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Biochemistry

एक फ्लोरोसेंट चिढ़ा परख मंच में रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग करें और उनके जेल Renaturation

doi: 10.3791/58824 Published: January 16, 2019
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक हाल ही में विकसित छेड़ने परख मंच का उपयोग एन-टर्मिनल hexahistidine/माल्टोज़-बाध्यकारी प्रोटीन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की विस्तृत प्रक्रिया मौजूद-रिकॉमबिनेंट निकल की सतह से जुड़ी सब्सट्रेट-nitrilotriacetic एसिड चुंबकीय agarose मोती । सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो द्वारा अलग परख नमूनों का बाद में जेल विश्लेषण भी प्रस्तुत किया गया है ।

Abstract

रोगजनन में रहने वाले जीवों के कई जैविक रास्ते में उनकी आवश्यक भूमिकाओं के कारण एंजाइमों का गहन अध्ययन किया जाता है; इसलिए, वे महत्वपूर्ण दवा लक्ष्य कर रहे हैं । हम proteolytic गतिविधि है, जो रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन सब्सट्रेट के उपयोग पर आधारित है की जांच के लिए एक चुंबकीय agarose-मनका आधारित परख मंच विकसित किया है । आदेश में इस परख प्रणाली के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, एक प्रोटोकॉल मानव इम्यूनो वायरस प्रकार 1 (एचआईवी-1) को छेड़ने के उदाहरण पर प्रस्तुत किया है । शुरू परख मंच कुशलतापूर्वक mutagenesis, काइनेटिक, निषेध, या विशिष्टता अध्ययन में एंजाइम गतिविधि माप सहित, के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन में उपयोग किया जा सकता है, और यह उच्च प्रवाह के लिए उपयुक्त हो सकता है सब्सट्रेट स्क्रीनिंग या अन्य proteolytic एंजाइमों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

इस परख प्रणाली में, एप्लाइड सब्सट्रेट एन टर्मिनल hexahistidine (अपने6) और माल्टोज़-बाध्यकारी प्रोटीन (MBP) टैग, तंबाकू खोदना वायरस (टेव) और एचआईवी-1 के लिए दरार साइटों, और एक सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते हैं । सब्सट्रेट कुशलतापूर्वक ई कोलाई कोशिकाओं में उत्पादित किया जा सकता है और आसानी से निकल (Ni) का उपयोग कर शुद्ध-chelate-लेपित मोती. परख के दौरान, मनका के proteolytic दरार-संलग्न सब्सट्रेट फ्लोरोसेंट दरार टुकड़े, जो fluorimetry द्वारा मापा जा सकता है की रिहाई की ओर जाता है । इसके अतिरिक्त, क्लीवेज प्रतिक्रियाओं सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । में जेल renaturation परख घटकों के लिए एक प्रोटोकॉल भी वर्णित है, के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के आंशिक renaturation उनके आणविक वजन और प्रतिदीप्ति के आधार पर पता लगाने में सक्षम बनाता है ।

Introduction

Proteolytic एंजाइमों चयापचय रास्ते में और औद्योगिक अनुप्रयोगों में उनके महत्व के कारण सबसे अधिक गहन जांच की एंजाइम समूहों के हैं, के रूप में अच्छी तरह से । वायरल रोगों में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका, रक्त के थक्के, कैंसर, और हृदय और neurodegenerative रोगों के विनियमन दवा की खोज के क्षेत्र में प्रमुख लक्ष्यों को चिढ़ाती है । इसलिए, सब्सट्रेट विशिष्टता का विस्तृत लक्षण वर्णन और अवरोध करनेवाला (पीआर) के हित की रूपरेखा निर्णायक है और अधिमानतः तेजी से, लागत कुशल द्वारा प्रदर्शन किया, और मजबूत जैव रासायनिक परख1,2, 3.

आजकल, में इन विट्रो की विशाल बहुमत परख की दवा खोज के क्षेत्र में लागू यौगिक रूपरेखा के लिए सजातीय हैं, फ्लोरोसेंट पेप्टाइड आधारित है, और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS)-संगत प्लेटफार्मों4। इसके अलावा, लेबल पेप्टाइड्स केवल पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं, लेकिन वे भी चयनित सब्सट्रेट पर एंजाइम काइनेटिक मापदंडों के निर्धारण के लिए महान उपकरण प्रदान करते हैं । अंय मामलों में, जहां सब्सट्रेट के लेबलिंग संभव नहीं है, जुदाई आधारित परख proteolytic प्रतिक्रियाओं के काइनेटिक गुण3का आकलन करने के लिए एक संभव समाधान प्रदान कर सकते हैं ।

आम तौर पर, इन विट्रो को छेड़ने की परख सब्सट्रेट के दो प्रकार के उपयोग पर आधारित हैं: लघु पेप्टाइड्स या पूरे प्रोटीन. उन मामलों में, जहां छोटे पेप्टाइड अनुक्रम की दरार पर्याप्त दरार के लिए, निंनलिखित मानक दृष्टिकोण लागू होते हैं: (i) ऐसे ऑक्सीकरण इंसुलिन बी चेन, (द्वितीय) परीक्षण के रूप में मानक प्रोटीन सब्सट्रेट की जांच व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सब्सट्रेट्स अंय के लिए, (iii) सिंथेटिक और फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड मिश्रित रसायन विज्ञान, या (iv) आनुवंशिक तरीकों का उपयोग करके बनाई गई पुस्तकालयों स्क्रीनिंग, उदाहरण के लिए, जैविक प्रदर्शन प्रौद्योगिकियों5, 6. पारंपरिक वर्गीकरण के अलावा, अंय उपंयास प्लेटफार्मों सब्सट्रेट पीढ़ी के लिए भी उपलब्ध है (जैसे, proteome के गठन-व्युत्पंन पेप्टाइड पुस्तकालयों7 या आनुवंशिक तरीकों के विशेष उपप्रकार, रिकॉमबिनेंट फ्यूजन की तरह प्रोटीन आधारित सब्सट्रेट8,9,10,11,12).

उपर्युक्त सब्सट्रेट प्रकार और परख के सभी अपने फायदे और सीमाएं हैं, और परख स्वरूपों के विकास के संयोजन और/या ज्ञात प्लेटफार्मों के लाभ में सुधार अभी भी मांग में है । यहां हम एक जुदाई के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-फ्लोरोसेंट चिढ़ा परख, जो रिकॉमबिनेंट सब्सट्रेट इस्तेमाल आधारित है । ये फ्यूजन प्रोटीन अपने6 और MBP टैग से मिलकर बनता है टेव पीआर है, जो ब्याज की सब्सट्रेट अनुक्रम है कि सीधे एक सी टर्मिनल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FP) से जुड़ा है के द्वारा पीछा किया जाता है की एक नियंत्रण दरार साइट (एफ 1) (चित्र 1a) । एक डीएनए ' क्लोनिंग कैसेट ' में ब्याज की एक दरार साइट के लिए कोडिंग अनुक्रम की क्लोनिंग अभिव्यक्ति प्लाज्मिड, जो पहले प्रतिबंध endonucleases द्वारा रैखिक किया गया है में एक ही बंधाव प्रतिक्रिया द्वारा किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: फ्लोरोसेंट चिढ़ाने की परख के सिद्धांत । (एक) मानव इम्यूनो वायरस प्रकार 1 (एचआईवी-1) के द्वारा एक फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट और अपनी दरार का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाया गया है । तीर के भीतर दरार की स्थिति को इंगित करता है मैट्रिक्स/कैप्सिड दरार साइट एचआईवी के अनुक्रम-1 चिढ़ाना (VSQNY * PIVQ) । () फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट को नी-ंत् चुंबकीय-मनका-आधारित परख और polyacrylamide जेल ट्रो द्वारा एंजाइम प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से, के रूप में कार्यप्रवाह आरेख में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

हालांकि proteolytic परख समान रिकॉमबिनेंट प्रोटीन सब्सट्रेट का उपयोग कर-एक संबध टैग, एक proteolytic दरार साइट युक्त, और एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन-पहले से ही8,9,10, प्रणाली वर्णित किया गया है यहां प्रस्तुत करने के लिए एकीकृत और इन तरीकों के लाभों पर सुधार करना चाहता है । एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि इस परख मंच में फ्यूजन प्रोटीन सब्सट्रेट MBP से सुसज्जित करने के लिए प्रोटीन घुलनशीलता13 बढ़ाने और टेव पीआरएस के लिए एक नियंत्रण दरार साइट शामिल हैं । इसके अलावा, सब्सट्रेट नई पीढ़ी फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते हैं, जो अत्यधिक स्थिर हैं और सब्सट्रेट एकत्रीकरण को रोकने के लिए एक monomeric रूप है । mTurquoise2 के पहले प्रकाशित आवेदन के अलावा-और mApple-जुड़े रूपों14, यहां हम भी एक रिकॉमबिनेंट एक monomeric बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mEYFP) फ्लोरोसेंट टैग युक्त सब्सट्रेट के उपयोग द्वारा दिए गए परिणाम दिखा । इसके द्वारा हम अंय फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ प्रणाली की अनुकूलता का प्रदर्शन और परिणाम है कि चिढ़ाने परख द्वारा प्राप्त किया जा सकता है की कुछ सामांय प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं और एक निकल-nitrilotriacetic एसिड (Ni-ंत्) लेपित चुंबकीय-agarose-मनका-संलग्न रूप में परख के लिए सब्सट्रेट्स के रूप में उपयोग किया जाता है । सी-टर्मिनल दरार उत्पादों के लिए ब्याज की चिढ़ा द्वारा दरार पर supernatant में मनका सतह से मुक्त कर रहे हैं । supernatant की जुदाई के बाद (एंजाइम और क्लीवेज उत्पादों से युक्त) चुंबकीय मोतियों से, प्रतिदीप्ति एंजाइम के क्लीवेज गुण निर्धारित करने के लिए मापा जा सकता है. पहले वर्णित विधियों के विपरीत, यहां प्रस्तुत प्रणाली में, सब्सट्रेट और सी टर्मिनल दरार उत्पादों की मात्रा विशिष्ट quantified एक विस्तृत सब्सट्रेट अंशांकन प्रक्रिया पर आधारित हैं । परख प्रणाली एक एसडीएस द्वारा समर्थित किया जा सकता है-परख नमूनों के पृष्ठ विश्लेषण; एक बाद में फ्लोरोसेंट जेल दृश्य ट्रो के बाद या nondenatured और विकृत फ्लोरोसेंट घटकों, क्रमशः14के जेल renaturation के बाद तुरंत लागू किया जा सकता है ।

लचीलापन और ' क्लोनिंग ' कैसेट की संरचना एक समय की अनुमति और लागत निर्माण में दृश्यों की एक विस्तृत विविधता के कुशल सम्मिलन और, इस प्रकार, सब्सट्रेट पुस्तकालयों की पीढ़ी को बढ़ावा देता है. के बाद से सभी परख कदम स्वचालन और HTS-संगत कर रहे हैं, प्रणाली के लिए विशेष रूप से आकर्षक हो सकता है, उदाहरण के लिए, विशिष्टता माप और mutagenesis अध्ययन, या यह भी प्रभावी रूप से औद्योगिक छेड़ने अवरोधक स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है और/या एंटीवायरल दवा विकास, के रूप में अच्छी तरह से ।

एंजाइम काइनेटिक मापदंडों (कश्मीरकैट, कश्मीरएम) विकसित जुदाई आधारित परख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है; इसलिए, यह इस तरह के समय के रूप में व्यक्तिगत एंजाइम काइनेटिक माप, प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है, सब्सट्रेट-निर्भर, और निषेध अध्ययन. यह साबित होता है कि रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन सब्सट्रेट अक्सर उपयोग सिंथेटिक oligopeptide सब्सट्रेट के लिए अच्छा विकल्प प्रदान करते हैं, और polyprotein सब्सट्रेट करने के लिए अपने उच्च समानता के कारण, वे स्वाभाविक रूप से होने वाली प्रतिनिधित्व एंजाइम सब्सट्रेट अधिक सही बातचीत.

