Summary
このプロトコルはマウス実験近視モデル新たに設計を使用してマウスで誘導眼鏡と眼のパラメーター測定の安定性と再現性のある結果を達成するために必要な技術の完全なプロセスをについて説明します。
Abstract
近視のマウスモデルでは、比較的簡単な遺伝的操作のため近視研究の強力なツールをすることができます。動物で近視を誘発する 1 つの方法は、週間 (レンズによる近視、LIM) 明確なマイナス レンズを目の前に置くことです。ただし、研究所から研究所する誘因と評価の現存するプロトコルによって異なります。ここでは、新たに設計を使用してマウスの LIM 眼鏡を誘導する、実践的な再現性のある方法について述べる。安定しながらマウスの目の前に、レンズにより、レンズ洗浄用または局所にメソッドの修正は薬剤管理です。表現型は、堅牢で効率的との差異は小さい。ここで説明した方法は、実験のため可能な限りの期間を拡張する離乳直後後のマウスに適用できます。我々 はまた与えた技術屈折と軸の長さの測定で再現性のある結果を達成するためのアドバイスします。ここで説明した手順のプロトコルと思います、詳しい記事は近視と近視実験をよりスムーズに行う研究室データに匹敵する研究者を助けることができます。
Introduction
近視の有病率が近年、その発症と進行のメカニズムはまだほとんど知りませんが1。近視の最も特徴的な表現型は、網膜の合併症や2も失明のリスクを増加させる軸長さ (AL) の伸びです。近視の病態を理解し、効果的な治療法の開発、堅牢な近視眼的な動物モデルと安定した表現型の評価が必要です。
動物で近視状態を誘導するため簡単に、2 つの方法が存在する: フォーム剥奪の近視 (FDM) とレンズによる近視 (LIM)3。前者は目の前にディフューザーを配置または近視の表現型の結果、眼球の正常な発展に影響を与えるイメージをあいまいにする眼瞼縫合糸します。後者の場所は、網膜の後ろに焦点を移動する目の前にレンズを引いた。網膜は、フォーカスのシフトを検出し、網膜とフォーカル ポイントを再配置する眼球の伸長します。FDM、まぶたが閉じているか、目の前にディフューザーを修正されています後ほとんどないさらにメンテナンスが必要です。林は、レンズがそれを透明に保つために洗浄するため取られる必要があります。したがって、FDM は誘導されることが技術的には比較的簡単です。FDM と LIM のメカニズムが異なるし、どの方法を模倣人間で近視よりはまだ議論3中。LIM の強みの一つは、FDM、少なくともマウス4の場合に比べてより強い表現です。
近視を誘導するために使用されている動物は、マウス4モルモット8、木ジネズミ目7サル6雛5に含まれます。繁殖のため低コスト、豊富なの入手可能な抗体遺伝子操作の可能性を考慮したマウスことができた最初の選択肢近視の動物モデルとして。しかし、他のより大きい動物と比較して、レンズまたはマウスの目の前にディフューザーを修正は比較的困難など若いマウスの特に離乳後。局所投与または複数の中間アイ測定を必要とする実験、またリムーバブル フレームに必要なとしてます。もう一つの課題は、洗練された技術とデバイスを評価する必要がありますマウスの眼球の小さな形態変化です。までに、異なる誘導と異なる研究チームで使用されるプロトコルを測定を比較し、研究所全体の結果を繰り返すは難しいです。詳細で標準的なプロトコルが必要です。
以前の作品は、レンズまたは接着する9、10とヘッド マウント型ゴーグル フレーム11,12のステッチなど、マウスの目の前にディフューザーを修正する複数の方法を説明します。我々 は堅牢で効率的なマウス実験近視を誘発する ameliorated プロトコルを開発する当社の新設計フレームと存在するヘッド マウント型ゴーグル テクニクス11,12,13を組み合わせます。プロトコルは、生後 21 (p21) 離乳後すぐに若いマウスに適用できます。我々 も屈折や AL などの表現型の安定性と正確な評価プロセスの最適化。我々 はこの標準化されたプロトコルは、近視眼的なマウスの近視研究のより簡単にアクセス可能なモデルを作成する助けることができる願っています。
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Protocol
すべてのプロシージャは、動物研究慶應義塾大学医学部の倫理委員会が承認した眼科と視覚に関する研究、慶應義塾大学で動物実験に制度のガイドラインにおける動物の使用の ARVO 声明を遵守大学、および動物の研究: 研究の動物の使用のためのレポートので生体実験 (到着) ガイドライン。
