Summary
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את תהליך מלא של משקפיים השראת בעכברים באמצעות החדש תוכנן ניסיוני. קוצר ראייה, הטכניקה הדרושה להשגת תוצאות לשחזור ויציבה במדידות פרמטרים עינית.
Abstract
דגם מאתר של קוצר ראיה יכול להיות כלי רב עוצמה עבור מחקר קוצר ראייה בגלל מניפולציה גנטית יחסית קל. דרך אחת כדי לגרום קוצר ראיה אצל בעלי חיים היא לשים ברור מינוס עדשות מול העיניים במשך שבועות (עדשה-induced קוצר ראייה, LIM). עם זאת, הפרוטוקולים הקיימים השראת ולהערכה משתנים מעבדה מעבדה. כאן, אנחנו תיאר שיטה מעשית מאוד לשחזור לזירוז LIM בעכברים באמצעות החדש תוכנן משקפיים. התיקונים שיטה העדשה stably מול העין העכבר בעת מאפשרת העדשה שיוציאו אותך לניקוי או אקטואלי סמים המינהל. גן # מושגים בסיסיים חזקים ויעילים, הסטיה היא קטנה. השיטה המתוארת כאן ניתן ליישם עכברים מיד לאחר הגמילה אשר מרחיב את המשך אפשרי לניסויים. אנחנו גם נתנו טכני מייעץ להשגת תוצאות לשחזור שבירה ומדידות אורך צירית. אנו מקווים פרוטוקול צעד אחר צעד המתוארים כאן, במאמר מפורט יכול לעזור החוקרים לבצע ניסויים קוצר ראייה עם קוצר ראייה בצורה חלקה יותר ולהפוך את הנתונים דומים ברחבי מעבדות.
Introduction
השכיחות של קוצר ראייה גדל באופן דרמטי לאחרונה, ואילו המנגנון של התפתחות והתקדמות שלה עדיין במידה רבה unknow1. פנוטיפ האופיינית ביותר של קוצר ראייה הוא התארכות של אורך צירית (אי אל), אשר מגביר את הסיכון לסיבוכים ברשתית או אפילו עיוורון2. כדאי להבין בפתוגנזה של קוצר ראייה ולפתח טיפולים יעילים, חזקים מודלים בעלי חיים קצר והערכה פנוטיפ יציב יש צורך.
בקצרה, שתי שיטות קיימות עבור גרימת קצר הברית בבעלי חיים: טופס-מניעת קוצר ראייה (FDM), קוצר ראייה עדשות-induced (LIM)3. לשעבר מקומות רשתות ומפזרים מול העין או sutures העפעף כדי לטשטש את התמונה, מה שמשפיע על התפתחות תקינה של גלגל העין, וכתוצאה מכך הפנוטיפ קוצר ראייה. המקומות האחרונים מינוס עדשות מול העין כדי להעביר את נקודת המוקד מאחורי הרשתית. הרשתית מזהה את המשמרת של המוקד, מאריך את גלגל העין כדי ליישר מחדש את הרשתית ואת מוקד. עבור FDM, לאחר העפעף סגור או מפזר תוקנה מול העין, אין כמעט תחזוקה נוספת נדרשת. עבור לים, העדשה צריך להיות המריא לניקוי כדי לשמור אותו לשקוף. לפיכך, FDM קל יחסית לבצע להיגרם טכנית. עם זאת, מנגנוני FDM ו- LIM שונים, באיזו שיטת מחקה את קוצר ראייה-אנוש כדאי עדיין תחת הדיון3. אחד היתרונות של LIM הוא פנוטיפ חזק יותר בהשוואה FDM, לפחות במקרה של עכברים4.
חיות שנוצלו להשראת קוצר ראייה כוללים בנות5, קופים6, חדפי־עצים7, שרקנים8ועכברים4. בהתחשב האפשרות של מניפולציה גנטית, שופע נוגדנים זמינות ועלות נמוכה לגידול, עכברים יכול להיות הבחירה הראשונה כמודל בעלי חיים של קוצר ראייה. לעומת אחרים חיות גדולות, תיקון עדשות או רשתות ומפזרים מול העין העכבר זאת, יחסית קשה במיוחד עבור עכברים צעירים כגון זכות לאחר הגמילה. על הניסויים צריכים אקטואלי והתרופות האמריקני או מדידות העין ביניים מרובות, זה גם הכרחי עבור מסגרת להיות נשלף. אתגר נוסף הוא שינוי מורפולוגי קטן של עכבר גלגל העין, אשר צריך טכניקה מתוחכמת והתקנים להעריך. עד כה, שייצור שונות ומדידת פרוטוקולים המשמשים בקבוצות מחקר שונים מקשה להשוות באופן חוזר את התוצאות מעבר מעבדות. פרוטוקול סטנדרטי עם פרטי נדרש.
