Summary
在这里，我们提出了一个协议，开发和定性斑马鱼模型的癫痫，由于 DEPDC5 基因的暂时抑制。
Abstract
癫痫是最常见的神经系统疾病之一，影响全世界估计有5000万人。基因研究的最新进展揭示了与各种形式的癫痫有关的大量基因，突出了这种疾病的异质性。适当的动物模型对于研究与癫痫有关的基因突变引发的病理机制以及开发专门的、有针对性的疗法至关重要。近年来，斑马鱼已成为一种有价值的脊椎动物，用于模拟癫痫，同时利用基因操作和接触已知的癫痫药物，如五角星（PTZ），来识别新的抗癫痫疗法。mTOR 调节器 DEPDC5 中的有害突变与各种形式的聚焦癫痫有关，斑马鱼矫形器的击倒会导致与自发发作样发作相关的多动性，以及增强的电图活动和特征转轮游泳。在这里，我们描述了生成 DEPDC5 功能丧失模型所涉及的方法，并说明了在受精后（hpf）评估28小时和48小时运动活动的协议，以及记录斑马鱼光学结节中现场活动的方法。此外，还提供了癫痫药物PTZ对神经元活动的影响的说明。
Introduction
斑马鱼由于体积小、发育不全、发育不透明，已成为一种有价值的脊椎动物体，用于模拟心血管疾病、癌症或神经系统疾病等各种人类疾病。斑马鱼结合了脊椎动物的优势，包括器官结构和遗传密码的高度保护，以及更简单的模型生物体的较小尺寸和易于遗传操作，从而促进基础研究和转化应用。特别是，它对细胞过程的行为和荧光标记的高通量自动筛查的便利性使斑马鱼成为癫痫研究特别有吸引力的模型。过去十年来，以化学诱发和/或癫痫3、4、5等基因模型为特色的出版物数量大幅增加，最近，关于这些模型6、7、8的化学屏幕获得有希望的治疗方法的报告也证明了这一点。
DEPDC5是 GATOR1 复合体的成员，该复合体是 mTOR 信号 9 的负调节器。DEPDC5基因的突变于2013年首次在患有10、11号体外显性焦点癫痫的前列腺中发现，此后在一些临床疾病中报告与焦点癫痫表现和焦皮质发育不良相关的12。绝大多数报告的突变被预测导致基因12的功能丧失，这被正式证明为一些DEPDC5突变的脚本，这是由废话调解mRNA衰变12，13的目标。根据协议，使用抗感性形态寡核苷酸（AMOs）敲击斑马鱼中的基因矫形器，可产生该生物体中癫痫模型常见的许多特征，包括多动、转轮式游泳、自发发作和增强神经元活动14、15、16、17、18。有趣的是，使用拉帕霉素（mTOR信号的抑制剂）治疗逆转了该模型18的行为特征，支持了DEPDC5功能丧失可能因mTOR通路9、19的失调而引发癫痫的假设。
使用携带形态改变的抗感性寡核苷酸在体内短暂地敲击基因表达，是研究特定基因作用的宝贵工具，与基于si/shRNA的技术相当。最近，基于AMO的策略也发现了临床应用，第一个AMO疗法在2016年20日获得FDA批准治疗杜氏肌萎缩。虽然据报道，在斑马鱼中，急性AMO基因敲击的表型并不总是与构成淘汰模型21相关，但至少在某些情况下，这可以归功于构成基因改造22产生的补偿机制。然而，AMO引起的表型的特异性问题是一个无可争议的问题，必须努力解决的研究使用这项技术23。为了确保基于 AMO 的击倒表型的特殊性，需要几个关键控件。其中包括一个剂量反应曲线，允许选择最低剂量的AMO有效基因击倒，避免整体毒性由于引入过量的遗传物质。还需要使用不针对基因组中任何特定区域的 不匹配 AMO 来确定适当的剂量和识别特定表型。第二个针对同一基因不同区域的 AMO（如拼接阻断 AMO）是确认表型是由于目标基因的击倒而必需的。用基因的cDNA（人类矫形器或无法被AMO瞄准的斑马鱼基因的科顿修改版本）来拯救被击倒的表型，为表型特异性提供了有力的论据。缺乏与包含功能丧失突变的相同 cDNA 的救援（如引入早期停止科顿）是这一方向的进一步证明。