1. マウスの眼鏡を組み立てる
- 眼鏡 (図 1 a) の組み立てに必要なパーツを準備します。各マウスのすべて以下の準備: ヘッド マウント型ナイロン樹脂棒、1 つ大きく、1 つ低いチタン フレーム、1 プレーン、M1.4 ネジの 1 つのナット、1 つ M1.4 ネジ長さ 10 mm の実験の目的に応じて適切な力を持つ 2 つのレンズ0.3 mm の厚さで M1.4 ネジのワッシャーと 2 つの人工爪ヒント (材料表)。
注意: 異なる高さにフレームの 2 種類が存在します。1 つのマウスの 1 つの高いフレームと 1 つ下のフレームがセットとして使用されます。高いフレームは、ビジョンのフィールドを左右対称にするために低いものの上置いてください。フレームとレンズは特別に設計され、著者らの研究グループによって製造されました。これらは、この記事の対応する著者に連絡して利用できます。他の部分は、工具の小売店で見つけることが。 - 右と左の目のフレームを個別に組み立てます。
- 最高の保護効果を達成するために外方向に直面する爪の先端を配置します。爪の先端とフレーム マウス視界 (図 1 b) をマスキングを避けるために約 130 ° の間の角度を調整します。シアノアクリ レート系接着剤を使用してフレームに人工爪のヒントを遵守します。
注: 爪のヒントはマウスで引っかかれてからレンズを保護するために助けることができます。爪の先端の方向を反対にする必要があります高いフレームと下部フレームで使用されるため右目と左目それぞれ。 - 接着剤を使用して爪の形を調整する爪切り、完全に乾燥をさせて、少なくとも 12 時間待機は 1 cm × 1 cm カットしてトリミングするヒントします。
- シアノアクリ レート系接着剤を使用して、フレームにレンズを接着します。手でフレームにレンズを入れて、フレームを水平に保持します。レンズの端からシアノアクリ レート系接着剤を注入し、表面張力によって接着剤の普及。
注:、接着剤がレンズをむしばむし透明度に影響を与える、とても接着剤はレンズの周辺部を触れるだけを確認します。近視を誘発するのに制御とレンズ マイナス 0 ディオプター (D) プラノ レンズを使用します。マイナス レンズ (–50 D、–10 D) のさまざまな力の効果はずっと4を他の場所で説明されています。近視の誘導を最大化、–30 D レンズを近視を誘発する推奨します。FDM は、ディフューザーとして 1.5 mL マイクロ チューブのキャップにレンズを変更するだけで、同じデバイスを誘起することができます。
- 最高の保護効果を達成するために外方向に直面する爪の先端を配置します。爪の先端とフレーム マウス視界 (図 1 b) をマスキングを避けるために約 130 ° の間の角度を調整します。シアノアクリ レート系接着剤を使用してフレームに人工爪のヒントを遵守します。
- 一緒に棒の平らな側面からワッシャー ナイロン棒にネジを締めます。それぞれ眼鏡や、実験の前に棒を準備し、さらに使用 (図 1 c) の在庫します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
2. 屈折および AL のベースラインの測定。
- 瞳孔を散大させるのに 5 mg/mL トロピカミドと眼球の両側に 5 mg/mL フェニレフリン塩酸塩を含む mydriatic のエージェントの一滴を適用します。全身麻酔の前に少なくとも 5 分を待ちます。
注: [全般] 瞳孔を散大させる麻酔後の測定に影響を与えるリバーシブルの白内障の原因となります。常に全身麻酔瞳孔を散大させるし、少なくとも 5 分待ちます。一滴 (約 0.05 mL) mydriatic エージェントは、エージェントは次の手順に害をしないしながらマウス眼の瞳孔を拡大のために十分です。 - 全身麻酔下にマウスを置きます。それは麻酔が完全にまで眼をぶつけてからマウスを保つためにそっとマウスの背中の皮膚を把握します。マウスは、テーブルの上で自由に置いたとき、は移動しない場合、十分にする麻酔の深さを判断します。