עבודות קודמות תיאר בשיטות מרובות כדי לתקן עדשות או רשתות ומפזרים מול העין העכבר, כגון הדבקה9, תפרים10 ו-11,מסגרת goggle נישאת על הראש12. אנחנו בשילוב קיימים goggle נישאת על הראש טכניקה11,12,13 מסגרת שעוצבו לאחרונה שלנו לפתח פרוטוקול ameliorated להשראת עמיד ויעיל ניסיוני. קוצר ראייה בעכברים. הפרוטוקול ניתן ליישם עכברים צעירים מיד לאחר הגמילה ביום כמחנכת 21 (p21). אנחנו גם אופטימיזציה התהליכים להערכת יציב ומדויק של פנוטיפים כולל שבירה, AL. אנו מקווים פרוטוקול מתוקננת זה יכול לעזור ליצור עכברים קצר מודל נגיש בקלות רבה יותר למחקר קוצר ראייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה על החיה מחקר של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת קאיו דבקה המשפט ארוו שימוש בבעלי חיים של לרפואת עיניים ומחקר החזון, המוסדיים הנחיות על ניסויים בבעלי חיים-קאיו ואוניברסיטת המחקר בעל חיים: דיווח ב- Vivo ניסויים (יגיעו) הנחיות השימוש בבעלי חיים במחקר.
1. הרכבת את המשקפיים עבור עכברים
- הכנת החלקים הדרושים להרכבת של המשקפיים (איור 1 א'). עבור כל עכבר, להכין כל שמקיפים: מקל אחד ניילון נישאת על הראש, אחד גבוה יותר, טיטניום נמוך אחד מסגרת, שתי עדשות עם כוחות תקין על פי מטרת הניסוי, אחד בורג בגודל M1.4 עם אורך 10 מ מ, ביצה אחת לזיון גודל M1.4, ואחד רגיל מכונת כביסה לזיון בגודל M1.4 עם העובי של 0.3 מ מ, ציפורן מלאכותית שתי עצות (טבלה של חומרים).
הערה: קיימים שני סוגי מסגרות בגבהים שונים. עבור עכבר אחד, אחד גבוה יותר מסגרת ומסגרת נמוך אחד משמשים כערכה. צריך לשים מסגרות גבוה מעל התחתונות כדי להפוך את שדות ראייה סימטרית. מסגרות ועדשות במיוחד מתוכננים ומיוצרים על ידי קבוצת מחקר של המחברים. אלה זמינים על-ידי פנייה המחברים המתאימים של מאמר זה. חלקים אחרים ניתן למצוא בחנויות כלי הקמעונאי. - להרכיב מסגרת העין ימינה ושמאלה בנפרד.
- לארגן את קצה הציפורן להתמודד עם הכיוון מחוץ להשגת האפקט המגן הטוב ביותר. להתאים את הזווית בין קצה הציפורן למסגרת להיות בערך 130° כדי להימנע מטשטשים את שדה הראייה העכבר (איור 1b). דבקים העצות ציפורן מלאכותית על המסגרת באמצעות דבק דבק מגע.
הערה: ציפורן עצות שיסייעו לך להגן על העדשה שמשטח על ידי העכבר. הכיוון של העצות הציפורן חייב להיות הפוך כי המסגרת גבוהה יותר לבין המסגרת התחתונה משמשים עבור עין ימין ועין שמאל, בהתאמה. - מחכים לפחות 12 שעות לאפשר את דבק יבש לחלוטין, מכן השתמשו מקוצץ ציפורניים כדי להתאים את צורת הציפורן טיפים להיות על 1 ס"מ × 1 ס"מ על ידי חיתוך, קיצוץ.