Protocol

1. सब्सट्रेट कोडिंग अभिव्यक्ति plasmids की पीढ़ी

  1. Linearize ने pDest-आमा-MBP-FP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड द्वारा PacI तथा NheI प्रतिबन्ध endonucleases । pDest की पीढ़ी के लिए-अपने6-MBP-FP, देखें Bozóki एट अल.14
    1. जोड़ें 1500-2000 pDest के µ जी-अपने6-MBP-FP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड, 2 µ एल PacI के प्रत्येक और NheI प्रतिबंध endonucleases, 10x बफर के 10 µ एल ( सामग्री की तालिकादेखें), और nuclease-मुफ्त पानी (NFW) के लिए एक µ ट्यूब में १०० microcentrifuge l ।
    2. 1 एच के लिए ३७ ° c पर प्रतिक्रिया मिश्रण मशीन
  2. प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए 6x डीएनए बैंगनी लोडिंग डाई के 20 µ एल जोड़ें और ट्रो द्वारा दरार उत्पादों को अलग, 1% agarose जेल का उपयोग कर । मानक के रूप में एक 1 केबी डीएनए सीढ़ी लागू करें ।
  3. ताे बफर के 20 मिलीलीटर में 15 मिनट के लिए जेल कुल्ला (४० मिमी Tris, 20 मिमी एसिटिक एसिड, 1 मिमी EDTA, पीएच ८.५) SYBR ग्रीन समाधान के 20 µ एल युक्त और प्लाज्मिड जेल से बाहर रैखिक agarose के बैंड एक्साइज, एक तेज उपकरण का उपयोग कर ।
    नोट: एक अंधेरे पढ़ने नीले transilluminator (DRBT), रैखिक pDest-अपने6-MBP-FP प्लाज्मिड द्वारा जेल रोशन करते हुए लगभग 7-8 kB में एक असतत और उज्ज्वल बैंड के रूप में प्रकट होता है ।
  4. एक जेल निष्कर्षण किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार का उपयोग करके रैखिक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड जेल टुकड़ा से शुद्ध ।
  5. रैखिक pDest में सब्सट्रेट अनुक्रम डालें-अपने6-MBP-FP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड.
    1. आगे (FWD) और रिवर्स (REV) ई. कोलाई codon-अनुकूलित oligonucleotide प्राइमरों के हित के सब्सट्रेट अनुक्रम के लिए कोडिंग ।
      नोट: annealed प्राइमरों एकजुट PacI और NheI प्रतिबंध endonuclease दरार साइटों (चित्रा 2) के अनुरूप समाप्त होता है द्वारा किया जाएगा ।
      1. मिश्रण १५० रैखिक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के एनजी २०० FWD और २०० एक ०.२ मिलीलीटर पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया (पीसीआर) ट्यूब में REV oligonucleotide प्राइमरों के एनजी के साथ और µ जोड़कर मात्रा 17 NFW एल को समायोजित करें ।
      2. 2 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण गर्मी और, तो, 4 डिग्री सेल्सियस कम 2 मिनट के लिए ।
    2. बंधाव द्वारा रैखिक प्लाज्मिड में annealed प्राइमरों के सम्मिलन प्रदर्शन.
      1. टी-4 ligase बफर के 2 µ एल जोड़ें (10x) और प्लाज्मिड प्राइमरों रैखिक annealed युक्त मिश्रण करने के लिए टी-4 ligase के 1 µ एल.
      2. 16 एच के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर बंधाव मिश्रण की मशीन ।

Figure 2
चित्रा 2 : Oligonucleotide प्राइमर एक proteolytic दरार साइट अनुक्रम के लिए कोडिंग । आगे और रिवर्स प्राइमरों सांकेतिक शब्दों में बदलना VSQNY * एचआईवी के PIVQ दरार साइट अनुक्रम-1 पीआर । पूरक oligonucleotide प्राइमरों एनीलिंग के बाद, कम दोहरे फंसे डीएनए चिपचिपा समाप्त होता है, PacI और NheI प्रतिबंध endonucleases की है कि इसी के लिए इसी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. BL21 (DE3) सक्षम कोशिकाओं के बंधाव मिश्रण के 5 µ एल द्वारा १०० µ एल रूपांतरण और lysogeny शोरबा पर कोशिकाओं (पौंड) आगर एम्पीसिलीन युक्त प्लेटें फैला ।
    नोट: फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक सफल बंधाव के बाद ही N-टर्मिनल संलयन टैग के साथ एक ही खुले पढ़ने के फ्रेम में होगा । कुछ दिनों के परिवर्तन के बाद, कालोनियों (अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के साथ डाला दरार रुचि के साइट के लिए कोडिंग) दिखाई प्रतिदीप्ति के साथ या यहां तक कि एक DRBT का उपयोग कर के बिना दिखा देंगे ।
  2. चित्रित कालोनियों से ग्लिसरॉल स्टाक तैयार करें ।
    1. धो एक ५० मिलीलीटर में एक असतत कॉलोनी केंद्रापसारक एम्पीसिलीन युक्त पौंड मध्यम के 5 µ l युक्त ट्यूब (१०० µ जी के अंतिम एकाग्रता में/
    2. यह 8 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन जबकि लगातार २२० rpm पर मिलाते हुए; फिर, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं फसल ।
    3. धीरे ८०% ग्लिसरॉल समाधान के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित (आसुत जल के साथ पतला) और 10 मिमी MgCl2 के ५०० µ एल जोड़ने के निलंबन के लिए समाधान ।
    4. एक ठंड ट्यूब को निलंबन स्थानांतरण और स्टॉक्स-७० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  3. डीएनए अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न प्लाज्मिड के अनुक्रम की जाँच करें ।
    1. ग्लिसरॉल शेयर के 10 µ एल जोड़ें (चरण १.७ में तैयार) £ १०० एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में एम्पीसिलीन µ ग्राम युक्त के 5 मिलीलीटर के लिए ।
    2. 16 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर निलंबन की मशीन जबकि लगातार २२० rpm पर मिलाते हुए; फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं फसल ।
    3. एक प्लाज्मिड miniprep किट द्वारा सेल गोली से प्लाज्मिड अभिव्यक्ति को अलग ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार, और डीएनए अनुक्रमण के लिए शुद्ध प्लाज्मिड का उपयोग करें ।
      नोट: अनुक्रमण के लिए, 5 '-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3 ' (फॉरवर्ड) और 5 '-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3 ' (रिवर्स) oligonucleotide प्राइमरों का इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट्स की अभिव्यक्ति

  1. स्टार्टर कल्चर तैयार करें ।
    1. ग्लिसरॉल शेयर के 10 µ एल जोड़ें (चरण १.७ में तैयार) £ १०० एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में एम्पीसिलीन µ ग्राम युक्त के 5 मिलीलीटर के लिए ।
    2. 15 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर निलंबन मशीन जबकि लगातार २२० rpm पर मिलाते हुए ।
  2. बैक्टीरियल संस्कृति (5 एमएल) के लिए ५० मिलीलीटर ताजा पौंड मध्यम १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन में एक ५०० मिलीलीटर बाँझ Erlenmeyer कुप्पी शामिल करने के लिए स्थानांतरण ।
  3. ३७ ° c पर एक ६०० एनएम तरंग दैर्ध्य में 0.6-0.8 की एक अवशोषक के लिए कोशिकाओं को बढ़ने, जबकि लगातार २२० rpm पर मिलाते हुए ।
    नोट: २.५ कदम पर लागू किया जा करने के लिए एक टेट्रासाइक्लिन उपचार है, तो यह ६०० एनएम पर ०.६ से अधिक की एक अवशोषक के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुशंसित नहीं है ।
  4. प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए 1 मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) जोड़ें ।
  5. यदि एक टेट्रासाइक्लिन उपचार लागू नहीं है, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए संस्कृति मशीन जबकि लगातार २२० rpm पर मिलाते हुए और २.६ कदम के साथ प्रोटोकॉल जारी है । एक टेट्रासाइक्लिन उपचार लागू किया जाता है, तो चरण 2.5.1-2.5.3 के साथ प्रोटोकॉल जारी रखें ।
    नोट: कुछ एफपीएस ई. कोलाई कोशिकाओं द्वारा उत्पादित एक लंबी परिपक्वता समय हो सकता है (पिछले काम देखें)16,17; इन मामलों में, प्रोटीन अनुवाद टेट्रासाइक्लिन उपचार द्वारा वैकल्पिक रूप से गिरफ्तार किया जा सकता है, ताकि सब्सट्रेट समाधान की फ्लोरोसेंट उपज बढ़ाने के लिए ।
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए सेल निलंबन गर्मी जबकि लगातार २२० rpm पर मिलाते हुए; फिर, एक टेट्रासाइक्लिन समाधान (२०० µ g/एमएल) के अंतिम एकाग्रता में जोड़ें ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर पसंद की फ्लोरोसेंट प्रोटीन की परिपक्वता समय के अनुसार सेल संस्कृति गर्मी, जबकि लगातार २२० rpm पर मिलाते हुए ।
  6. 2 x 25 एमएल स्थानांतरण संस्कृति के ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों को साफ करने के लिए और ४,००० x g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं फसल ।
  7. supernatant त्यागें और बैक्टीरियल सेल छर्रों पर-७० डिग्री सेल्सियस के लिए ंयूनतम 1 h ।
    नोट: व्यक्त फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट युक्त कोशिकाओं के साथ या यहां तक कि एक DRBT का उपयोग कर के बिना दिखाई प्रतिदीप्ति दिखाते हैं ।

3. सेल व्यवधान

  1. बर्फ पर जमे हुए सेल गोली प्लेस और इसे 15 मिनट के लिए गल ।
  2. lysis बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें (५० mm णः2PO4, ३०० mm NaCl, 10 mm imidazole, ०.०५% 20 के बीच, पीएच 8) गोली और कोशिकाओं को निलंबित ।
  3. ताजा तैयार phenylmethanesulfonyl के 10 µ एल जोड़ें-फ्लोराइड (PMSF) को छेड़ो अवरोधक समाधान (८.७ मिलीग्राम/एमएल, इथेनॉल में भंग) निलंबन के लिए ।
  4. lysozyme के 2 मिलीग्राम और DNase के 20 इकाइयों के निलंबन के लिए और इसे निलंबित जोड़ें ।
  5. 15 मिनट के लिए बर्फ पर झूला मशीन, और यह कभी कभार भंवर ।
  6. १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के निलंबन के 2 x 1 मिलीलीटर स्थानांतरण और sonicate 3 मिनट के लिए निलंबन, sonication के 10 एस और आराम के 5 एस के दौर में ।
  7. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए १०,००० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक; फिर, फ्लोरोसेंट supernatant निकालें (बैक्टीरियल सेल lysate को मंजूरी दे दी) ध्यान से प्रत्येक ट्यूब से और नए microcentrifuge ट्यूबों के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: के साथ या यहां तक कि एक DRBT का उपयोग कर के बिना दिखाई प्रतिदीप्ति दिखा फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट युक्त lysates मंजूरी दे दी है और 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है । इसे फ्रीज न करें । खाली lysates नमूना तैयारी के लिए सीधे का उपयोग किया जा सकता है (४.१ अनुभाग देखें) या भी सब्सट्रेट शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (देखें 4.5.1 चरण) ।

