plätering (2.1), inkubera vid 37 ° C i 1 h och försiktigt skaka kolven varje 15 min.
- Lägg sedan till 30 mL ett serumfritt medium innehållande 0.13 µg/mL av trypsin från en svin bukspottkörtel till kolven. Inkubera kolven vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga.
- Samla in 1 mL av supernatanten i kolven vid 0, 6, 12, 18, 24 och 36 (eller 48) h efter infektion (hpi) och ersätta supernatanten i 1,5 mL rör med pipett.
- Genomför frysningen (-80 ° C) och smälter i ett vattenbad vid 37 ° C cykel tre gånger. Sedan Centrifugera rören vid 12.600 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Samla in supernatanten.
- Filtrera supernatanten med destillerat 0,2 µm filter att ta bort den cell-fraktionen. Lagra supernatanten-80 ° C i kylskåpet tills tillämpa det på plack analysen för att mäta virus titern.
- Placera rören som innehåller insamlade supernatanten (steg 3.5) i vattenbad vid 37 ° C. Tillsätt 4 µg/mL trypsin till en 1 mL 10-faldig utspädda provet och inkubera vid 37 ° C i 30 min.
- Under 30 min inkubering i 3,8, börja tvätta plack analysen för att mäta virus titern erhållits från tid kursen (steg 3.5), MA104 cellerna två gånger i en 6-well platta med 2 mL 1 x PBS efter ta bort mediet som innehåller serum.
- Seriellt späd ruvade proverna med ett serumfritt medium och Inokulera 1 mL av det utspädda provet i varje brunn. Inkubera plattan för 90 min vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga, och skaka försiktigt plattan varje 15 min.
- Efter inkubation, ta bort inokulatet från 6-väl plattan. Lägga till 4 µg/mL trypsin till medium bereddes i (steg 1.3). Försiktigt men omedelbart tillsätts 3 mL av det medium som blandas med agarosgel (förhållandet är 1:1) till varje brunn.
- Förvara plattan i rumstemperatur för mer än 10 min (tills agarosgel blir fast) och Inkubera under 2 dagar vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga.
Obs: Häll det medium som blandas med agar från kanten av brunnen. - Tillsätt 1 mL av 0,015% neutral röd lösningen späds med 1 x PBS till varje brunn och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga. Ta bort färgen efter 3 h och inkubera i 1 dag vid 37 ° C och 5% CO2 under mättad ånga.
- Nästa dag, räkna antalet plack i varje brunn och beräkna den pfu/mL. Kontrollera noga cell sammanflödet innan plack analysen att försäkra plack siffrorna.
4. cell-bindande Assay
Obs: Detta protokoll baseras på Gillings rapport13.
- Lägg till 1 µg/µL trypsin från en svin bukspottkörteln 1 ml av virussuspension (slutliga trypsin koncentration är 4 µg/mL) och sedan vortex (på samma sätt som i 2.1). Späd med virus fjädringen med ett serumfritt medium att justera MOI av 1 pfu/cell.
- Sedan tvätta MA104 cellerna två gånger på 24-väl tallrik med 1 ml Tris-buffrad koksaltlösning (TBS; 2,53 g/L Tris basera, 6.54 g/L NaCl, 0,3 g/L KCl, 0.046 g/l Na2HPO4 för att nå 1 L med destillerat vatten).
- Inokulera 100 µL utspädda virussuspension till varje brunn 24-well platta med celler, och inkubera vid 4 ° C i 90 minuter med varsam skakning varje 15 min.
- Ta bort det virus inokulatet och tvätta cellerna två gånger med 1 mL av TBS. För att extrahera dubbelsträngat (ds) RNA av rotavirus, lägga till 140 µL 1 x PBS och 560 µL av RNA extraktion bufferten (se Tabell för material) till varje brunn. Blanda tillräckligt med pipett (ca 10 x eller tills den haze eller förorening av celler i bufferten inte är sett).
- När du har återställt den dubbelsträngat RNA (dsRNA) enligt tillverkarens protokollet, placera de 1,5 mL rör som innehåller dsRNA extraktet på en värme block vid 95 ° C i 5 min att denaturera dsRNA, och sedan omedelbart placera rören på is och inkubera i mer än 2 min.