- דבקים העדשה על המסגרת באמצעות דבק דבק מגע. לשים את העדשה אל המסגרת בעבודת יד והחזק את המסגרת אופקית. להזריק את דבק cyanoacrylate מהקצה של העדשה ותנו התפשטות דבק על ידי מתח.
הערה: החומר לשחוק את העדשה להשפיע על השקיפות שלה, כדי לוודא שהדבק רק נוגע החלק ההיקפי של העדשה. להשתמש עדשה פלאנו כוחן 0 (D) כפקד ומינוס העדשה כדי לגרום קוצר ראייה. ההשפעה של כוחות שונים של מינוס עדשות (–10 D כדי –50 D) כבר תיאר במקום אחר4. כדי להגדיל את התמריץ קוצר ראייה, עדשות –30 D מומלצת גרימת קוצר ראייה. FDM יכולה גם להיגרם עם מכשיר זהה פשוט על ידי שינוי העדשה לתוך הכיפה של 1.5 mL microtube כמו מפזר.
- לארגן את קצה הציפורן להתמודד עם הכיוון מחוץ להשגת האפקט המגן הטוב ביותר. להתאים את הזווית בין קצה הציפורן למסגרת להיות בערך 130° כדי להימנע מטשטשים את שדה הראייה העכבר (איור 1b). דבקים העצות ציפורן מלאכותית על המסגרת באמצעות דבק דבק מגע.
- להדק את הבורג לתוך המקל ניילון עם למכונת הכביסה מן הצד השטוח של המקל. להכין את עין משקפיים ומקלות לפני הניסוי בהתאמה, במניה להמשך השימוש (איור 1 c).
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
2. מדידות של שבירה, AL בסיסית.
- החל טיפה אחת של הסוכן mydriatic המכילה 5 מ"ג/מ"ל tropicamide ו 5 מ"ג/מ"ל הידרוכלוריד phenylephrine בכל צד של העין להתרחב התלמיד. המתן לפחות 5 דקות לפני הרדמה כללית.
הערה: להתרחב התלמיד תחת כללי הרדמה יגרום קטרקט הפיך אשר משפיע על המדד לאחר מכן. תמיד מתרחבים התלמיד לפני הרדמה כללית והמתן לפחות 5 דקות. טיפה אחת (כ- 0.05 מ"ל) של סוכן mydriatic מספיקה להרחבת האישון של העין העכבר, בעוד הסוכן עוד יעשה שום נזק אל השלבים הבאים. - לשים את העכבר בהרדמה כללית. לאחוז העור האחורי של העכבר בעדינות כדי למנוע את העכבר הקפצת את העין עד אותו לגמרי מרדימים. לשפוט את העומק של הרדמה כללית יספיק אם העכבר לא זז כאשר זה שם על השולחן באופן חופשי.
הערה: שילוב של midazolam (40 μg/100 μL), medetomidine (7.5 μg/100 μL) ו- butorphanol tartrate (μL μg/100 50) משמש כאן בשביל הרדמה כללית עבור עכברים עם נפח של הזרקת בקרום הבטן 0.01 מ ל/g. באופן כללי, פחות מ 5 דקות יש צורך עכברים להירדם. זמן רב של הרדמה כללית גורמת נמוכה טמפרטורת הגוף, קצב לב איטי. כדי למנוע את השפעת הרדמה כללית למדידה, גימור כל המדידות בתוך 10 דקות לאחר ההזרקה של הרדמה פוטנציאליים מומלץ. Butorphanol הניתנים קוקטייל הרדמה לספק כ- 4 שעות של שיכוך כאבים. המתכון הנכון הרדמה כללית מאי שונים על ידי מוסדות. - למדוד את השבירה של העין העכבר באמצעות9,4,photorefractor אינפרא-אדום14. התאם את הכיוון של אחת העיניים העכבר כדי לשמור את התמונה Purkinje הראשונה במרכז האישון ולמדוד את השבירה לאורך הציר האופטי. לאחר המדידה, למדוד את העין הנגדית עם אותם הליכים (איור 2 א).