4. Ni-ंत् चुंबकीय-मनका आधारित छेड़ने की परख

नोट: परख मंच के लचीलेपन के कारण, यह अध्ययन के कई विभिंन प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस कारण के लिए और पसंद के एंजाइमों की गतिविधि दर में अंतर के कारण, परख मापदंडों के कुछ (जहां यह चिह्नित है) स्पष्ट रूप से वर्णित नहीं किया जा सकता है लेकिन व्यक्तिगत उद्देश्य और प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है । एक मार्गदर्शन के रूप में, अध्ययन के कुछ प्रकार के मापदंडों विशेष कदम पर चिह्नित हैं ।

  1. नमूना तैयारी
    1. सब्सट्रेट-संलग्न चुंबकीय मोतियों की पीढ़ी
      1. प्लेस एक बंद कर दिया 2 मिलीलीटर कम प्रोटीन-बाध्यकारी ( सामग्री की तालिकादेखें) microcentrifuge ट्यूब नए या पुनर्नवीनीकरण युक्त (४.७ अनुभाग देखें) Ni-ंत् एक चुंबकीय कण केंद्रित (MPC) में चुंबकीय agarose मोती ।
        नोट: एप्लाइड मनका निलंबन की राशि प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर स्थापित किया जाना है । हम एक प्रयोग में चुंबकीय मनका समाधान (5%, v/वी) के 1 मिलीलीटर का इस्तेमाल किया ।
      2. मोती दीवार और/या microcentrifuge ट्यूब के ढक्कन में छड़ी कर सकते हैं; इसलिए, हर दिशा में MPC उल्टा बारी करने के लिए सुनिश्चित करें कि मोतियों की सभी एकत्र कर रहे हैं ।
      3. supernatant निकालें और इसे छोड़ें ।
      4. lysis बफर द्वारा मोतियों को धोएं ।
        1. मोती के लिए lysis बफर के १.८ मिलीलीटर जोड़ें और MPC से बंद ट्यूब हटा दें ।
        2. मिलाते हुए ट्यूब में मोतियों को निलंबित और/या ट्यूब उल्टा जब तक नमूना पूरी तरह से सजातीय है मोड़ ।
        3. ट्यूब को वापस एमपीसी में रखें और मोतियों को इकट्ठा करने के लिए इसे उल्टा-नीचे मोड़ लें ।
        4. ट्यूब खोलें और supernatant को छोड़ें ।
      5. जोड़ें 1.0-1.8 मिलीलीटर की मंजूरी दे दी lysate (चरण ३.७ में तैयार) मोतियों के लिए और MPC से ट्यूब हटा दें ।
      6. बंद ट्यूब उल्टा बारी जब तक मोती पूरी तरह से सजातीय है और धीरे से 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक रोटेटर द्वारा ट्यूब घुमाएं ।
      7. इसे एमपीसी में रखें और मोतियों से और ढक्कन से क्लियर्ड सेल lysate को हटा दें ।
        नोट: साफ़ किया गया कक्ष lysate छोड़ दिया या आगे उपयोग के लिए सहेजा जा सकता है (नोट चरण ३.७ के बाद देखें) ।
      8. जोड़ें 1% 20 के बीच (पीएच 7) सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न चुंबकीय मोती (SAMBs) ।
        नोट: SAMBs दिखाएं प्रतिदीप्ति के साथ या भी एक DRBT का उपयोग किए बिना दिखाई देते हैं ।
    2. SAMBs की धुलाई
      1. SAMB सस्पेंशन के साथ ट्यूब प्लेस MPC में और supernatant त्यागें ।
      2. प्रत्येक बफर के साथ SAMBs 3x धो: i) 1% के बीच 20 (पीएच 7) के १.८ मिलीलीटर; ii) वाशिंग बफर के १.८ मिलीलीटर (५० mm णः2PO4, ३०० mm NaCl, 5 mm imidazole, ०.०५% के बीच 20, पीएच 7); iii) दरार बफर के १.८ मिलीलीटर (५० mm णः2PO4, ३०० mm NaCl, ०.०५% के बीच 20, पीएच 7) ।
        नोट: वाशिंग प्रक्रिया के लिए, चरण 4.1.1.4 देखें । दरार बफर प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार बदला जा सकता है, लेकिन यह संगतता का निर्धारण करने के लिए नी-ंत् चुंबकीय मोतियों की पुस्तिका की जाँच करने के लिए सिफारिश की है.
    3. SAMB स्टॉक समाधान की तैयारी
      1. एक SAMB स्टॉक समाधान बनाने के लिए धोया SAMBs करने के लिए एक दरार बफर जोड़ें ।
        नोट: बफर के अलावा, शेक या ट्यूब उल्टा बारी नहीं है । दरार बफर की मात्रा व्यक्तिगत प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है और चुंबकीय मोतियों की संख्या के आधार पर गणना की जानी चाहिए (चरण 4.1.1.1 देखें) और चरण 4.1.4.2 में इस्तेमाल किया जा करने के लिए वॉल्यूम पर. 2 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए, लागू की गई मात्रा १,९०० µ एल अप करने के लिए है ( 1 तालिकादेखें) । SAMB स्टॉक समाधान की सिफारिश की चुंबकीय मनका घनत्व 2% है-10% (v/
        अध्ययन के प्रकार क्लीवेज बफर की मात्रा (µ एल)
        S-निर्भर मापन (चित्र 4) १६००
        समय-पाठ्यक्रम मापन (छवि 5 ए) १६००
        निषेध अध्ययन (अंजीर 5B) १९००
        पीएच निर्भरता अध्ययन (छवि 6) १४००

        तालिका 1: विभिंन प्रकार के माप में SAMB स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए उपयोग किए गए क्लीवेज बफ़र की मात्रा ।
      2. बंद ट्यूब MPC से निकालें । SAMB स्टॉक समाधान का तुरंत उपयोग करें या इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक के लिए स्टोर कर दें ।
    4. SAMB स्टॉक समाधान का उपयोग कर परख नमूनों की जनरेशन
      नोट: परख के इस भाग का ब्यौरा व्यक्तिगत प्रयोगात्मक डिजाइन पर दृढ़ता से निर्भर है (नमूना प्रकार 2 तालिकामें दिखाए जाते हैं) ।
      नमूना प्रकार नोट्स
      प्रतिक्रिया नमुना (नि.) -दरार गुण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया
      -दरार बफर में एंजाइम और सब्सट्रेट दोनों शामिल
      सब्सट्रेट रिक्त नमूना (बी) -सहज सब्सट्रेट पृथक्करण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया (चरण 4.6.2 देखें)
      -केवल दरार बफर में सब्सट्रेट शामिल
      सब्सट्रेट नियंत्रण नमूना (ग) -detemining सब्सट्रेट एकाग्रता के लिए (चरण 4.6.3 देखें)
      -केवल रेफरेंस बफर में सब्सट्रेट होता है

      तालिका 2: नी-ंत् चुंबकीय-मनका के नमूना प्रकार की चिढ़ाना परख ।
      1. कम प्रोटीन के 2 मिलीलीटर तैयार परख नमूनों के लिए microcentrifuge ट्यूबों बाध्यकारी ।
        नोट: अंय कम प्रोटीन बाध्यकारी प्लास्टिक के सामान भी इस्तेमाल किया जा सकता है । SAMBs के मुक्त आंदोलन को सुनिश्चित करने के लिए गोल या सपाट-नीचे ट्यूबों का उपयोग करें । 3 तालिकामें ट्यूबों की सिफारिश की संख्या देखें ।
        अध्ययन के प्रकार आर बी सी
        S-निर्भर मापन (चित्र 4) 5 5 2
        समय-पाठ्यक्रम मापन (छवि 5 ए) 6 6 2
        निषेध अध्ययन (अंजीर 5B) 7 7 1
        पीएच निर्भरता अध्ययन (छवि 6) 5 5 1

        तालिका 3: प्रदर्शन किया अध्ययन में प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए आवश्यक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों की संख्या ।
      2. सजातीयता जब तक SAMB शेयर समाधान निलंबित और सब्सट्रेट की राशि का हस्तांतरण तुरंत नमूना शीशियों में प्रतिक्रियाओं में विश्लेषण किया जाना है । अनुशंसित मात्रा 25-300 µ एल है, लेकिन यह व्यक्तिगत प्रयोगात्मक डिजाइन (तालिका 4) के अनुसार स्थापित किया जाना है ।
        नोट: जांच करें कि सभी SAMBs ट्यूबों के तल में मापा गया है । SAMBs ट्यूब, जो परख परिणाम विकृत कर सकते है की दीवार से चिपके हो सकता है । यदि भिंन खंड क्रमिक रूप से मापा जा करने के लिए हैं, तो उच्चतम वॉल्यूम के साथ aliquoting प्रारंभ करें और पिपेट और/या पिपेट युक्तियों के परिवर्तन को ंयूनतम करने का प्रयास ।
        अध्ययन के प्रकार आर बी सी
        S-निर्भर मापन (चित्र 4) 25 – ५० – १०० – १५० – २५० 25 – ५० – १०० – १५० – २५० 25
        समय-पाठ्यक्रम मापन (छवि 5 ए) 25 25 25
        निषेध अध्ययन (अंजीर 5B) १२० १२० १२०
        पीएच निर्भरता अध्ययन (छवि 6) १०० १०० १००

        तालिका 4: प्रदर्शन अध्ययन में प्रत्येक नमूना प्रकार के नमूना शीशियों में मापा SAMB समाधान की मात्रा.
      3. mpc में aliquoted SAMB निलंबन युक्त नमूना ट्यूबों प्लेस और थोड़ा mpc आगे और पीछे ले जाएं ।
      4. ध्यान से supernatant को SAMBs से हटा कर उसे त्याग दें ।
      5. MPC से ट्यूबों निकालें और प्रतिक्रिया बफर की गणना की मात्रा जोड़ने (दरार या रेफरेंस बफर [१०० mM EDTA, ०.०५% 20 के बीच, पीएच 7]) ध्यान से SAMBs करने के लिए ।
        नोट: व्यक्तिगत प्रयोगात्मक डिजाइन (तालिका 5) के अनुसार बफर मात्रा की गणना. 2 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए, प्रतिक्रिया मिश्रण की सिफारिश की अंतिम मात्रा (इस चरण में जोड़ा जा करने के लिए प्रतिक्रिया बफर की मात्रा + समाधान की मात्रा चरण 4.2.3 में जोड़ा जा करने के लिए) है 50-150 µ l सुनिश्चित करें कि सभी SAMBs जोड़े गए बफ़र में धोया जाता है । रेफरेंस बफ़र सब्सट्रेट नियंत्रण (सी) के नमूनों के मामलों में दरार बफर के बजाय प्रयोग किया जाता है । एक अवरोध अध्ययन के लिए, चुनाव के अवरोधक इस कदम पर जोड़ा जा करने के लिए सिफारिश की है ।
        अध्ययन के प्रकार प्रतिक्रिया बफर की मात्रा (µ एल)
        S-निर्भर मापन (चित्र 4) ६८ µ एल दरार बफर
        समय-पाठ्यक्रम मापन (छवि 5 ए) ६८ µ एल दरार बफर
        निषेध अध्ययन (अंजीर 5B) ६७.३ µ l दरार बफर + ०.७ µ एल अवरोधक स्टॉक समाधान *
        पीएच निर्भरता अध्ययन (छवि 6) ६९.५ µ l क्लीवेज बफर * *