メモ: ミダゾラム (40 μ g/100 μ L)、メデトミジン (7.5 μ g/100 μ L) およびブトルファノール酒石酸 (50 μ g/100 μ L) の組み合わせは、0.01 mL/g 腹腔内投与のボリュームを持つマウスのため全身麻酔のためここで使用されます。一般的に、5 分以内で眠りに落ちるマウスが必要です。全身麻酔の長い時間は、低体温、徐脈を引き起こします。測定では、麻酔薬の注射後 10 分以内のすべての測定値を仕上げに全身麻酔の潜在的な影響を避けるためにお勧めします。麻酔薬のカクテルは、ブトルファノールは鎮痛効果が約 4 時間を提供します。全身麻酔のための適切なレシピは、機関によって異なる場合があります。 - 赤外線 photorefractor4,9,14を使用してマウスの目の屈折率を測定します。瞳孔の中心に最初のプルキンエ イメージを維持し、光軸に沿って屈折を測定マウスの目の一つの方向を調整します。測定後反対側の目と同じ手順 (図 2 a) を測定します。
注: 屈折のため測定値は光軸に沿ってマウスの目の位置によって強く影響されます。瞳孔の中心から ± 3 度以内である最初のプルキンエ イメージを揃うようにします。スペクトル領域光干渉 (SD oct) システムのワークベンチは、屈折測定4生の方向の微調整に使用かもしれません。 - SD OCT システム4,15,16を使用してマウスの目のアルを測定します。角膜頂点から光神経 (図 2 b) に近い明るい境界までの距離として AL を定義します。
注: 屈折の測定と同様に、マウスの目の方向によって、アルを影響強く。角膜の頂点は、角膜の表面に点のようなリフレクションによって確認できます。網膜側の境界と光神経の時点で非常にぼんやりとなります。境界を測定するため十分に明確が光神経からあまり遠くないように少しの方向を調整します。
3. マウス頭蓋にフレームの固定。
- それぞれの目の乾燥を防ぐために 0.1% 精製されたナトリウム ヒアルロン酸目薬の一滴を適用します。
注: 点眼薬目の表面で屈折と軸の長さの測定値に影響します。すべての測定が終了するまで点眼麻酔後に使用しないでください。 - 粘土製の斜面に麻酔下のマウスのあごを置くまたは頭蓋の先行のために枕が水平になるように、何かが使えます。
- 髪の毛を殺菌し、耳と目の 70% エタノール綿棒を使用しての頭皮。
- 耳と約 0.8 cm2外科はさみとピンセットを使用してために、頭蓋骨を公開するための目の間の皮膚をカットします。歯科用エッチング液と綿棒を使用して、骨膜を削除します。外科はさみとピンセット各マウスの手術の前に 70% エタノールで消毒します。
注: 髪の毛をクリッピングと滅菌手袋を着用して必要があります。 この手順の前に関連する動物の世話委員会の規定を確認してください。ほとんどの場合、歯科用エッチング液は自己治癒の歯科用接着システムでの添付ファイルの 1 つとして見つけることが。歯科エッチング液を使用できない場合は、代わりに 70% のエタノールを使用します。 - 右の位置に棒を固定するためのレンズなしフレームのセットを組み立てます。マウスの頭の上にフレームを配置します。慎重に両方の目は空のフレームの真ん中にいるようにフレームの位置を調整します。
- 自己を治す歯科用接着システムを使用して、マウスの頭の上にスティックを添付します。マウスの目に重要システムの流れの液体を聞かせしないように注意します。
注: 自己を治す歯科用接着システムを使用する方法は製品間で異なるです。慎重に指示を参照してください。
注意: 歯科用接着システムで試薬のいくつかは有害である可能性があります。 - 約 5 分間待ってから、スティック (図 3 a) の位置を変更することがなく慎重にフレームとナットを取る。
- 腹腔内にマウスを麻酔から回復するよりすばやく 0.75 mg/kg アチパメゾール塩酸を注入します。マウスを完全に回復するまで、個々 のケージに入れます。放置しないでください、マウスまでそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。プロトコルはここで一時停止することができます。
4. 近視誘導やその後のメンテナンスの開始
- マウスの麻酔から完全に回復させる手術後少なくとも 24 時間待ちます。棒を持ち、レンズとフレームをつけます。この時点 (図 3 b) で誘導を開始します。
注: 麻酔からの回復の間に不快感を最小化し、凝固する歯科用接着システムの十分な時間を与える、強くお勧めマウスは完全に麻酔から回復後、フレームにかける。接着システムのレジン セメントは完全に頭皮のカットをカバーします。したがって、感染の予防、手術後の痛みの改善のため特定の手術後の治療は必要ありません。フレームに置くことの最初の時間の直後にマウスがレンズの存在を意識している以上になるし、多くはそれを傷つけます。総行動は、数時間後普通に帰れます。レンズを持つマウスは通常のマウス同じ密度と保つことができます。 - フレームを取り外して、きれいなレンズと綿棒と指の爪のヒント、少なくとも週に 2 回レンズの透明度を維持するために。