הערה: הערך שנמדד עבור השבירה מושפעת מאד המיקום של העין העכבר לאורך הציר האופטי. ודא שהתמונה הראשונה Purkinje מיושר בתוך ±3 מעלות מהמרכז של התלמיד. עבודה, שעליו מונחים בתחום ספקטרלי אופטית קוהרנטית טומוגרפיה (SD-אוקטובר) המערכת עשוי לשמש עבור כוונון עדין של הכיוון של התלמיד שבירה מדידות4. - למדוד מלאכותית של העין העכבר באמצעות15,164,מערכת SD-אוקטובר. להגדיר מלאכותית כמו המרחק בין הקודקוד הקרנית לגבול המבריקים ליד העצב (איור 2b).
הערה: דומה עם המדידה של השבירה, מלאכותית מושפעת מאד הכיוון של העין העכבר. ניתן לאשר הקודקוד הקרנית, כמו נקודת השתקפות על פני הקרנית. הגבול של הצד הרשתית יהיה מאוד מעורפל בנקודת עצב אופטי. להתאים הכיוון קצת לתת את הגבול יהיה מספיק ברור למדידת אבל לא רחוק מדי מן העצב האופטי.
3. קיבוע של המסגרת על גבי הגולגולת העכבר.
- החל טיפה אחת של 0.1% נתרן מטוהרים היאלורונית העין טיפה כדי למנוע יובש על כל עין.
הערה: העין טיפה על פני עין ישפיע הדבר על הערכים של שבירה ומדידות אורך צירית. אל תשתמש הטיפה בעין לאחר ההרדמה עד כל המדידות נעשות. - לשים את הסנטר של העכבר anesthetized על גבי מדרון מחימר או כל דבר יכול לשמש כרית כדי להפוך את המטוס ישיר הגולגולת להיות אופקית.
- לחטא את השיער, הקרקפת בין האוזניים והעיניים באמצעות מטלית כותנה עם 70% אתנול.
- לחתוך את העור בין האוזניים והעיניים לחשוף את הגולגולת עבור 0.8 ס מ2 באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה. השתמש ספוגית כותנה של נוזלים איכול שיניים להסרת קרום העצם. לחטא מספריים כירורגיים של פינצטה עם 70% אתנול לפני הניתוח של כל עכבר.
הערה: מסיכה לשיער, לובש כפפות סטריליות עשוי להידרש. בדוק להוראות הוועדה הרלוונטית טיפול בבעלי חיים לפני הליך זה. ברוב המקרים, ניתן למצוא את הנוזל איכול שיניים כאחת הקבצים המצורפים במערכת עצמית לרפא שיניים דבק. אם הנוזל איכול שיניים אינה זמינה, השתמש 70% אתנול. - להרכיב קבוצת מסגרות ללא עדשה כדי לסייע לתקן את המקל על המיקום הנכון. לשים את המסגרות על הראש העכבר. בזהירות להתאים את המיקום של המסגרות כדי לוודא שבשתי העיניים הן באמצע המסגרת הריקה.
- השתמש עצמית לרפא שיניים דבק מערכת כדי לחבר את המקל על הראש העכבר. להיזהר לא לתת את הנוזל של הזרם מערכת adhere לתוך העין העכבר.
הערה: השיטה לשימוש עצמי לרפא שיניים דבק המערכת היא שונה בין מוצרים. להפנות ההוראות בקפידה.
התראה: חלק ריאגנטים במערכת דבק שיניים עלול להיות רעיל. - לחכות בערך 5 דקות, להוריד את המסגרת ואת האגוז בזהירות מבלי לשנות את המיקום של הסטיק (איור 3 א).
- להזריק 0.75 mg/kg הידרוכלוריד atipamezole intraperitoneally כדי לסייע העכבר ההתאוששות מן ההרדמה במהירות רבה יותר. לשים את העכבר לכלוב בודדים עד החלים לחלוטין. אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.
4. ייזום של אינדוקציה של קוצר ראייה ותחזוקה אחר כך
- המתן לפחות 24 שעות לאחר הניתוח לשחרר את העכבר להתאושש לחלוטין מן ההרדמה. לאחוז את המקל והניח על המסגרות עם עדשות. לנוכח התמריץ מתחיל בנקודת זמן זו (איור 3b).