        तालिका 5: प्रदर्शन अध्ययन में प्रतिक्रिया बफर की मात्रा । * Amprenavir dimethyl-sulfoxide में हल किया गया था; amprenavir स्टॉक सॉल्यूशंस (1 एनएम से 1 µ मीटर सांद्रता) निरोधात्मक अध्ययन के लिए लागू किया गया (देखें चित्रा 5B) । * * पीएच 6.0-8.5 से एप्लाइड क्लीवेज बफर की रेंज ।
      6. ट्यूबों के ढक्कन बंद करें । अब नमूने की परख के लिए तैयार हैं ।
        नोट: नमूनों को 24 ज तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है, लेकिन भंडारण केवल तभी लागू होता है, जब तैयारी के तुरंत बाद SAMB स्टॉक सॉल्यूशन का उपयोग किया गया हो (step 4.1.3.2 देखें) ।
  2. proteolytic प्रतिक्रियाओं की दीक्षा
    1. प्रायोगिक जरूरतों के अनुसार proteolytic एंजाइम समाधान तैयार करें ।
      नोट: यह भंग करने के लिए एक दरार बफर का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है और/ एचआईवी की शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल-114 और टेव पीआरएस18 पहले प्रकाशित किया गया है ।
    2. thermoshaker के आंदोलन की दर (६०० rpm) और मशीन तापमान (तालिका 6) सेट करें ।
      अध्ययन के प्रकार मशीन तापमान (° c)
      S-निर्भर मापन (चित्र 4) ३७
      समय-पाठ्यक्रम मापन (छवि 5 ए) ३७
      निषेध अध्ययन (अंजीर 5B) ३७
      पीएच निर्भरता अध्ययन (छवि 6) 30

      तालिका 6: विभिंन प्रकार के अध्ययन में लागू की गई मशीन तापमान । एचआईवी-1 पीआर के लिए, ३७ ° c की सिफारिश की है, जबकि 30 डिग्री सेल्सियस टेव पीआर के लिए सिफारिश की है ।
    3. proteolytic प्रतिक्रियाओं को प्रारंभ करने के लिए प्रतिक्रिया नमूनों के लिए एंजाइम समाधान जोड़ें ।
      नोट: सब्सट्रेट खाली (बी) और सी नमूनों के मामले में, क्रमशः दरार बफर (एंजाइम बफर) और रेफरेंस बफर जोड़ें । मात्रा को व्यक्तिगत प्रयोगात्मक आवश्यकताओं (तालिका 7) के अनुसार गणना की जानी है । 2 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए, प्रतिक्रिया मिश्रण की सिफारिश की अंतिम मात्रा (4.1.4.5 चरण में जोड़ा प्रतिक्रिया बफर की मात्रा + समाधान की मात्रा इस चरण में जोड़ा जा करने के लिए) है 50-150 µ l
      अध्ययन के प्रकार एंजाइम समाधान/एंजाइम बफर/रेफरेंस बफर की मात्रा (µ एल)
      S-निर्भर मापन (चित्र 4) 2
      समय-पाठ्यक्रम मापन (छवि 5 ए) 2
      निषेध अध्ययन (अंजीर 5B) 2
      पीएच निर्भरता अध्ययन (छवि 6) ०.५

      तालिका 7: एंजाइम समाधान/एंजाइम बफर/रेफरेंस बफर की मात्रा प्रदर्शन अध्ययन के मामले में परख नमूनों के आरंभ के दौरान जोड़ा ।
    4. धीरे ट्यूबों चलती द्वारा ध्यान से मोतियों हलचल, और ट्यूबों तुरंत पहले से ही मिलाते हुए thermoshaker में जगह है ।
      नोट: मैनुअल नमूना समाप्ति (४.३ अनुभाग देखें) दीक्षा से अधिक समय लगता है; इसलिए, एक पंजीकृत देरी से कम 2 मिनट प्रतिक्रियाओं की दीक्षा के बीच सिफारिश की है ।
    5. प्रयोगात्मक डिजाइन (तालिका 8) के अनुसार नमूनों की मशीन ।
      अध्ययन के प्रकार गर्मी बार (मिनट)
      S-निर्भर माप (अंजीर 4a) 7
      S-निर्भर मापन (अंजीर 4B) १२०
      समय-पाठ्यक्रम मापन (छवि 5 ए) 0 – २.५ – 5 – 10 – 15 – 20
      निषेध अध्ययन (अंजीर 5B) 10
      पीएच निर्भरता अध्ययन (छवि 6) ६०

      तालिका 8: मशीन बार अलग माप में परख नमूनों के लिए आवेदन किया ।
  3. proteolytic प्रतिक्रियाओं का Termination
    1. नमूने के बाहर ले जाओ, 30 एस मशीन के अंत से पहले, और यह तुरंत स्पिन ।
    2. mpc पर ट्यूब प्लेस, यह 15 एस के लिए खड़े हो जाओ, और थोड़ा mpc आगे पीछे ले जाने के लिए ।
    3. ढक्कन खोलो और supernatant सावधानी से एक थाली या एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: पिपेट की नोक के साथ केंद्रित मोतियों को छूने नहीं है । सी के नमूनों की एकत्र supernatant और एक उच्च स्तर की दरार के साथ आर नमूने के साथ या यहां तक कि एक DRBT के उपयोग के बिना दिखाई प्रतिदीप्ति दिखा सकते हैं ।
  4. फ्लोरोसेंट जांच
    1. एक काला आधा क्षेत्र microplate करने के लिए अलग नमूना supernatants के 2 x 30 µ एल स्थानांतरण ।
    2. उचित उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति को मापने ।
      नोट: के रूप में अच्छी तरह से दरार बफर और रेफरेंस बफर के बुनियादी प्रतिदीप्ति उपाय । फ़िल्टर युग्म मापा फ्लोरोसेंट प्रोटीन (तालिका 9) के आधार पर चुना जाना चाहिए ।
      फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्तेजना फिल्टर (एनएम) उत्सर्जन फ़िल्टर (एनएम)
      mTurqiouse2 355/40 460/25
      mEYFP 544/15 590/10
      mApple 544/15 590/10

      तालिका 9: उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया ।
  5. अंशांकन
    नोट: 4.6.1 चरण में अंशांकन घटता उत्पन्न करने के लिए, प्रतिदीप्ति की तीव्रता मूल्यों दरार या रेफरेंस-बफर-हल अलग सांद्रता पर शुद्ध सब्सट्रेट मापा जा करने की आवश्यकता.
    1. फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट शुद्ध ।
      नोट: शुद्धिकरण के लिए, सब्सट्रेट रिक् त के SAMBs (B) नमूने को छेड़ने की परख के बाद एकत्र किया जा सकता है, या एक नया SAMB निलंबन भी तैयार किया जा सकता है (देखें वर्गों शुू और 4.1.2) ।
      1. SAMBs के साथ एक ट्यूब प्लेस दरार बफर की 1 मिलीलीटर में निलंबित (2%-10%, v/वी) mpc करने के लिए और हर दिशा में mpc उल्टा मोड़ से चुंबकीय मोती इकट्ठा ।
      2. ट्यूब खोलें और दरार बफर, दोनों ट्यूब और ढक्कन से हटा दें ।
      3. MPC से ट्यूब निकालें और SAMBs के लिए रेफरेंस बफर के 400-600 µ एल जोड़ें ।
      4. धीरे से 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक रोटेटर के साथ बंद ट्यूब घुमाएं ।
      5. mpc पर ट्यूब प्लेस और mpc उल्टा मोड़ से मोतियों को इकट्ठा ।
      6. शुद्ध बरकरार फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट (eluate) युक्त supernatant निकालें और यह एक नया कम प्रोटीन बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
        नोट: Eluate स्पष्ट रूप से दिखाई प्रतिदीप्ति के साथ या यहां तक कि एक DRBT का उपयोग कर के बिना दिखाता है ।
    2. समानांतर बफ़र exchange दो ०.५ मिलीलीटर 10k ultrafiltration डिवाइस का उपयोग करके निष्पादित करें ।
      1. प्रत्येक ultrafiltration डिवाइस में तैयार eluate (200-300 µ l) के आधे वॉल्यूम को मापने ।
      2. के बाद प्रत्येक केंद्रापसारक कदम पर, पहले और रेफरेंस बफर और दरार बफर, क्रमशः द्वारा दूसरा ultrafiltration उपकरणों में केंद्रित eluate पतला ।
      3. वसूली के बाद, 120-200 µ एल के बीच, एक ही वॉल्यूम के लिए अलग बफ़र्स में हल केंद्रित नमूनों को समायोजित करें ।
        नोट: अब दरार बफर के प्रोटीन सामग्री-हल सब्सट्रेट रेफरेंस बफर के समान है-हल सब्सट्रेट; इसलिए, यह आवश्यक करने के लिए कदम 4.5.3 में बाद एक के प्रोटीन सामग्री निर्धारित नहीं है, अगर विधि प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए इस्तेमाल EDTA के साथ हस्तक्षेप ।
    3. २८० एनएम पर अवशोषक मापने के द्वारा या तो रेफरेंस या दरार बफर में भंग सब्सट्रेट की प्रोटीन सामग्री का निर्धारण ।
      नोट: अंय तरीकों (जैसे, ब्रैडफोर्ड या bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख) भी प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन EDTA के साथ संभव हस्तक्षेप (रेफरेंस बफर में मौजूद) या फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट के अवशोषण के साथ की जरूरत है माना जाता. सब्सट्रेट समाधान के प्रारंभिक प्रोटीन सामग्री चरण 4.5.4 में लागू किया जा करने के लिए एक उपयुक्त श्रेणी में एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के क्रम में 0.4-2.0 मिलीग्राम/एमएल के बीच होने की सिफारिश की है । विलुप्त गुणांक के लिए तालिका 10 देखें ।
      सब्सट्रेट आण्विक वजन
      डा
      विलुप्त गुणांक
      (एम-1 सेमी-1, पर २८० एनएम पानी में मापा)
      उसक6-MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 ७२१०१.७ ९६८४५
      उसक6-MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 ७२०४२.७ ९५३५५
      उसक6-MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP ७२३६७.१ ९४३२५
      उसक6-MBP-VSQNY * PIVQ-mApple ७२१४५.९ १०५२००