- Syntetisera cDNA med hjälp av en omvänd Transkription kit (se Tabell för material). Tillsätt 4 µL denaturerat viral RNA lösning i en PCR-rör som innehåller 16 µl av blandning (tabell 1) och blanda försiktigt med en pipett för att inte generera bubblor. Snurra ner rören.
- Utföra omvänd Transkription med en termocykel på villkor som anges i tabell 2. Om cDNA inte används omedelbart, lagra PCR-röret som innehåller cDNA vid-20 ° C upp till 1 år.
- Använda primers för kvantitativ PCR (framåt; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', omvänd; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 och en sond att infoga en törstsläckare (qPCR sonder; 5'- / FAM/ATGAGCACA/törstsläckare/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA /-3'), inriktning i 963 – 1049 regionen av NSP3 genomet segment av rotavirus (ST3 stam, GenBank: X81436).
Obs: Törstsläckare sätts in sonden designad av Zeng et al.14 - Späd standard plasmiden seriellt (101 106 kopior/ml) med PCR grade vatten till qPCR blandningen (tabell 3) och göra huvudmixen (20 µL/prov) för qPCR efter tabell 4.
- Tillsätt 20 µL av master mix i brunnen av en PCR-plattan med 96 brunnar och sedan blanda 5 µL av cDNA prover eller 5 µL standard plasmiden genom pipettering 10 gånger. Starta reaktionen av qPCR systemet enligt de villkor som framgår av tabell 4.
- För att beräkna rotavirus genomet bunden till MA104 cellytan, genomföra linjär regression mellan Ct-värden och antalet kända genomet från en standard plasmid och uppskatta provets genomet nummer. Sedan beräkna förhållandet mellan virion nummer bindningen till celler (Gt) till dem i den ursprungliga inokulatet (G0).
Representative Results
En översikt av två protokoll för tillväxthastighet och cell-bindande haltbestämning av plack-renat RRV stammar visas i figur 1A och 2A, respektive.
I analysen för specifika tillväxttakten når slutliga virus antikroppnivåns mer än 107 pfu/mL när förökningsmaterial på T75 kolven. Om den maximala koncentrationen är lägre än 107 pfu/mL, MA104 cellen kan inte ha blivit konfluenta eller RRV aktiverades inte väl av trypsin. Vissa tillväxtmodeller finns för att uppskatta särskilda tillväxttakten med hjälp av infektiös enhetsdata. I detta protokoll, är den modifierade Gompertz modell12 anställd som exempel;
där N0 (104 pfu/mL i denna studie) och Nt (104 108 pfu/ml) är den virus smittsam titern (pfu/mL) vid 0 och t (exempel: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, respektive A är det asymptotiska värdet [logg (N∞/N0 )] (exempel: 3 till 4), µ är den specifika tillväxttakten [1/h], e är den Napiers konstant och λ är perioden fördröjning [h]. Modellparametrar erhålls genom funktionen Problemlösaren av programvaran analys, vilket minimerar summan av kvadraten på skillnaden mellan observerade och modellerade värden. I exemplet i figur 1Bspecifikt tillväxttakten (µ) uppskattas till 0.197 [1/h] och perioden fördröjning (λ) är 6.61 [h] genom att tillämpa metoden minst kvadrat till en modifierad Gompertz modell, och den relativa virus titern på den stationära fasen till den ursprungliga titer ( log skala) (A) är 3,15 [logg (N∞/N0)]. Vi har testat 6 rotavirus kloner sammanlagt, och de uppskattade värdena för den specifika tillväxttakten varierade från 0,19 till 0,27 [1/h]. Dessa beräknade värden är tillförlitlig eftersom koefficienten för bestämning värden i modell tillbehöret är mer än 0,98.
RRV virioner binda till cellytan var cirka 103 kopior/mL (bindande effektivitet var omkring 1%) när du använder en 24-well platta för cell-bindande analysen (figur 2B). Analysen utförs vanligtvis tre gånger för varje prov, och om en stor varians i kopienumret observeras i ett prov, vissa problem såsom över tvätt- och otillräckliga aktivering av RRV av trypsin kan förekomma. Ct värdet av qPCR överstiger ungefär 36,0 är inte att föredra och anses vara nedanför en detektionsgräns i vår qPCR skick.