注: 削除、フレームに入れて麻酔下マウスを置く必要はありません。苦痛を減らすことができる彼らと働いている間にハングそれらを持ってではなく、座ってマウスのためのサポートを提供します。- 中間測定が必要な場合、麻酔下マウスを置くし、前述したようにマウスを測定します。マウス麻酔からの回復の後の誘導を継続できます。
- 週に少なくとも 2 回、ケージをきれい。
注: このヘルプをレンズの透明度を維持するために。マウスと生ゴミを濾液にケージ下部の間ネットを置くこともできます。 - 体重と総行動を監視します。実験全体のプロセス中にそのままマウスを年齢と同じ、それらを比較します。
注: いくつかの掻破行動を除いて体重を含む重要な変更はありませんでした未処理のねずみで実験マウス。
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Representative Results
なら、すべての必要な部品 (図 1 a) で最初に、チェックしてください。図 1 bに組み立てられた眼鏡の部分の例を示します。フレームとナットが本体を除いて他のすべての部分、それぞれのマウスの使い捨て。図 1 cに完成した眼鏡のセットを示します。年齢別でマウスに合わせて 2 つのフレーム間の角度を変更します。
屈折測定の例を図 2 aに示します。これは p21 から始まって 3 週間-30 D レンズによるマウスの目です。マウスが9カメラの正面を見ているを意味する x と y の両方の軸で 0 度に近い視線を制御しなければならないことに注意してください。図 2 bは、マウスと眼の各部分の定義のために調整 SD OCT システムによって実行された全体の目の画像の例を示します。一般的に、実際の測定値を直接提示 SD OCT システム。
棒のイメージは、頭を図 3 aに示すマウスに付着。カットの境界線は、まぶたの機能に影響を及ぼすように目から少なくとも 3 mm をする必要があります。スティックは、マウスの頭の上の誘導の終わりまで眼鏡を修正するための基盤を提供しています。歯科用接着システムの接着強度は、約 3 〜 4 週間の全体の実験中に眼鏡の固定のためになっています。図 3bに示すように、眼鏡を組み立てます。眼鏡の 2 つの部分をかなり左右対称にする必要があります。
Presentative の結果は、図 4のとおりです。この実験では 0 D プラノ レンズは内部統制として左の目の前で修正され、-30 D レンズは、近視を誘導するために右の目の前で修正されました (C57B6/J マウス、p21、n から始まった誘導 = 4)。屈折と ALs は、3 週間の誘導の初めの後週に 1 回を測定しました。-30 D 0 D プラノ レンズと比較して、屈折とアルの両方で強力な近視眼的なシフトを誘発しました。屈折の変化は最初の週にピークに達したし、次の 2 週間の横ばい。アルの近視の目の変化とコントロールの目の違いは、最初の週から有意であった、次の 2 週間で大きくなるとになった。
図 1: 頭蓋骨マウント眼鏡のデザイン。(、) すべての部品に必要なマウス メガネを組み立てます。(b) フレームと爪の位置の例は目の右側のヒントします。(c) 組み立てられたガラスの 1 つのセットの例。マウスのさまざまな年齢層に合わせてフレームの角度を変更する接合部を調整します。この図は、 et al4、クリエイティブコモンズ帰属 4.0 国際ライセンスの下で利用可能な X. 江から変更されています。http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: サンプルらと屈折測定の画像(、) 赤外線 photorefractor を使用して目を近視の屈折測定のイメージ。SD OCT システムと目のボールの各部分の定義を使用してマウスの目のアル測定 A (b) サンプル画像。この図は、 et al4、クリエイティブコモンズ帰属 4.0 国際ライセンスの下で利用可能な X. 江から変更されています。http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 手術後 1 つのマウスのイメージ。スティックを遵守するため手術後マウスは (、) の一例。両サイドの眼鏡を 1 つ (b) マウス。この図は、 et al4、クリエイティブコモンズ帰属 4.0 国際ライセンスの下で利用可能な X. 