      10 तालिका: आण्विक वजन और विभिंन रिकॉमबिनेंट फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन सब्सट्रेट के विलुप्त गुणांक ।
    4. दोनों रेफरेंस से-और दरार बफर-हल सब्सट्रेट समाधान के लिए, कमजोर पड़ने के लिए रेफरेंस या दरार बफर का उपयोग, क्रमशः एक दोहरा धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी करें ।
    5. एक काले आधे क्षेत्र microplate के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने बिंदु के 30 µ एल हस्तांतरण ।
    6. चरण 4.4.2 में लागू की गई सेटिंग का उपयोग कर, fluorimeter के साथ प्रतिदीप्ति को मापने ।
      नोट: क्लीवेज और रेफरेंस बफर दोनों के बेसिक प्रतिदीप्ति को नाप कर रखें ।
  6. परख का मूल्यांकन
    1. अंशांकन curves प्लॉट ।
      1. एकाग्रता की गणना (मिमी में) शुद्ध सब्सट्रेट समाधान (चरण 4.5.4 में प्रयुक्त), प्रोटीन सामग्री के आधार पर चरण 4.5.3 में निर्धारित.
      2. लागू कमजोर पड़ने बफर के बुनियादी RFU मूल्यों (दरार बफर या रेफरेंस बफर) द्वारा धारावाहिक कमजोर पड़ने अंक के सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता मानों (RFU) को सही.
      3. साजिश दरार के दाढ़ एकाग्रता के खिलाफ सही RFU मूल्यों-या रेफरेंस-बफर-हल शुद्ध सब्सट्रेट और एक रैखिक हीनता प्रदर्शन (शूंय करने के लिए अवरोधन बल) ।
        नोट: एक उच्च R2 मान (˃ ०.९७) प्रतिदीप्ति और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एकाग्रता के बीच एक अच्छा रैखिक सहसंबंध इंगित करता है । इस स्थिति में, प्रतीपगमन रेखा की ढलान चरणों 4.6.2 और 4.6.3 में जांची गई श्रेणी में परख घटकों की एकाग्रता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । प्रयोगात्मक त्रुटियों और डेटा बिंदु वितरण अंशांकन की विश्वसनीयता को प्रभावित कर सकता है; इस प्रकार, एक ग्राफिक मूल्यांकन की मदद से किया जा सकता है जूम में रेखांकन (के रूप में 3 चित्रामें दिखाया गया है), जांच के लिए कि आर2 और ढलान मूल्यों डेटा से प्रभावित हैं ।
    2. प्रतिक्रिया के नमूनों में सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट दरार उत्पाद की राशि की गणना ।
      1. प्रत्येक R नमूने के RFU मान संगत B नमूने के RFU मानों के साथ सही है ।
      2. क्लीवेज उत्पाद एकाग्रता (मिमी में) की प्रतिक्रिया के नमूनों में सही RFU मूल्यों की ढलान से विभाजित करके की गणना क्लीवेज-बफर-आधारित अंशांकन वक्र (चरण 4.6.1.3 देखें).
    3. प्रतिक्रिया के नमूनों में एप्लाइड सब्सट्रेट एकाग्रता की गणना.
      1. मूल रेफरेंस बफ़र के RFU मान के साथ C नमूने के RFU मानों को सुधारें ।
      2. eluted सब्सट्रेट की एकाग्रता की गणना (मिमी में) रेफरेंस-बफर-आधारित अंशांकन वक्र की ढलान द्वारा उनके सही RFU मूल्यों को विभाजित करके सी नमूना के supernatants में (चरण 4.6.1.3 देखें).
      3. निर्धारित सब्सट्रेट एकाग्रता (मिमी में) SAMB शेयर कदम 4.1.4.2 में परख नमूने बनाने के लिए इस्तेमाल किया समाधान की, निम्न समीकरण के आधार पर:
        Equation 1
        यहां, cSAMB खंड 4.1.3 पर तैयार SAMB स्टॉक समाधान की दाढ़ एकाग्रता है; c c चरण 4.6.3.3 पर परिकलित c नमूना में eluted सब्सट्रेट की दाढ़ एकाग्रता है; वीआर प्रतिक्रिया चरण 4.1.4.5 में बफर और कदम 4.2.3 में एंजाइम बफर के अलावा द्वारा बनाई गई मिश्रण की मात्रा है.; और वीSAMB सी नमूना (step 4.1.4.2) में SAMB स्टॉक सॉल्यूशन की मात्रा है ।
      4. SAMB स्टॉक समाधान (मिमी में) के दाढ़ एकाग्रता के आधार पर प्रत्येक R नमूना में सब्सट्रेट के दाढ़ एकाग्रता की गणना (µ एल में) कदम 4.1.4.2 पर प्रत्येक प्रतिक्रिया नमूना ट्यूब में मापा.
    4. डेटा संसाधन निष्पादित करें ।
      नोट: डेटा विश्लेषण प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है । वीडियो एक सब्सट्रेट पर निर्भर काइनेटिक अध्ययन के डेटा प्रोसेसिंग के लिए एक उदाहरण से पता चलता है एचआईवी-1 पीआर अपने6-MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 सब्सट्रेट का उपयोग कर । प्रारंभिक वेग मूल्यों सी टर्मिनल दरार टुकड़े की संख्या से गणना कर रहे हैं और लागू सब्सट्रेट एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची है. काइनेटिक पैरामीटर एक Michaelis-मेनटेन रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा निर्धारित होते हैं ।
  7. चुंबकीय मोतियों की रीसाइक्लिंग
    नोट: एक परख प्रदर्शन करने के बाद, चुंबकीय agarose मोती एकत्र और पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है ।
    1. MPC के साथ इस्तेमाल किया चुंबकीय मोती ले लीजिए और supernatant त्यागें ।
      1. १.८ मिलीलीटर के साथ मोतियों को धोकर निम्नलिखित थें, दिए गए आदेश में: पुनर्जनन बफर एक (०.०५% के बीच 20, ०.५ एम NaOH), पुनर्जनन बफर बी (०.०५% के बीच 20), पुनर्जनन बफर सी (०.०५% के बीच 20, १०० मिमी EDTA, पीएच 8), पुनर्जनन बफर बी, पुनर्जनन बफर डी ( ०.०५% के बीच 20, १०० mM निसो4, पीएच 8), पुनर्जनन बफर बी, और पुनर्जनन बफर ई (०.५% के बीच 20, 30% इथेनॉल, पीएच 7) ।
        नोट: वाशिंग प्रक्रिया के लिए, चरण 4.1.1.4 देखें ।
    2. regeneration बफर में पुनर्नवीनीकरण मोती 4 डिग्री सेल्सियस पर ई स्टोर ।

5. पृष्ठ विश्लेषण

  1. नमूना तैयारी
    नोट: नी-ंत् चुंबकीय-मनका-आधारित परख प्रदर्शन करने के बाद, परख supernatants पृष्ठ द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । इस स्थिति में, चरण 5.1.1 और 5.1.2 छोड़ें । हालांकि, यह भी शुद्ध फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट समाधान का विश्लेषण करने के लिए संभव है और/या उनके दरार के टुकड़े के बाद समाधान पाचन में ब्याज की छेड़ने के साथ । इस स्थिति में, चरण 5.1.1 के साथ प्रोटोकॉल जारी रखें ।
    1. 4.5.1 चरण के अनुसार शुद्ध फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट समाधान तैयार करें ।
    2. में समाधान पाचन करते हैं ।
      1. ०.५ एमएल 10k ultrafiltration डिवाइस में क्लीवेज बफर के साथ एक्सचेंज रेफरेंस बफर और aliquot के नमूनों को १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूबों में पचा लिया जाता है ।
        नोट: पृष्ठ विश्लेषण के लिए, हम प्रत्येक सब्सट्रेट के ६८ µ l aliquoted, लेकिन नमूना ट्यूबों की संख्या और aliquoted होने के लिए सब्सट्रेट समाधान की मात्रा व्यक्तिगत प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है.
      2. नमूने के लिए एंजाइम समाधान जोड़ें ।
        नोट: पृष्ठ विश्लेषण के लिए, हम एचआईवी के 2 µ एल-1 पीआर लागू, Bozóki एट अल.14द्वारा वर्णित के रूप में तैयार है, लेकिन मात्रा व्यक्तिगत प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है । यह दरार का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है बफर भंग और/
      3. प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार नमूनों की मशीन ।
        नोट: पृष्ठ विश्लेषण के लिए, हम ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण मशीन, लेकिन मशीन समय और तापमान प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार सेट करने की आवश्यकता है ।
      4. चरण 5.1.3 प्रदर्शन द्वारा प्रतिक्रिया समाप्त ।
    3. पृष्ठ के लिए नमूना तैयार करें ।
      नोट: फ्लोरोसेंट-सब्सट्रेट-युक्त नमूने पृष्ठ के लिए एक nondenaturing या एक denaturing विधि द्वारा तैयार किया जा सकता है । nondenaturing या denaturing शर्तों के उपयोग के लिए, चरण 5.1.3.1 या 5.1.3.2, क्रमशः का पालन करें ।
      1. एक nondenatured नमूना तैयार: 6x nondenaturing नमूना लोड बफर के 6 µ एल के साथ नमूना के 30 µ एल मिश्रण (३०० mM Tris, 20% ग्लिसरॉल, ०.०५% bromophenol ब्लू, पीएच ६.८).
      2. विकृत नमूना तैयार करें: मिश्रण 30 µ l के साथ नमूने के 6 µ l के 6x denaturing नमूना लोडिंग बफ़र (३०० mM Tris, 20% ग्लिसरॉल, ०.०५% bromophenol नीला, 12% एसडीएस, १०० mM β-mercaptoethanol, पीएच ६.८), और 10 मिनट के लिए ९५ ° c पर नमूने गर्मी.
  2. एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण
    नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि केवल nondenatured (चरण 5.1.3.1 में तैयार) नमूनों का विश्लेषण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, एक देशी पृष्ठ भी किया जा सकता है. इस स्थिति में, अनुभाग ५.३ छोड़ें ।
    1. एक एसडीएस-polyacrylamide जेल तैयार (उपयोग 14% अलग और 4% स्टैकिंग जेल) और ट्रो बफर के साथ टैंक को भरने (२.५ mm Tris, १९.२ mm glycine, ०.०१% एसडीएस) ।
    2. नमूने जोड़ें (चरण 5.1.3.1 या 5.1.3.2 में तैयार) एक polyacrylamide जेल के कुओं के लिए और १२० वी वोल्टेज पर ट्रो प्रदर्शन करते हैं ।
    3. रनिंग मॉड्यूल से जेल कैसेट निकालें और एक वाशिंग टैंक में जेल जगह है ।
      नोट: Nondenatured नमूने पहले से ही जेल में दिखाई दे रहे हैं, यहां तक कि नग्न आंखों से या एक DRBT के साथ ।
  3. में जेल renaturation और फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने
    नोट: विकृत नमूनों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने के लिए (चरण 5.1.3.2 में तैयार) DRBT पर, एसडीएस को जेल से धोया जा करने की जरूरत है, आंशिक रूप से प्रोटीन को पुनर्स्वरूपित करने के लिए ।
    1. जेल के लिए आसुत पानी की ~ १०० मिलीलीटर जोड़ें और कुल्ला 30 मिनट के लिए कम से जेल ।
      नोट: एसडीएस हटाने में सुधार करने के लिए, हर 10 मिनट पानी बदलें, या ६० मिनट तक कुल्ला ।
    2. एक DRBT, या यूवी इमेजिंग द्वारा का उपयोग करके फ्लोरोसेंट प्रोटीन कल्पना ।
  4. जेल के पारंपरिक Coomassie धुंधला
    1. Coomassie शानदार नीले रंग के साथ जेल दाग फ्लोरोसेंट प्रोटीन कल्पना ।