在这里，我们提出了一个生成斑马鱼DEPDC5功能丧失模型的方法和行为表型在28和48小时施肥后（hpf）的方案。在28马力时，DEPDC5功能丧失会导致整体多动，在胆汁中胚胎的盘绕和抽搐运动增强就证明了这一点。在这个阶段，可以使用自动运动检测系统来量化每个胚胎的整体活性。在48马力，斑马鱼表现出刻板的逃生游泳回应触摸。在斑马鱼与DEPDC5的低调节表达，游泳轨迹明显比在控制，鱼表现出"软螺丝"或"转轮"一样的模式，类似于其他报告癫痫模型在这个有机体3，4。在受精后4-6天（dpf）内，在斑马鱼幼虫的光学结节中获取了电生理记录，并显示DEPDC5击倒动物的神经元活动基线增加。该模型的优点是，它在不同的时间点呈现了几个表型特征，可用于监测和评估药物疗法在开发过程中的疗效。
Protocol
实验程序已得到国家和机构道德委员会的批准。
1. 斑马鱼胚胎中 DEPDC5 基因的瞬时敲击
- 工具的准备：
- 准备硅弹性体涂层注射培养皿：以10：1的比例混合套件的底座和固化剂（见 材料表）。用混合物填充一个35毫米的培养皿的一半。等待硅硬化后再使用（这可能需要几天时间）。
- 准备1.2 mmol/L反感性形态寡核苷酸（AMO：见 材料表）的库存溶液。将 250 μL 的无菌水添加到 300 nmole 嗜热 AMO 中，以获得 1.2 mmol/L 库存解决方案。要完全溶解，在 65 °C 下加热小瓶 5 分钟。 漩涡短暂。用塑料薄膜密封管盖（见 材料表）。
- 对于控制救援实验，准备一个表达质粒，其中包含在PCS2主干中克隆的 DEPDC5 的人体cDNA（见 材料表）或类似的斑马鱼兼容表达质粒。作为负对照，cDNA 中引入了导致早期停止科顿 （p.Arg487*） 的突变。
- 准备胚胎水：0.06克/升水族馆盐（见 材料表）在反渗透水中 + 0.5毫克/升甲基蓝。
- 注射当天，使用拉拔器准备微注射玻硅酸盐玻璃针（见 材料表）。在拔针器上设置适当的温度设置。使用长 10 厘米、1/0.5 OD/ID mm 的胸硅酸盐玻璃毛细血管生成两个 +5 厘米毛细管，尖端薄，长度约 1 厘米。
- 如果针尖非常精细，防止溶液弹出，则使用显微镜下的钳子打破锥形尖端的末端。
- 就在注射之前，准备 AMO 的工作解决方案。始终准备新的解决方案，以确保结果的可重复性。在 65 °C 下加热 AMO 库存小瓶 5 分钟。准备一个5微升注射样品，含有快速绿色染料（0.02%的最终浓度，见 材料表）和AMMO稀释在水中的工作浓度。
- 使用剂量响应曲线，以经验确定每个基因的 AMO 工作浓度。工作浓度表示 AMO 在不引起一般毒性（如严重形态缺陷）的情况下有效击打基因的浓度。通常，AMO 工作浓度将在 0.2 mmol/L 到 1 mmol/L （0.4 mmol/L 被确定为本研究18的有效浓度） 范围内。将控制不匹配的形态与有效的 AMO 同集中。
- 将管子和离心机短暂地旋涡，将液滴带到管子的底部。
- 对于救援实验，准备一个5微升注射样品，AMO在工作浓度下稀释，cDNA表达质粒在水中稀释，最后浓度由经验确定。对于 DEPDC5 和负控制质粒的表达，100 ng/μL对表型救援是有效的。
- 胚胎制备：
- 微注射前一天，设置斑马鱼交配池。注射的早晨，取出分隔器，使产卵。用细筛将卵子收集到装满胚胎水的100毫米培养皿中。在收集后20-30分钟内注射，而卵子处于一个细胞阶段。