הערה: כדי למזער את אי הנוחות במהלך ההתאוששות מן ההרדמה ולתת מספיק זמן עבור מערכת דבק שיניים והקרשה, מומלץ לשים על המסגרת לאחר העכברים החלים לחלוטין מן ההרדמה. הבטון שרף של מערכת דבק יכסה במלואם את החתך של הקרקפת. לכן, אין טיפול לאחר ניתוח מיוחד דרוש למניעת זיהום, כאב לאחר ניתוח ameliorating. מיד אחרי הפעם הראשונה לשים על המסגרת, עכברים נגמר מודעת לקיומו של העדשה, לשרוט את זה הרבה. התנהגות דוחה יחזור לשגרה אחרי כמה שעות. ניתן לשמור העכברים עם עדשות עם צפיפות אותו לעכברים נורמלים. - להסיר את המסגרת ולנקות עדשות, עצות הציפורן עם ספוגיות כותנה לפחות פעמיים בשבוע כדי לשמור על השקיפות של העדשה.
הערה: אין צורך לשים את העכבר בהרדמה עבור הסרת לשים על המסגרת. מספקים תמיכה עבור העכברים לשבת על, במקום אותם כאן בזמן עבודה עם אותם להפחית מצוקה.- אם המדידה ביניים הכרחי, לשים את העכבר תחת הרדמה, למדוד את העכבר כאמור תיאר. לנוכח התמריץ ניתן המשיך אחרי העכבר מתאושש מההרדמה.
- לנקות את הכלוב לפחות פעמיים בשבוע.
הערה: זה יעזור לשמור על עדשות בהירות. לשים רשת בין העכבר בתחתית הכלוב כדי filtrate את שאריות האוכל שלהם עשוי גם להיות שימושי. - נטר את משקל הגוף וההתנהגות ברוטו. להשוות אותם עם אותו גיל עכברים שלא נגעו במהלך התהליך הניסויי לגמרי.
הערה: מלבד כמה התנהגויות של גירוד, ללא שינוי משמעותי כולל את משקל הגוף נמצא בין עכברים בניסוי עם עכברים שלא טופלו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At, בדוק תחילה אם כל החלקים הדרושים מוכנים (איור 1 א'). דוגמה של פיסת משקפיים שהורכב מוצג איור 1b. מלבד הגוף העיקרי של המסגרות, האגוז, כל החלקים האחרים הם חד פעמיים על העכבר כל ערכה של משקפיים שהושלם מוצג באיור 1 c. לשנות את הזווית בין שתי המסגרות כדי להתאים את העכבר עם גילאים שונים.
דוגמה של המדידה שבירה מוצג באיור 2a. . זה בלש העכבר המושרה על ידי עדשה-30 D למשך 3 שבועות החל מ- p21 שימו לב כי המבט יהיה ניתן לשלוט קרוב 0 מעלות בציר x ו- y מה שאומר כי העכבר רואה מול המצלמה9. איור 2b מראה דוגמה של תמונה כל עין נלקח על-ידי מערכת SD-אוקטובר מכוון עבור עכברים והגדרתה של כל חלק של העין. בדרך כלל, מערכות SD-אוקטובר מציגים בפועל ערך נמדד באופן ישיר.
תמונה של המקל דבקה העכבר הראש מוצג באיור 3 א. הגבול של החתך צריך להיות לפחות 3 מ מ מן העין כדי למנוע המשפיעים על הפונקציה של העפעף. המקל נשאר על הראש העכבר עד לסוף לנוכח התמריץ, מספק את הבסיס לתקן את המשקפיים. הכוח דבק של מערכת דבק דנטלי אמור להיות מספיק בשביל הקיבעון של משקפיים במהלך הניסוי כולו במשך 3-4 שבועות. להרכיב משקפיים כפי שמוצג באיור 3b. שתי חתיכות של משקפיים צריך להיות סימטרי למדי.
תוצאות presentative מוצגים באיור4. בניסוי זה, עדשות פלאנו 0 D היה קבוע מול העיניים שמאלה כפקדי פנימיים ו-30 ד' עדשות היו קבוע מול עין ימין כדי לגרום קוצר ראייה (C57B6/J עכברים, השראת החלה מ p21, n = 4). השתברויות ומחלת ניוון שרירים נמדדו פעם בשבוע לאחר תחילת לנוכח התמריץ במשך שלושה שבועות. לעומת עדשות פלאנו 0 D,-30 D המושרה משמרת קצר חזק שבירה והן באל. השינוי של שבירה הגיעו לשיא בשבוע הראשון ונשאר שטוח במשך השבועיים הבאים. ההבדל בין השינוי של קצר עיניים ועיניים שליטה ב- AL היה משמעותי מהשבוע הראשון והפך גדולות ורחבות יותר גדול בשבועיים הבאים.