Representative Results

1a चित्र एक प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट रिकॉमबिनेंट प्रोटीन सब्सट्रेट जो एचआईवी द्वारा संसाधित किया जा सकता है अपनी विशिष्ट दरार साइट अनुक्रम में 1 पीआर की योजनाबद्ध संरचना से पता चलता है । आंकड़ा 1b सब्सट्रेट उत्पादन और उनके Ni-ंत् चुंबकीय-मनका आधारित परख और/या पृष्ठ सहित चिढ़ा परख, में संभव अनुप्रयोगों का प्रतिनिधित्व करता है ।

fluorimetry द्वारा विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए, एक अंशांकन प्रक्रिया की आवश्यकता है, ताकि फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट और दरार उत्पादों की मात्रा निर्धारित करने के लिए । इस के लिए, विभिंन बफर शर्तों में विभिंन सब्सट्रेट के प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों को मापा जा करने की आवश्यकता है और परख एकाग्रता रेंज (चित्रा 3) में उनकी सांद्रता के लिए संबंधित होना चाहिए । अंशांकन curves के ढलान मूल्यों को परख नमूनों में सब्सट्रेट और दरार उत्पादों की मात्रा निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है । अंशांकन curves की ढलानों दरारें साइट के स्वतंत्र है सब्सट्रेट (तालिका 11) में डाला अनुक्रम और संभावित फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक ही प्रकार से जुड़े सब्सट्रेट की एक श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जूम-इन रेखांकन सभी रैखिक हीनताओं के लिए दिखाए जाते हैं, कम एकाग्रता पर्वतमाला के रूप में अच्छी तरह से विस्तार करने के लिए (चित्रा 3). यह ध्यान रखें कि अंशांकन की जरूरत है ध्यान से किया जा करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि डेटा बिंदुओं का एक उचित वितरण एक विश्वसनीय अंशांकन के लिए आवश्यक है । इस कारण से, दोहरा सीरियल कमजोर पड़ने के लिए अंशांकन नमूनों को तैयार करने के लिए लागू किया जाता है, क्योंकि आर2 मान फ्लोरोसेंट प्रोटीन और प्रतिदीप्ति की एकाग्रता के बीच एक अच्छा संबंध को इंगित करता है केवल अगर डेटा बिंदुओं की एक पर्याप्त संख्या पूरी एकाग्रता रेंज को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, प्रयोगात्मक त्रुटियों अत्यधिक अंशांकन की सटीकता को प्रभावित कर सकते हैं; इस प्रकार, प्रतिगमन लाइनों की एक ग्राफिक मूल्यांकन भी आवश्यक हो सकता है ।

एंजाइमी माप की एक किस्म प्रतिक्रिया वेग पर सब्सट्रेट एकाग्रता के प्रभाव की एक परीक्षा सहित, छेड़ने परख द्वारा किया जा सकता है (चित्रा 4a). रैखिक प्रतिगमन द्वारा, डेटा एंजाइम काइनेटिक मापदंडों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (जैसे, वीमैक्स और कश्मीरएम). अपर्याप्त मनका निलंबन और फैलाव और एक अनुचित प्रतिक्रिया समाप्ति के कारण हो सकता है उपइष्टतम परिणाम (चित्रा 4B), जो विश्वसनीय एंजाइम काइनेटिक मूल्यों की गणना के लिए उपयुक्त नहीं हैं ।

समय पर उत्पाद के गठन की निर्भरता परख (चित्रा 5) (जैसे, दरार प्रतिक्रिया मापदंडों के अनुकूलन के दौरान) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । एक अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में एंजाइम गतिविधि भी (चित्रा 5B) सक्रिय एंजाइम एकाग्रता और निरोधात्मक स्थिरांक के निर्धारण के लिए जांच की जा सकती है । इसी पद्धति का प्रयोग, अन्य अवरोधकों के प्रभाव को भी परख द्वारा दिखलाई जा सकता है.

चिढ़ा परख उपयोगी है जब एंजाइम गतिविधि पर पीएच के प्रभाव की जांच, के रूप में अच्छी तरह से । चित्रा 6A टेव पीआर है, जो एक व्यापक इष्टतम पीएच रेंज (पीएच 6-9) है के उदाहरण से पीएच पर एंजाइम गतिविधि की निर्भरता का प्रतिनिधित्व करता है । यदि एंजाइम गतिविधि के पीएच निर्भरता का अध्ययन किया है (या एंजाइमों एक अंलीय पीएच इष्टतम होने की जरूरत है मापा जा), यह विचार करना आवश्यक है कि रिकॉमबिनेंट सब्सट्रेट्स के संबंध बाध्यकारी मोतियों को थोड़ा अंलीय पीएच पर प्रतिबंधित किया जा सकता है । मोती (फिगर घमण्ड) से सब्सट्रेट्स का एक ऊंचा पृथक्करण परख परिणामों की विकृति का कारण बन सकता है । आदेश में मोतियों से सहज सब्सट्रेट पृथक्करण पर विचार करने के लिए, मूल्यों प्रतिक्रिया नमूनों के लिए मापा बी नमूनों की उन लोगों द्वारा सही किया जा करने की आवश्यकता.

चित्रा 7 से पता चलता है कि nondenatured फ्लोरोसेंट प्रोटीन जेल में अपने रंग के आधार पर विभेदित किया जा सकता है, ब्लू लाइट transillumination (चित्रा 7A) का उपयोग कर । अगर सब्सट्रेट/दरार टुकड़े के आणविक भार का निर्धारण आवश्यक है, denaturing शर्तों भी नमूना तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन आंशिक रूप से जेल में renatureed किया जा सकता है, और यूवी रोशनी से पता लगाया जा सकता है (चित्रा 7B) या Coomassie दाग (चित्रा 7C) द्वारा । R नमूने विश्लेषण कर रहे हैं, तो केवल C-टर्मिनल क्लीवेज उत्पादों दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 7C), जबकि एन टर्मिनल दरार टुकड़े और uncleav सब्सट्रेट मोतियों से जुड़े रहते हैं. कभी कभार, प्रोटीन आंशिक रूप से nondenaturing शर्तों (चित्रा 7C) का उपयोग करने के बावजूद विकृत हो सकता है, और जबकि nondenatured प्रोटीन अधिक प्रचुर मात्रा में हैं, विकृत रूपों भी नमूने में detectable हैं । इस घटना proteolytic दरार का पता लगाने को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन nondenatured नमूनों की मात्रात्मक densitometry के मामले में विचार किया जाना चाहिए.

हालांकि विस्तृत विवरण केवल एक 2 मिलीलीटर-ट्यूब आधारित परख के लिए दिखाया गया है, परख एक ९६ के लिए अनुकूलित किया जा सकता है अच्छी तरह से प्लेट आधारित प्रणाली (8 अंक), जो पहले से ही हमारी प्रयोगशाला में सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है (नहीं दिखाया गया है) । ९६-खैर प्लेट अनुकूलित प्रारूप fluorimetric और electrophoretic विश्लेषण के साथ पूरी तरह से संगत है, के रूप में अच्छी तरह से, और प्राप्त डेटा भी इस पत्र में वर्णित तरीकों के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है ।

Figure 3
चित्रा 3 : अंशांकन घटता है । प्रतिनिधि सब्सट्रेट अंशांकन curves दो रिकॉमबिनेंट के उदाहरण के साथ प्रदर्शन कर रहे है विभिंन सी से जुड़े सब्सट्रेट-टर्मिनल फ्लोरोसेंट टैग: (A और B) अपने6-MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 और (सी और डी ) आमा-MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP । ज़ूम-इन के आंकड़े भी 0-0.005 mM सब्सट्रेट एकाग्रता रेंज में डेटा पॉइंट्स के रेखीय प्रतिगमन का प्रतिनिधित्व करने के लिए दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 4
चित्र 4 : एंजाइम काइनेटिक मापदंडों का निर्धारण । सब्सट्रेट-निर्भर काइनेटिक माप एचआईवी द्वारा प्रदर्शन किया गया-1 पीआर (४१.२ एनएम के अंतिम सक्रिय एकाग्रता में) । प्रारंभिक वेग मूल्यों सब्सट्रेट एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची और एक Michaelis-मेनटेन रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण किया गया था । त्रुटि पट्टियां SD (n = 2) का प्रतिनिधित्व करती हैं । () एक प्रतिनिधि इष्टतम परिणाम अपने6-MBP-VSQNY * PIVQ-mApple संलयन प्रोटीन सब्सट्रेट के उदाहरण के साथ दिखाया गया है । () एक प्रतिनिधि उप इष्टतम परिणाम भी अपने6-MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 सब्सट्रेट, जहां उचित सब्सट्रेट सांद्रता की स्थापना homogenization स्टॉक समाधान के एक अपर्याप्त SAMB के कारण समस्याग्रस्त था के लिए दिखाया गया है , जबकि अपेक्षाकृत उच्च त्रुटियों अनुचित प्रतिक्रिया समाप्ति के कारण थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : समय-पाठ्यक्रम और निरोधात्मक अध्ययन । () उसकी 6-MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन सब्सट्रेट (०.००३२६ मिमी की एक अंतिम एकाग्रता) एचआईवी से सट गया था-1 पीआर (४१.२ एनएम के अंतिम सक्रिय एकाग्रता में), और फ्लोरोसेंट PIVQ-mEYFP proteolytic टुकड़े की रिहाई के लिए मापा गया था समय-पाठ्यक्रम का विश्लेषण करें । माप पांच अलग समय बिंदुओं पर किए गए । त्रुटि पट्टियां SD (n = 2) का प्रतिनिधित्व करती हैं । () अपने6-MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP (०.००१५ मिमी पर) सब्सट्रेट के रूप में एचआईवी-1 पीआर की गतिविधि पर निरोधात्मक के amprenavir प्रभाव निर्धारित करने के लिए (१६३.८ एनएम की कुल एकाग्रता) के रूप में इस्तेमाल किया गया था । डेटा की साजिश रचने से, आधा अधिक से अधिक निरोधात्मक एकाग्रता (IC50) का मूल्यांकन किया जा सकता है और सक्रिय एंजाइम एकाग्रता (४१.२ एनएम के एक अंतिम सक्रिय एकाग्रता) के लागू एचआईवी-1 पीआर भी अवरोध वक्र के आधार पर गणना की जा सकती है । त्रुटि पट्टियां SD (n = 3) का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : पीएच पर एंजाइम गतिविधि और सहज सब्सट्रेट पृथक्करण की निर्भरता का अध्ययन. () अपने6-MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 सब्सट्रेट (०.०३३ mM में) टेव पीआर के एंजाइम गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था (९१.४२ एनएम के अंतिम कुल एकाग्रता में) दरार बफर में एक अलग पीएच करने के लिए सेट, 6.5-8.5 की सीमा के बीच । त्रुटि पट्टियां SD (n = 2) का प्रतिनिधित्व करती हैं । प्लॉट किए गए डेटा को पहले14प्रकाशित किया जा चुका है । () सब्सट्रेट खाली नमूनों की सापेक्ष फ्लोरोसेंट तीव्रता मूल्यों पर आधारित, सहज पृथक्करण के अपने6-MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 सब्सट्रेट (०.०३३ mM) चुंबकीय मोतियों से दरार बफर का उपयोग करके अध्ययन किया गया था एक अलग पीएच के साथ, 6.0 के बीच 8.5 । प्लॉट किए गए डेटा को पहले14प्रकाशित किया जा चुका है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : विभिंन तरीकों से जेल में प्रोटीन का पता लगाने । () एसडीएस-पृष्ठ के बाद नीले प्रकाश transillumination द्वारा nondenaturing नमूना तैयार करने के बाद एक सट और एचआईवी-1 पीआर पचाने वाला फ्यूजन प्रोटीन सब्सट्रेट । दरार प्रतिक्रिया में समाधान पाचन द्वारा किया गया था । () पृष्ठ के तुरंत बाद, केवल nondenatured प्रोटीन यूवी रोशनी द्वारा जेल में पता लगाया जा सकता है, जबकि एसडीएस के हटाने के बाद, पहले विकृत फ्लोरोसेंट प्रोटीन आंशिक रूप से स्वभाविक और detectable बन गया । यह नमूने नी-ंत् चुंबकीय-मनका supernatants की परख से तैयार किए गए थे । () Coomassie दाग भी प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जेल renaturation के बाद । जेल में मौजूद एसडीएस-देशी प्रोटीन के आंशिक विकार का कारण हो सकता है, लेकिन देशी नमूनों में, nondenatured रूपों में अधिक प्रचुर मात्रा में होता है । यह नमूने नी-ंत् चुंबकीय-मनका supernatants की परख से तैयार किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 8
चित्र 8 : ९६-परख मंच के अच्छी तरह से थाली आधारित अनुकूलन । () परख न केवल 2 मिलीलीटर ट्यूबों में किया जा सकता है लेकिन एक ९६ के कुओं में अच्छी तरह से थाली, के रूप में अच्छी तरह से । यहां हम परख के आवेदन के लिए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाने के लिए फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट, जो जंगली-प्रकार (wt) या रूपांतरित (mut-1 से mut-4) दरार साइट दृश्यों को शामिल कर सकते है की एक श्रृंखला का उपयोग करके एक काल्पनिक की विशिष्टता का अध्ययन । चुंबकीय मोतियों से निपटने के लिए, एक ९६-अच्छी तरह से संगत चुंबकीय कण केंद्रित (MPC) प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए है । सभी संकेत मात्रा एक भी अच्छी तरह से संबंधित हैं । विभिन्न सब्सट्रेट के क्लीवेज दक्षता की तुलना करने के लिए, सब्सट्रेट रूपांतरण सब्सट्रेट-रिक्त-सही RFU मूल्यों की प्रतिक्रिया के नमूनों के प्रतिशत से मूल्यांकन किया जा सकता, सब्सट्रेट-रिक्त-सही RFU मूल्यों पर विचार संबंधित सब्सट्रेट १०० के रूप में नियंत्रण के नमूने । () fluorimetry के बाद, परख नमूनों की अलग supernatants भी पृष्ठ द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन घटकों का विश्लेषण किया जा सकता है सीधे या बाद में जेल renaturation के मामले में nondenaturing और denaturing नमूना क्रमशः तैयारी । तीन अलग परख नमूना प्रकार भी प्रत्येक संख्या में सचित्र हैं: सी = सब्सट्रेट नियंत्रण, बी = सब्सट्रेट रिक्त, और आर = प्रतिक्रिया. सब्सट्रेट नियंत्रण नमूने रेफरेंस बफर में हैं, जबकि सब्सट्रेट खाली और प्रतिक्रिया के नमूने दरार बफर में हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