- 用塑料巴斯德移液器挑选60-80个鸡蛋，并把它们放在硅涂层的培养皿中注射。硅表面将防止鸡蛋在注射过程中滑动。取出大部分胚胎水，留下足够覆盖卵子的一半。
- 微投影：
- 用注射液填充玻璃针。将针头垂直放置在包含注射溶液的管子中，确保针头的底端接触溶液。等待几分钟，直到彩色注射液上升毛细小，并在针尖可见。
- 将填充针安装在微喷射器的注射手柄上（见 材料表）。
- 打开空气压缩机并调整压力设置，以产生 +2 nL 的喷射音量。
- 要计算注入溶液的体积，将一滴矿物油放在微原子幻灯片上。使用设置的压力和时间参数注入含染料溶液。测量注入流体球体的直径，并使用公式体积=4/3*π*（d/2）3计算总体积，其中 d= 注射的玻利瓦尔的测量直径。
- 使用具有 4 倍放大倍数的解剖双目显微镜，通过胆汁和蛋黄在单细胞阶段注射卵子，并将溶液直接投射到细胞内。
- 将注射的胚胎收集到100毫米的培养皿中，用胚胎水，给培养皿贴上标签，并在28°C下孵育。
- 确保孵化器温度随着时间的推移而稳定，因为胚胎发育速度是热敏的。例如，在高温下将加速增长，而发展阶段对于正确评估表型24至关重要。
- 注射后6-8小时检查卵子的质量，使用塑料巴斯德移液器去除死胚胎和未受精胚胎。
- 第二天早上，用塑料巴斯德移液器清点并取出每道菜中的死胚胎。
2. 行为分析
- 全球活动分析 28 hpf：
- 在微注射后的当天下午进行测试（28 hpf），确保进行测试的时间与实验时间一致，以便在胚胎发育非常迅速时进行有效的统计分析。
- 在开始测试前，用胚胎水填充一个35毫米的盘（测试盘），让它在孵化器（28°C）中加热至少15分钟。
- 将塑料网格（1.2x1.2 mm）切成大小，放在测试盘的底部。
- 让另一个实验者随机确定胚胎的测试顺序，并掩盖待测试条件的名称。
- 确保死亡率不会在各种条件下变化，与未注射胚胎相比，以确保表型的特异性。在所有条件下，死亡胚胎的百分比不得超过10-13%。
- 使用塑料巴斯德移液器将10-12个胚胎放在塑料网的夹层内。给试验盘装满足够的胚胎水，使胚胎保持水下，但不漂浮。如果需要，使用塑料尖端小心地移动胚胎，将其放置在网格上。
- 使用附在解剖显微镜上的摄像机（参见 材料表），将自发的盘绕活动记录在规定的时间内（10-20 分钟长的视频通常足以获取具有代表性的活动爆发样本进行量化）
- 将胚胎放回各自的培养皿中，并放回孵化器中。重复实验与每个条件所需的尽可能多的胚胎（由90%的功率分析确定）。
- 要分析完全自发的运动，请使用斑马实验室系统（参见 材料表）。使用活动量化模块，上传录制的视频，并酌情设计每个胚胎周围的跟踪竞技场。将冻结和爆裂阈值分别设置为 10 和 50。
- 运行自动视频分析，量化每个定义的竞技场内的总活动，然后将数据集恢复为电子表格，并使用数据分析软件执行分析。
- 触摸-唤起-逃生响应 （TEER） 在 48 hpf：
- 在注射后两天（施肥后48小时）的早晨进行测试。
- 在测试前至少2小时，使用细钳将胚胎除以。确保一天中的解压时间与行为测试在实验中保持一致。
- 在启动测试前，用胚胎水填充一个 130 mm 的盘（测试盘），并允许它在孵化器 （28 °C） 中加热至少 15 分钟。
- 计数并清除死亡和形态变形的幼虫。记录每个条件的数字。
- 让另一个实验者随机排列顺序并编纂待测试条件的名称。
- 将相机（参见 材料表）安装在测试盘上，确保整个测试盘在视野内。将尺子放在视野内可提供距离的内部校准。