江から変更されています。http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 内部統制として-30 D レンズと 0 D レンズを用いた 4 つのマウスで近視誘導の 3 週間のフォロー アップの結果を Presentative.3 週間のための屈折の変化は (、)。急激な変化は、後、1 週間観察できます。(b) 一方、アルの変化は比較的軽かった。アスタリスク マークは、それぞれ毎週 0 D と-30 D レンズを着て目の間統計の意義を示した。p < 0.05 * *p < 0.01。スチューデントのt-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: マウスの近視を誘導するためのフローチャートをお勧めします。ここで示したフローチャートは、マウスで近視を誘導するための 1 つの可能なパターンを表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルのいくつかのステップは確実にマウスの頭に安定して固定するのに眼鏡を偉大な注意を払われる必要があります。骨膜は、歯科用接着システムを使用する前に完全に削除する必要があります。頭蓋骨には、血液も注意してクリーンアップする必要があります。接着剤のアプリケーションの直後に若干の調整は受け入れ、頻繁系接着剤が乾燥する前にスティックを移動しないでください。接着システムの指示を慎重に、特に最終的な混合物の各成分の比率。マウスをつかむとき、眼鏡や手術後のフォロー アップの測定のメンテナンス中を持たないで、マウスの本体とスティック一緒に。頭蓋骨と棒との間の相対運動は、棒の下の落下の最も多い原因です。適切な手術と把持力、スティック ドロップダウン個体数 20 個人を含む 3 週間実験で 1 未満になります。
毛および食糧スクラップは、目とレンズの間間隔に陥る可能性があります。レンズの透明度に影響を与えるだけでなく、潜在的角膜表面を物理的に損傷されます。保つためには、少なくとも 2 回の洗浄、レンズの透明度が、毎週が必要です。これはまたマウスを角膜に合併症の発生率を減らすために顔の手入れをするチャンスに与えます。フレームと点滅するマウスを許可する皮膚の間約 1 mm の空間を残します。フレームは食品上のグリッドをケージの外に到達するためにマウスのハードにすることができます。そのため、ケージの床に直接食品を配置することをお勧めします。変更レンズを保つを助けるも週に 2 回のきれいなものにケージをきれいに。レンズ汚れになるフォーム剥奪メカニズムによって近視を誘導するディフューザー。これは、データを傾斜し、証拠を示した FDM と LIM 病因3で別のモデル システムであることを解釈しにくい結果を確認します。
マウス眼のサイズが小さいため測定目パラメーターが安定する傾向があります。屈折測定9および AL4 SDOCT システムで博士 Schaeffel によって開発された赤外線 photorefractor をお勧めします (材料の表を参照してください)。両方のシステムでは、測定の再現性を確保するための測定値の信頼性を判断するための十分な情報を提示します。以前のレポートで主張して屈折の測定軸上4,14を維持するために非常に重要です。± 3 度以内の視線制御を維持する安定した結果を受け取ることができます。この精密な測定を達成するために SDOCT システムのチューブ役マウス眼の方向を調整するとき。アルの測定、角膜頂点と光神経近く明るい境界で反射した光がこの測定の再現性を確保する 2 つの信頼性の高い解剖学的マーク。
ここで説明されているプロトコルは、1 週間以内にマウスにおける重要な近視状態を誘導しました。メカニズムはまだ知られている、屈折および AL の変化が必ずしも平行ではないです。合計で 3 回を行われる測定をお勧めします以来、アルは、一週間後近視眼的な成長続けた、: 前に、1 週間、3 週間後に誘導。近視の誘導例フローチャートの 1 つを図 5に示した。以前レポート4、p21 から始まってを使用してに基づく - 4 週間が測定値に影響を与えるし、レンズの消費を加速する重篤な角膜合併症の発生率が高いを持っている以上、30 D のレンズは最後推奨リムの実験のため.最も多い合併症は、角膜の傷です。マウスは、顔やまぶたのフレーム、身に着けている可能性もあるため、合併症をクリーンアップできません。