| Volym / 1 reaktion | |
| 5 x PrimeScript buffert | 4.0 ΜL |
| PrimeScript RT enzym blanda jag | 1,0 ΜL |
| Oligo dT Primer | 1,0 ΜL |
| Slumpmässiga 6 mers | 4.0 ΜL |
| Avjoniserat vatten | 6,0 ΜL |
| ssRNA prov | 4.0 ΜL |
| Totalt | 20,0 ΜL |
Tabell 1: Master blanda sammansättning för cDNA syntes av rotavirus genomet.
| Temperatur [° C] | Tid |
| 37 | 15 min |
| 42 | 15 min |
| 85 | 5 s |
| 4 | ∞ |
Tabell 2: Reaktion villkor för cDNA syntes av rotavirus genomet.
| Volym/1 reaktion | |
| Premix Taq | 12.5 ΜL |
| Forward primer (10 µM) | 0,5 ΜL |
| Reverse primer (10 µM) | 0,5 ΜL |
| Sonden (10 µM) | 0,5 ΜL |
| Referens Dye II | 0,5 ΜL |
| Avjoniserat vatten | 5.5 ΜL |
| cDNA prov | 5.0 ΜL |
| Totalt | 25 ΜL |
Tabell 3: Master blanda sammansättning för kvantitativa PCR av rotavirus en arvsmassa.
| Temperatur [° C] | Tid | |
| 95 | 5 min | |
| 94 | 20 s | 45 cykel |
| 60 | 1 min | |
| 72 | 5 min |
Tabell 4: Reaktion villkor för kvantitativ PCR för rotavirus en arvsmassa.
Figur 1: Schematisk översikt av uppskattningen av rotavirus tillväxt och tillväxtkurvan av rotavirus. (A), infektiös enheten av rotavirus mäts med plack-analys. (B) kurvan (blå linje) approximerades av modifierade Gompertz modell baserat på observerade data i vårt laboratorium (vita cirklar). Den specifika tillväxttakten [µ]; 0.197 [h-1], släpa period (λ); 6.61 [h], relativa virus titern på den stationära fasen till ursprungliga titern (logaritmisk skala) A. 3.15 [logg (N∞/N0)]. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk översikt och representativa resultat av cell-bindande analysen av fem RRV stammar renats från plack i vårt laboratorium. (A) A cell kultur plattan inokuleras med rotavirus inkuberas vid 4 ° C för att hämma virus invasionen in i cellerna. Efter inkubation och ta bort de obundna viruspartiklarna till celler, kvantifiera antalet genomen med ursprung från bundna viruspartiklar till cellytan med RT-qPCR. (B) resultatet av cell-bindningen assay visades som bindande effektivitet (%), vilket var förhållandet mellan bundna viruspartiklar att de närvarande i inokulatet. Fet bar: medianvärde, slutet av lådor: kvartil avvikelse, slutet av raden: maximum och minimum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Våra protokoll för mätning av den specifika tillväxttakten är lättare än tidigare och kan anpassas för andra virus såvida deras cellodlingssystem inte har ännu fastställts. I denna studie använde vi RRV (G3P[3]) eftersom denna stam kan bilda plack lättare än humant rotavirus när du använder MA104 cellinjer. Vissa humant rotavirus stammar kan inte bilda plack i denna cellinje. Därför i stället för plack analysen, kan fokus bildar (FFU) analys15 eller median vävnadsodling smittsamma enhetsdos (TCID50) analys tillämpas för många rotavirus stammar16. Presenterade protokollet för att fastställa specifika tillväxt kan användas för andra virustyper men är inte lämplig för virus för vilka inga etablerade cellodlingssystem är etablerad. Innan du börjar experimentet för specifika tillväxten, det är bättre att veta i förväg när viruset smittsamt titern börjar öka och når den stationära fasen i ett preliminärt test. Om det finns alltför många plack bör plack analysen utföras igen efter att ha ändrat spädning av de virus proverna. Timmar efter infektionen (hpi) att samla in prover är också viktiga eftersom lutningen på exponentiella tillväxtfasen kan underskattas om den rätta tidpunkten att nå den stationära fasen är missat. Genom en tillnärmning av den modifierade modellen Gompertz, bör alltid en determinationskoefficienten beräknas och kontrolleras. Om lämplighet att modifierade Gompertz modellen är låg, kan andra tillväxtmodeller såsom den modifierade logistiska modell12 vara att föredra.