איור 1: העיצוב של המשקפיים התלויות על הגולגולת. () כל החלקים צורך בהרכבת המשקפיים העכבר. (b) דוגמה של המיקום של המסגרת ואת הציפורן עצה על הצד הימני של העין. (ג) דוגמה ערכה אחת של משקפיים מורכבים. להתאים את החלק משותפת לשינוי הזווית של המסגרות להשתלב עבור עכברים בגילאים שונים. איור זה השתנה מג'יאנג, X. ואח4, זמין תחת Creative Commons 4.0 הבינלאומי רישיון. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: לטעום תמונות של המדידה של שבירה, AL. () תמונה של המדידה שבירה עין קצר באמצעות photorefractor של אינפרא-אדום. (b) א תמונה לדוגמה מדידה באל של העין העכבר באמצעות מערכת SD-אוקטובר, ההגדרה של כל חלק של הכדור העין. איור זה השתנה מג'יאנג, X. ואח4, זמין תחת Creative Commons 4.0 הבינלאומי רישיון. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תמונה של עכבר אחד אחרי הניתוח. () דוגמה אחת בעכבר לאחר הניתוח עבור והקפדה על המקל. עכבר (b) אחד עם משקפיים לשני הצדדים. איור זה השתנה מג'יאנג, X. ואח4, זמין תחת Creative Commons 4.0 הבינלאומי רישיון. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: Presentative תוצאות מעקב שלושה שבועות של קוצר ראייה השראת ארבעה עכברים באמצעות-30 D עדשות ועדשות 0 D כמו בקרה פנימית- () שינויים של השתברויות במשך שלושה שבועות. שינוי פתאומי יכול להיות שנצפו שבוע אחרי לנוכח התמריץ. (b), לעומת זאת, השינויים ב- AL היו מתון יחסית. כוכבית סימני הראה את חשיבות סטטיסטית בין העיניים לובשת עדשות 0 D ו-30 D בבכל שבוע, בהתאמה. p < 0.05, * *p < 0.01. סטודנט t-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מומלץ זרימה להשראת קוצר ראייה בעכברים. תרשים הזרימה שהראתי כאן מייצגים דפוס אפשרי אחד להשראת קוצר ראייה בעכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי לוודא את המשקפיים כדי לתקן stably על הראש העכבר, מספר פעולות של פרוטוקול זה צריך לשלם תשומת לב רבה. קרום העצם להסירו לחלוטין לפני באמצעות מערכת דבק דנטלי. הדם על הגולגולת גם צריך לנקות בזהירות. בעת כוונון עדין קצת קבילה מייד לאחר היישום של הדבק, אל תזיז את המקל לעתים קרובות לפני שהמערכת דבק מתייבש. מלא את ההוראות של מערכת דבק בזהירות, במיוחד את היחס של כל רכיב של התערובת הסופית. מתי לתפוס את העכבר במהלך קיום של המשקפיים או את המידות להמשך טיפול לאחר הניתוח, לא תופסים את המקל עם הגופה של העכבר יחד. התנועה היחסית בין הגולגולת הסטיק הוא הגורם השכיח ביותר לצניחת למטה המקל. עם ניתוח מתאים ומיומנות אוחז, המספר של יחידים כי תוריד את המקל יהיה קטן מ-1 בניסוי 3 שבועות כולל 20 בני אדם.
השערות ושאר שאריות מזון עלולה להחליק לתוך המרווח בין העין לבין העדשה. זה לא רק להשפיע על השקיפות של העדשה, אך גם פוטנציאל נזק פיזי על פני הקרנית. כדי לשמור על השקיפות של העדשה, לפחות שתי פעמים של ניקיון נחוצים בכל שבוע. זה גם נותן עכברים הזדמנות לטפח את הפנים כדי להפחית את שכיחות הסיבוכים בקרנית. להשאיר רווח כ- 1 מ מ בין המסגרת לבין העור כדי לאפשר את העכבר למצמץ. המסגרת עשויה קשה עכברים להגיע האוכל בחוץ הכלוב דרך ברשת לעיל. לכן, מומלץ לשים אוכל. על רצפת הכלוב ישירות. שינוי הכלוב לתוך אחת נקייה עבור בערך פעמיים בשבוע גם יסייע לשמור את העדשות לנקות. מלוכלך הופכות רשתות ומפזרים גרימת קוצר ראייה באמצעות טופס-מניעת מנגנון. זה אולי ישפיע על הנתונים ולעשות את התוצאה קשה לפרש מאז עדויות הראו ש- FDM ו LIM הם מודל שונה מערכות אטיולוגיה3.