このプロトコルで記述されているデバイスは、(p21) を離乳直後後のマウスに適用できます。これは、部分的に4を観測された強い表現型に貢献するかもしれない。フレームは全身麻酔なしで取り外し可能です。これによりレンズをきれいに簡単に、しかしまた局所薬物配送可能な4に研究者だけでなく。別の力は、ディフューザーや異なるジオプターのレンズに、レンズを簡単に変更できます (e.g。、プラスレンズ)、この方法の可能性を拡張します。このメソッドの制限の 1 つは、手術では、フレームは全体の実験のため安定して付着することができます前に、いくつかの練習が必要があることです。測定は、信頼性の高いデータを収集するために忍耐力も必要です。
マウスは、その可能性は遺伝子操作と繁殖のため低コストのかけがえのない動物モデルです。ここで説明したプロトコルで作ることがマウス実験近視モデル マウス近視研究のためのより実用的なモデルだと思います。
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Disclosures
マウスの眼鏡のデザインは、特許 (アプリケーション号 201741349) に適用されています。
Acknowledgments
SDOCT、屈折、角膜曲率、M. 宮内; 立体骨組データを再現するため氏山椒魚の測定に関するアドバイス ・ f ・ Schaeffel についてのアドバイスありがとうティルソン ・ パルデューK. 坪田;裕一田中;近藤;C. 正田;M. 伊吹。Y. 美和。Y. 萩原;石田;祐富田;Y. 堅田;E. 四倉;高橋;泰王重要な議論のため。この仕事は科学研究 (科研費、数 15 K 10881) 文部科学省からトケラウ諸島に助成金 inAid によって支えられました。この作品は坪田研究所 (東京) から近視研究助成でもサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| screw | NBK | SNZS-M1.4-10 | |
| washer | MonotaRO | 42166397 | |
| nut | MonotaRO | 42214243 | |
| stick | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| frame | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| lenses | RAINBOW CONTACT LENS | none | customized for mice use by the company |
| cyanoacrylate glue | OK MODEL | MP 20g | |
| dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | super bond | contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull |
| infrared photorefractor | Steinbeis Transfer Center | none | designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen |
| Spectral domain OCT | Leica | R4310 | |
| Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution | Santen | Mydrin-P | |
| midazolam | Sandoz K.K. | SANDOZ | components for the anesthetic |
| medetomidine | Orion Corporation | Domitor | components for the anesthetic |
| butorphanol tartrate | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | components for the anesthetic |
| 0.1 % purified sodium hyaluronate | Santen | Hyalein | |
| atipamezole hydrochloride | Zenoaq | antisedan |
References
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