Vid hantering av celler, när du tar bort det medium eller virus inokulatet, PBS för tvättning eller agaros gel för plack assay omgående måste läggas till varje väl av en cell kultur plattan att förhindra celler från torrhet. Samtidigt, måste du försiktigt hälla PBS eller agaros till celler inte att lossna från brunnar. Detta steg är det viktigaste i båda analyser (steg 3.9 och 3.11). Om plack analysen har alltför många prover, rekommenderar vi dela upp agarosgel (100 mL varje maximalt rekommenderas) i flera medelstora flaskor och varmhållning flaskorna förrän strax före användning sedan agaros gel är stelnat ca 10 min. på room temperatur. Eftersom trypsin är utsatta för höga temperaturer17, bör en trypsin-lösning läggas till ett medium och agarosgelelektrofores för plack analysen efter adekvat nedkylning.
I cell-bindande analysen, måste inkubationstiden för virus bindning till celler göras vid 4 ° C att förhindra invasionen av cellerna. Enligt Gillings metod13är cellerna benägna att torka vid låga temperaturer, så varsam skakning är nödvändigt varje 15 min under inkubation. I RNA extraktion kit utnyttjas här kan ersätta andra kit. Lutningen på standardkurvan i RT-qPCR bör vara cirka 3,3 och determinationskoefficienten bör vara mer än 0,98. Analysen jämfört med fluorescens Mikroskop att visualisera localizationen av virus i celler, och är snabbare och enklare att använda eftersom bindningen av fluorescerande ämnen att virus inte är nödvändigt.
Nyligen, human intestinal enteroid (HIE), uppvisar en liknande cellulära sammansättning och funktion som mänskliga mag epitel, blivit tillgänglig för rotavirus förökning18. Användning av HIE kan göra det möjligt för oss att utvärdera tillväxthastighet och cell-bindande förmåga av icke-odlingsbara stammar av rotavirus. Också, båda experimenten som beskrivs här kan tillämpas på utvärdering av läkemedelseffekter på båda fenotyper19. De protokoll som presenteras här gör det möjligt att kvantitativt diskutera förändringar i fenotyp parametervärdena för rotavirus stammar under varierande förhållanden.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ”sanitet värde kedjan: designa sanitet system som Eco-Community värde systemet” projekt, ResearchInstitute för mänskligheten och naturen (RIHN, projektet No.14200107).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | qPCR | |
| Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Plaque assay |
| Disodium Hydrogenphosphate | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Cell binding assay |
Eagle's MEM "Nissui"  |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Cell culture |
Eagle's MEM "Nissui"  |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Plaque assay |
| EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture |
| Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 10437028 | Cell culture and Plaque assay |
| Forward / Reverse primers | Eurofins Genomics | qPCR | |
| L-Glutamine, 200 mM Solution | Gibco | 2530081 | Cell culture and Plaque assay |
| Neutral Red | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Plaque assay |
| PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Cell culture and Plaque assay |
| Penicillin-Streptomycin, Liguid | Gibco | 15140122 | Cell culture and Plaque assay |
| Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Cell binding assay |
| Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
| PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA synthesis |
| PrimeTime qPCR Probes | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | RNA extraction |
| Sodium Bicarbonate | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Cell culture and Plaque assay |
| Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Cell binding assay |
| Tissue culture plates 24-well plate | TPP | 92024 | Cell binding assay |
| Tissue culture plates 6-well plate | TPP | 92006 | Plaque assay |
| Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Cell binding assay |
| Trypsin from porcine pancrease | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Activate for rotavirus |
| Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| Vertical 96-Well Thermal Cycler | Applied Biosystems | cDNA synthesis |
References
- Domingo, E. Rna Virus Mutations. Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).
- Gouvea, V., Brantly, M. Is rotavirus a population of reassortants? Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).
- Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).
- Ghosh, S., Kobayashi, N. Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects. Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. 2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).
- Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines. Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).
- Santos, N., Hoshino, Y. Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine. Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).
- Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread. Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).
- Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland. Vaccine. 35, 156-163 (2017).
- Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins. Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).
- Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells. Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).
- Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus. Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).
- Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis. Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).
- Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition. Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).
- Brüssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis. Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).
- Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O., Willassen, N. P. Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin. Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).
- Saxena, K., Blutt, S. E., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).
- Yin, Y., Bijvelds, M., et al. Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids. Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).