बफ़र फ्लोरोसेंट प्रोटीन CV% ढलानों (%)
रेफरेंस mTurquoise2 ६.०४
दरार ९.११
रेफरेंस mApple १०.९२
दरार १२.६८

तालिका 11: प्रसरण का गुणांक (CV%) सब्सट्रेट अंशांकन curves की ढलानों का मान । रिकॉमबिनेंट प्रोटीन सब्सट्रेट के प्रतिदीप्ति डाला दरार साइट पर निर्भर है कि क्या परीक्षण करने के लिए, अंशांकन mApple की श्रृंखला द्वारा प्रदर्शन किया गया-और mTurquoise2-जुड़े हुए सब्सट्रेट (प्रत्येक के लिए छह वेरिएंट, विभिन्न दरार साइट युक्त एचआईवी का जुगाड़-1 छेड़ने की), दोनों रेफरेंस और क्लीवेज में ही थें । हमने पाया है कि ढलानों के CV% मूल्यों सभी मामलों में 15% के तहत कर रहे हैं, जो तात्पर्य है कि एक सब्सट्रेट अंशांकन अलग माप के मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जा सकता है सब्सट्रेट एक ही फ्लोरोसेंट टैग युक्त वेरिएंट द्वारा प्रदर्शन किया ।

Discussion

कारण proteolytic एंजाइमों के गहन औद्योगिक और अकादमिक जांच और शीघ्र और सस्ती HTS के लिए लगातार मांग-संगत परख प्लेटफार्मों तदनुसार, हम एक चुंबकीय-मनका आधारित फ्लोरोसेंट छेड़ने का विकास किया है परख. परख रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन जो व्यापक रूप से उपयोग सिंथेटिक पेप्टाइड सब्सट्रेट करने के लिए उपंयास विकल्प हो सकता है के उपयोग पर आधारित है ।

विकसित परख प्रारूप में, फ्यूजन प्रोटीन सब्सट्रेट नी-chelate-लेपित चुंबकीय agarose मोतियों की सतहों को मैटीरियल कर रहे हैं । सब्सट्रेट लगाव एन-टर्मिनल अपने फ्यूजन प्रोटीन है, जो सीधे एक MBP टैग से जुड़े के क्रम में तह की सुविधा के लिए और सब्सट्रेट13के पानी घुलनशीलता बढ़ाने के लिए है की6 संबध टैग द्वारा प्रदान की जाती है । MBP टेव पीआर और ब्याज की एक को छेड़ने की दरार साइटों द्वारा पीछा किया जाता है । पूर्व परख में एक नियंत्रण दरार साइट के रूप में सेवा कर सकते हैं, जबकि उत्तरार्द्ध द्वारा संसाधित किया जा सकता है की जांच की जानी चाहिए । दरार साइट विनिमेय है; एक लघु dsDNA अनुक्रम ब्याज की दरार साइट के लिए कोडिंग ' लचीले बंधाव द्वारा प्लाज्मिड अभिव्यक्ति की ' क्लोनिंग कैसेट में डाला जा सकता है । रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन एक अत्यधिक स्थिर, सी में monomeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग-टर्मिनल, जो एंजाइम के समापन बिंदु का पता लगाने में सक्षम बनाता है मुक्त, फ्लोरोसेंट सी-टर्मिनल दरार उत्पादों proteolytic दरार पर जारी ( चित्र 1a) । शुद्ध फ्लोरोसेंट बरकरार सब्सट्रेट अलग बफ़र्स में हल भी सब्सट्रेट और दरार उत्पादों की दाढ़ सांद्रता का आकलन करने के लिए अंशांकन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । इसके अलावा, fluorimetry के बाद, परख घटकों एसडीएस द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है पृष्ठ, के रूप में अच्छी तरह से । दोनों देशी (nondenatured) और विकृत फ्लोरोसेंट प्रोटीन जेल में visualized किया जा सकता है, तुरंत ट्रो के बाद या बाद में जेल renaturation, क्रमशः के बाद । इस अतिरिक्त प्रक्रिया-संयोजन में एक पारंपरिक Coomassie शानदार नीले दाग के साथ-परख परिणाम (आंकड़ा 1b) के सत्यापन के लिए कुशलता से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

परख प्रक्रिया सरल, आसान करने के लिए एक कम मात्रा प्रारूप है कि पूरी तरह से एक उच्च प्रवाह स्वचालित वातावरण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है में कदम निष्पादित होते हैं । हालांकि, स्वतंत्र रूप से या तो स्वयं या एक स्वचालन प्रणाली के साथ परख प्रदर्शन से, परख के निंनलिखित भागों में महत्वपूर्ण माना जाता है और विशेष ध्यान देने की जरूरत है, जबकि प्रक्रिया प्रदर्शन । i) चुंबकीय मनका समाधान की एकरूपता । एक सजातीय चुंबकीय मनका समाधान परख भर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, दोनों शुद्धि और धुलाई चरणों में । विशेष रूप से, जोरदार परख की विश्वसनीयता दृढ़ता से aliquoting सब्सट्रेट-संलग्न चुंबकीय मनका (SAMB) स्टॉक समाधान पर निर्भर करता है । आदेश में निलंबन और फैलाव की प्रभावशीलता को बढ़ाने के लिए, यह 2% और 10% के बीच मनका एकाग्रता सेट करने के लिए सिफारिश की है (v/ नमूना तैयारी के दौरान, (जैसे ट्राइटन एक्स-१०० या 20 के बीच) 2% तक भी प्लास्टिक सतहों के लिए चुंबकीय मोतियों के पालन में कमी हो सकती है के रूप में गैर ईओण डिटर्जेंट के साथ पूरक बफ़र्स का उपयोग करें । मोतियों का नमूना शीशियों की दीवारों के पालन से बचा जा सकता है अगर मनका निलंबन ध्यान से शीशियों के बजाय नमूना ट्यूबों की दीवारों पर की तह तक लागू कर रहे हैं । एंजाइमी प्रतिक्रिया के दौरान चुंबकीय मोतियों की एकरूपता भी महत्वपूर्ण है और लगातार मशीन के दौरान ६०० rpm पर नमूने मिलाते द्वारा सुनिश्चित किया जा सकता है । मनका ठीक से गोल या फ्लैट तली हुई प्लास्टिक के माल में फैला रहे हैं, जबकि वी नीचे शीशियों के उपयोग की सिफारिश नहीं है । अनुचित मनका homogenization की वजह से एक इष्टतम परिणाम चित्रा 4Bमें प्रतिनिधित्व किया है । ii) प्रतिक्रिया नमूनों की समाप्ति.  विधि का एक अंय लाभ यह है कि एंजाइमी प्रतिक्रिया गर्मी विकार उपचार या किसी भी संभावित हस्तक्षेप रासायनिक एजेंटों15के उपयोग के बिना समाप्त किया जा सकता है । समाप्ति बस प्रतिक्रिया मिश्रण से चुंबकीय मोती अलग करके किया जा सकता है, एक पारंपरिक चुंबकीय कण केंद्रित का उपयोग कर । हालांकि हटा प्रतिक्रिया बफर सक्रिय एंजाइम और उत्पन्न सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट दरार उत्पादों, uncleav सब्सट्रेट मोतियों से जुड़ी रहती हैं । प्रतिक्रिया बफ़र में सक्रिय एंजाइम की उपस्थिति के कारण, पृथक्करण प्रक्रिया विश्वसनीय समापन बिंदु का पता लगाने के लिए सावधानीपूर्वक किया जा करने के लिए की आवश्यकता है । ध्यानी में नमूना शीशियों रखने से पहले, यह एक छोटी स्पिन केंद्रापसारक लागू करने के लिए सिफारिश की है. के बाद ध्यानी में ट्यूबों रखने के लिए, मोती एकत्र करने के लिए कम से 15 एस प्रदान करते हैं । विभाजक के थोड़ा आंदोलन वापस और आगे मोतियों के संग्रह की सुविधा हो सकती है । कृपया विचार है कि, एक मैंयुअल रूप से प्रदर्शन जुदाई के दौरान, समाप्ति आमतौर पर प्रतिक्रियाओं की दीक्षा से अधिक समय लगता है । इसलिए, एक लगभग 2 मिनट पंजीकृत देरी दीक्षा के बीच की सिफारिश की है अगर एक ही मशीन समय सभी नमूनों को लागू करने की जरूरत है ।

वर्णित proteolytic परख का सिद्धांत अपेक्षाकृत सरल है; हालांकि, प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा लचीला और स्थिर सब्सट्रेट संरचना द्वारा की गारंटी है । परख के व्यक्तिगत अनुकूलन केवल लागू की गई शर्तों, रिएजेंट, और additives के साथ संबंध मोतियों की अनुकूलता के द्वारा सीमित किया जा सकता है । निर्माता के प्रोटोकॉल के साथ समझौते में, हम यह भी पाया कि Ni-ंत् मनका सतहों के संबध बाध्यकारी काफी पीएच ≤ ६.५15में कमजोर । इसलिए, यह प्रतिक्रिया के नमूनों के समानांतर सब्सट्रेट रिक्त नमूनों को लागू करने के लिए सिफारिश की है, और सहज सब्सट्रेट पृथक्करण की दर परिणामों के मूल्यांकन के दौरान विचार किया जा करने की जरूरत है.