בשל גודל קטן של העין העכבר, הפרמטרים העין נמדד נוטים להיות לא יציב. אנו ממליצים על photorefractor אינפרא-אדום שפותחה על ידי ד ר Schaeffel עבור מדידה שבירה9 ומערכת SDOCT AL4 (ראה טבלה של חומרים). שתי מערכות מציגים מידע מספיק על ששפטתי. את המהימנות של הערך שנמדד כדי להבטיח את הדיר המדידה. על שבירה, כמו טען בדוחות קודמים, חשוב מאוד לשמור על ציר4,מידה14. שומרים הפקד מבטו בתוך ±3 מעלות יכלו לקבל תוצאות יציב. כדי להשיג את המדידה המדויקת, הצינור של מערכת SDOCT עלול להיות שימושי בעת מגרסאות את הכיוון של העין העכבר. למדידה באל, האור המשתקף על הקודקוד הקרנית ואת הגבול הבהיר ליד העצב הם שני סימני אנטומי אמין המבטיחים את הדיר של המדידה הזו.
הפרוטוקול המתואר כאן המושרה הברית קצר משמעותית בעכברים בתוך שבוע אחד. המנגנון אמנם עדיין לא ידוע, בשינוי שבירה ואל אינם בהכרח מקבילים. מאז מלאכותית המשיך לגדול קצר אחרי שבוע אחד, אנו ממליצים על המדידה להיעשות שלוש פעמים סה כ: לפני שבוע, כשלושה שבועות לאחר לנוכח התמריץ. לאחד תרשימי זרימה דוגמה עבור אינדוקציה קוצר ראייה הוא הראה באיור5. בהתבסס על הקודם ח4, החל מ- p21 ושימוש - 30 D עדשות מומלץ לניסויים תאמרי אחרונה עבור מעל 4 שבועות אולי יש שכיחות גבוהה של סיבוכים חמורים קרנית להשפיע על ערך נמדד ולהאיץ את הצריכה של עדשות . הסיבוך השכיח ביותר הוא בקרנית. עכברים לא יכול לנקות את פניהם ואת העפעפיים לובש את המסגרת, אשר יכול להיות סיבת הסיבוך.
ניתן להחיל את המכשיר המתואר פרוטוקול זה לעכברים מיד לאחר הגמילה (p21). זה עשוי לתרום באופן חלקי פנוטיפ חזקה נצפו4. המסגרת היא נשלפת ללא הרדמה כללית. פעולה זו מאפשרת לא רק החוקר לנקות העדשות בקלות, אלא גם להפוך את הסמים אקטואלי משלוח אפשרי4. . כוח נוסף הוא כי ניתן לשנות בקלות העדשות לתוך רשתות ומפזרים או עדשות עם diopters שונים (למשל., בנוסף עדשות), אשר מרחיב את האפשרויות של שיטה זו. מגבלה אחת של שיטה זו היא כי הניתוח צריך להתאמן קצת לפני המסגרות יכול להיות דבקה stably על הניסוי כולו. המידות גם צריך סבלנות כדי לאסוף נתונים אמינים.
עכברים הם תחליף במודל חיה עם שלה אפשרות של מניפולציות גנטיות בעלות נמוכה עבור הרבייה. אנו מקווים הפרוטוקול המתואר כאן יכול להפוך קוצר ראייה ניסיוני בעכברים מודל מעשי יותר למחקר קוצר ראייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
העיצוב של מוכספת העכבר הוחל לקבלת פטנט (יישום מס 201741349).