उन मामलों में, जहां चुंबकीय-मनका आधारित परख मनका के उपयोग के कारण नहीं किया जा सकता-असंगत घटकों या एक कम पीएच, में-शुद्ध रिकॉमबिनेंट सब्सट्रेट के समाधान पाचन भी लागू किया जा सकता है । इन मामलों में, प्रतिक्रिया मिश्रण ट्रो द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, और प्रोटीन वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर जेल में visualized किया जा सकता है । proteolytic गतिविधि की जांच करने के लिए, में समाधान पाचन और जेल में प्रोटीन का पता लगाने भी fluorimetry के वैकल्पिक उपकरण हो सकता है । डिजाइन सब्सट्रेट प्रणाली की एक नवीनता denaturing एसडीएस-पृष्ठ के बाद जेल renaturation कदम के आवेदन पत्र है । जबकि देशी (nondenatured) फ्लोरोसेंट प्रोटीन ट्रो के दौरान अपने प्रतिदीप्ति को बनाए रखने, फ्लोरोसेंट संपत्ति विकार (चित्रा 7B) पर समाप्त कर दिया है । तथापि, विविकृत प्रोटीनों के प्रतिदीप्ति को जेल से एसडीएस के निष्कासन से आंशिक रूप से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रकार, प्रतिक्रिया घटकों का एक जुदाई denaturing शर्तों का उपयोग न केवल प्रतिदीप्ति आधारित है, लेकिन आणविक वजन आधारित पहचान संभव बनाता है । एक Coomassie-दाग जेल के विश्लेषण की तुलना में फ्लोरोसेंट में जेल का पता लगाने का एक और लाभ यह है कि (देशी या renature) फ्लोरोसेंट प्रोटीन आसानी से अपने प्रतिदीप्ति के आधार पर जेल में पहचाना जा सकता है ( चित्रा 7देखें) । यह महत्वपूर्ण हो सकता है अगर दरार प्रतिक्रियाओं में फ्लोरोसेंट दूषित पदार्थों या प्रोटीन अत्यधिक एक दूसरे के आणविक भार जैसी युक्त नमूनों में प्रदर्शन कर रहे हैं ।

इसी तरह डिजाइन किए गए सब्सट्रेट का उपयोग कर परख पहले से ही पहले8,9,10प्रकाशित किया गया है, और हालांकि उन मामलों में ब्याज की दरार साइट भी एक संबंध टैग और एक के बीच स्थित था फ्लोरोसेंट प्रोटीन, परख प्रणाली यहां प्रस्तुत न केवल वर्णित विचारों को दोहराता है, लेकिन पिछले प्लेटफार्मों के विभिंन लाभों को जोड़ती है और भी उंहें आगे सुधार के साथ पूरा: i) एक MBP फ्यूजन साथी, द्वितीय के उपयोग) एक टेव पीआर नियंत्रण दरार साइट की उपस्थिति, iii) के नए इंजीनियर monomeric एफपीएस का उपयोग करें, और iv) एक अद्वितीय सब्सट्रेट अंशांकन प्रक्रिया के आवेदन. परख ही विशेष रूप से एक सुरक्षित, समय में एंजाइम विशिष्टता और काइनेटिक अध्ययन के लिए उपयोगी हो डिजाइन किया गया था और लागत कुशल तरीके से, महंगी उपकरण की आवश्यकता के बिना । विधि के लिए एक उपयुक्त और सस्ती दोनों औद्योगिक और अकादमिक अनुसंधान प्रयोजनों के लिए उपकरण का उद्देश्य है । अभिव्यक्ति प्लाज्मिड की ' क्लोनिंग कैसेट ' के लचीलेपन के कारण यह प्रणाली रिकॉमबिनेंट सब्सट्रेट पुस्तकालयों की तेज और सस्ती पीढ़ी के लिए उपयुक्त हो सकती है. इस के साथ साथ वर्णित परख सब्सट्रेट विशिष्टता, एंजाइम mutagenesis, और निषेध अध्ययन के कार्यांवयन के लिए एक व्यवहार्य उपकरण है और, यह भी, एक वैकल्पिक उपकरण प्रदान करने के लिए एंजाइम कैनेटीक्स प्रदर्शन । परख मंच (बैक्टीरियल कोशिका विघटन से काइनेटिक मापदंडों के निर्धारण के लिए) एक HTS के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और स्वचालन आधारित पर्यावरण और, संभवतः, औद्योगिक छेड़ने अवरोधक स्क्रीनिंग और/या एंटीवायरल दवा में लागू किया जा सकता है विकास. इसके अतिरिक्त, प्रतिस्पर्धी प्रोटियोलिसिस के लिए परख का अनुकूलन भी हमारी प्रयोगशाला के भविष्य के दायरे में है । इस तरह के एक प्रतियोगी परख, दो अलग सब्सट्रेट-एक अलग दरार एक अलग सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट टैग करने के लिए जुड़े साइट से युक्त प्रत्येक-एक ही दरार प्रतिक्रिया में अध्ययन के वरीयता की जांच करने के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा करने का इरादा कर रहे है दिए गए लक्ष्य दृश्यों के लिए एंजाइम । इसके अलावा, एक ९६ के उपयोग के अच्छी तरह से थाली-परख फार्म (8 अंक) अनुकूलित भी उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग के लिए संशोधित cysteine के मामले में दरार साइट दृश्यों के साथ सब्सट्रेट की एक श्रृंखला का उपयोग करके अनुकूलित किया जा रहा है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को GINOP-2.3.2-15-2016-00044 "PHARMPROT teaming" परियोजना द्वारा भाग में समर्थित किया गया था और यह भी, हंगरी में मानव क्षमताओं के मंत्रालय के उच्च शिक्षा संस्थागत उत्कृष्टता कार्यक्रम द्वारा वित्तपोषित, के ढांचे के भीतर जैव प्रौद्योगिकी Debrecen विश्वविद्यालय के विषयगत कार्यक्रम । लेखक परख विकास के दौरान उनकी वैज्ञानिक मदद के लिए Retroviral जैव रसायन की प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए आभारी है और भी परख फिल्माने के दौरान उनके धैर्य के लिए (विशेष रूप से Norbert Kassay, क्रिस्टीना Joóné Matúz, और Vanda Toldi, जो वीडियो की पृष्ठभूमि में दिखाई दे रहे हैं) । लेखक भी Gedeon रिक्टर पीएलसी के लिए विशेष धन्यवाद कहना चाहूंगा., विशेष रूप से जैव रसायन विभाग में Beáta Bozóki's काम की अनुमति देने के लिए डॉ Zoltán Urbányi के लिए और एक अतिथि शोधकर्ता के रूप में आण्विक जीव विज्ञान । लेखक भी ऑडियो और वीडियो में व्यावसायिक सहायता के लिए Balázs विश्वविद्यालय के मल्टीमीडिया और ई-लर्निंग तकनीकी केंद्र से György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Pöstényi Zoltán, और Király Debrecen के लिए उनके आभार का विस्तार करना चाहेंगे उत्पादन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10K Amicon tubes Merck-Millipore UFC501096
2-Mercaptoethanol (β-ME) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  M6250
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1 Bio-Rad 1610148
Acetic acid  Merck 100063
Agarose SERVA 11404.04
Alpha Imager HP gel documentation system ProteinSimple
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  A3678
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  A9518
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge Beckman Coulter 392185
Black half-area plates Greiner bio-One 675086
Bromophenol blue Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  B0126
CutSmart buffer (10x) New England Biolabs B7204S For plasmid linearization (step 1.1.1)
Dark Reader transilluminator Clare Chemical Research DR-45M
DNase I  New England Biolabs M0303L
Dynamag-2 magnetic particle concentrator Thermo Fischer Scientific 12321D
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells  Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) C600003
Ethanol Merc-Millipore 100983
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  798681
Gel Loading Dye, Purple (6X) New England Biolabs B7024S
Glycerol Merck 356350
Glycine Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  G7126
High-Speed Plasmid Mini Kit GeneAid PD300
Imidazole Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  56750
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) AM9464
Jouan CR 412 centrifuge Jouan CR412
Labinco LD-76 Rotator  Labinco 7600
Luria-Bertani (LB) broth Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  L3022
Lysozyme  Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  L6876
Magnesium chloride Scharlau MA0036
MERCK eurolab ultrasonic bath MERCK USR54H
Millifuge Eppendorf spin centrifuge Millipore CT10
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell Bio-Rad
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  T9281
NanoDrop 2000 Thermo Fischer Scientific
NheI-HF restriction endonuclease New England Biolabs R3131L
Nickel(II) sulfate (NiSO4) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  656895
Ni-NTA magnetic agarose beads  Qiagen 36113
Orbital shaker Biosan OS-20
PacI restriction endonuclease New England Biolabs R0547L
PageBlue Protein Staining Solution  Thermo Fischer Scientific 24620
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  P7626
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes  Eppendorf 22431102
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
Snijders Press-to-Mix shaker  Gemini 34524
Sodium-acetate trihydrate Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S7670
Sodium-chloride Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S9888
Sodium-hydroxide  Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S5881
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain Thermo Fischer Scientific S7563
T4 DNA ligase Promega M180A
Thermo shaker Biosan TS-100 with SC-24 accessory block
Tris Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  T1503
Tween 20 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  P2287
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter Wallac Oy, Turku, Finland

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References

  1. Meldal, M. Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition. Molecular Informatics. 24, (10), 1141-1148 (2005).
  2. Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62, (3), 597-635 (1998).
  3. Zhang, G. Protease assays. The Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda, MD. (2012).
  4. Woelcke, J., Hassiepen, U. Fluorescence-based biochemical assay formats. A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. Chen, T. CRC Press. Boca Raton, FL. (2010).
  5. Richardson, P. L. The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development. Current Pharmaceutical Design. 8, (28), 2559-2581 (2002).
  6. Diamond, S. L. Methods for mapping protease specificity. Current Opinion in Chemical Biology. 11, (1), 46-51 (2007).
  7. Schilling, O., Overall, C. M. Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites. Nature Biotechnology. 26, (6), 685-694 (2008).
  8. Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates. Analytical Biochemistry. 415, (2), 126-133 (2011).
  9. Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).
  10. Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate. Biotechniques. 31, (5), 1194-1198 (2001).
  11. Branchini, B. R., et al. Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 414, (2), 239-245 (2011).
  12. Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases. Microbial Cell Factories. 13, (1), 44 (2014).
  13. Fox, J. D., Waugh, D. S. Maltose-binding protein as a solubility enhancer. Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).
  14. Bozóki, B., et al. A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening. Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).
  15. Mótyán, J. A., Miczi, M., Bozóki, B., Tözsér, J. Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates. Data in Brief. 18, 203-208 (2018).
  16. Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15, 47-51 (2018).
  17. Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains. PLoS One. 8, e75991 (2013).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).
एक फ्लोरोसेंट चिढ़ा परख मंच में रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग करें और उनके जेल Renaturation
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Bozóki, B., Mótyán, J. A., Miczi, M., Gazda, L. D., Tőzsér, J. Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation. J. Vis. Exp. (143), e58824, doi:10.3791/58824 (2019).More

Bozóki, B., Mótyán, J. A., Miczi, M., Gazda, L. D., Tőzsér, J. Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation. J. Vis. Exp. (143), e58824, doi:10.3791/58824 (2019).

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