Acknowledgments
אנו מודים מ. ת Pardue על ייעוץ SDOCT, פ Schaeffel לקבלת ייעוץ על המידות של שבירה, עקמומיות הקרנית, מר Sanshouo יצירה מחדש את נתוני מסגרת תלת מימדי, Miyauchi מ; ק' Tsubota; י' טאנאקה; ס קונדו; ג נאיה; מ יבאקי; י' Miwa; י' Hagiwara; א אישידה; י' טומיטה; י' Katada; אי Yotsukura; ק' טקהאשי; י' וואנג דיונים קריטיים. עבודה זו נתמך על ידי מענקים inAid למחקר מדעי (KAKENHI, מספר 15K 10881) משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT) כדי TK. עבודה זו נתמכת גם המענק לחקר קוצר ראייה מן המעבדה Tsubota, inc. (טוקיו יפן).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| screw | NBK | SNZS-M1.4-10 | |
| washer | MonotaRO | 42166397 | |
| nut | MonotaRO | 42214243 | |
| stick | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| frame | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
| lenses | RAINBOW CONTACT LENS | none | customized for mice use by the company |
| cyanoacrylate glue | OK MODEL | MP 20g | |
| dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | super bond | contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull |
| infrared photorefractor | Steinbeis Transfer Center | none | designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen |
| Spectral domain OCT | Leica | R4310 | |
| Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution | Santen | Mydrin-P | |
| midazolam | Sandoz K.K. | SANDOZ | components for the anesthetic |
| medetomidine | Orion Corporation | Domitor | components for the anesthetic |
| butorphanol tartrate | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | components for the anesthetic |
| 0.1 % purified sodium hyaluronate | Santen | Hyalein | |
| atipamezole hydrochloride | Zenoaq | antisedan |
References
- Dolgin, E.
- Ohno-Matsui, K.
- Morgan, I. G., Ashby, R. S., Nickla, D. L. Form deprivation and lens-induced myopia: are they different. Ophthalmic & Physiological Optics. 33 (3), 355-361 (2013).
- Jiang, X., et al. A highly efficient murine model of experimental myopia. Scientific Reports. 8 (1), 2026 (2018).
- Torii, H., et al. Violet Light Exposure Can Be a Preventive Strategy Against Myopia Progression. EBioMedicine. 15, 210-219 (2017).
- Smith, E. L. 3rd, et al. Effects of Long-Wavelength Lighting on Refractive Development in Infant Rhesus Monkeys. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6490-6500 (2015).
- Gawne, T. J., Siegwart, J. T., Ward, A. H., Norton, T. T. The wavelength composition and temporal modulation of ambient lighting strongly affect refractive development in young tree shrews. Experimental Eye Research. 155, 75-84 (2017).
- Wu, Y., et al. Early quantitative profiling of differential retinal protein expression in lens-induced myopia in guinea pig using fluorescence difference two-dimensional gel electrophoresis. Molecular Medicine Reports. , (2018).
- Schaeffel, F., Burkhardt, E., Howland, H. C., Williams, R. W. Measurement of refractive state and deprivation myopia in two strains of mice. Optometry and Vision Science. 81 (2), 99-110 (2004).
- Tkatchenko, T. V., Shen, Y., Tkatchenko, A. V. Mouse experimental myopia has features of primate myopia. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1297-1303 (2010).
- Faulkner, A. E., Kim, M. K., Iuvone, P. M., Pardue, M. T. Head-mounted goggles for murine form deprivation myopia. Journal of Neuroscience Methods. 161 (1), 96-100 (2007).
- Gu, Y., et al. A Head-Mounted Spectacle Frame for the Study of Mouse Lens-Induced Myopia. Journal of Ophthalmology. 2016, 8497278 (2016).
- Siegwart, J. T. Jr, Norton, T. T. Goggles for controlling the visual environment of small animals. Laboratory Animal Science. 44 (3), 292-294 (1994).
- Tkatchenko, T. V., Tkatchenko, A. V. Ketamine-xylazine anesthesia causes hyperopic refractive shift in mice. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 67-71 (2010).
- Chou, T. H., et al. Postnatal elongation of eye size in DBA/2J mice compared with C57BL/6J mice: in vivo analysis with whole-eye OCT. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3604-3612 (2011).
- Park, H., et al. Assessment of axial length measurements in mouse eyes. Optometry and Vision Science. 89 (3), 296-303 (2012).