- 使用塑料巴斯德移液器，将胚胎放在测试盘的中心，并开始使用 30 fps 的采集率进行记录。
- 用细塑料尖端，用轻弹运动稍微触摸胚胎的尾巴。
- 当幼虫终止其运动时，停止录音。
- 从试验盘中取出胚胎，放入充满胚胎水的新盘中。重复测试与尽可能多的胚胎所需的每个条件（由90%的功率分析确定）。
- 将胚胎放回原盘，并放回孵化器中。
- 要分析游泳行为的参数，将录制的视频加载到 ImageJ 分析软件中。下载并安装 ImageJ 的手动跟踪插件（参见 材料表）。通过选择工具|启动插件 插件|菜单中的手动跟踪 。
- 在对话窗口中，介绍图像的校准比例。在相机领域中包括一个尺子有助于将厘米转换为像素。
- 选择 添加轨道 ，通过单击第一帧中的斑马鱼幼虫图像开始轨迹跟踪。帧随着添加到跟踪的每个点自动前进。
- 继续追踪运动，直到游泳结束。
- 在跟踪窗口上选择 端轨 ，检索 X-Y 坐标并计算总距离、速度和转弯角度。
3. 电生理分析
- 试剂和工具准备：
- 在胚胎水中准备1%的藻糖（见第1.1.4节）。将液体在微中心气管中产生，并将这些液体放在 42 °C 的加热块上，以防止气融变硬。
- 准备录制解决方案（以 mmol/L 为内）：NaCl 134、KCl 2.9、CaCl2 2.1、MgCl2 1.2、葡萄糖 10、HEPES 10、pH 7.8。
- 拉波罗西卡特玻璃微管，尖端开口为 1.5-2 μm （5-6 Mm2+kg=3 =A +2阻力）未抛光。
- 斑马鱼幼虫的电生理学准备：
- 将鱼放在玻璃底的Petri菜肴中（见 材料表），并去除多余的细胞外介质，以确保鱼尽可能靠近盖滑。
- 使用塑料巴斯德移液器，在幼虫及其周围添加温暖的液体。用足够的玫瑰来覆盖鱼。当玫瑰变硬时，使用细钳将鱼定向在直的位置，腹腔向下，在盘子的中心。
- 添加 2 mL 的录音溶液，其中含有 10 μM 溴化钾（参见 材料表），以阻止神经肌肉传输。添加麻痹剂是必要的，以消除由于录音过程中的微小运动造成的人工制品。
- 电生理记录
- 用录音溶液填充微管。
- 在电压夹配置中，通过贴片夹放大器（参见 材料表），测量浴缸中的电极电阻，以确认其正确值。
- 使用 20 倍目标，将幼虫的头部放置在中央视场中，并降低微管，以达到大脑中视结的记录位置。
- 将贴片夹放大器切换到电流夹并将保持电流固定到 0 mA。
- 使用 1 kHz 的低通度过滤器、1 kHz 的采集速率和 10 的数字增益，记录 60 分钟的自发活动，以确定基线活动水平。
- 在 1 小时的基线记录后，在浴缸中加入 200 μL 五角形甲醇 （PTZ，参见 材料表） 溶液 300 mmol/L，最终浓度为 20 mmol/L PTZ。
- 将 PTZ 中的神经元活动再记录 120 分钟。
- 去极化事件确定
- 现场记录事件动态非常缓慢（感兴趣的频率在 0.005-0.2 s-1之间）。因此，用低通度过滤信号（巴特沃斯第5阶LPF在100s-1），以避免别名化名。将记录的电压数据从采集帧速率（在此例中为 1 ks-1）下放至 250 s-1（RAW 信号）。
- 要识别每个去极化事件的时间戳，请使用检测信号，这是记录信号的高通过滤版本（Butterworth 第一阶 HPF 在 0.01 s-1）。
- 通过消除低频组件，可以使用简单的阈值方法进行去极化事件的检测。使用固定阈值进行降噪和事件检测（本研究使用了 0.3 mV）。
- 以一系列阈值交叉来描述去极化事件，这些阈值交叉发生在小于 4 s 的时间间隔内。计算从连续的阈值交叉序列确定的去极化事件的开始和结束。短于 40 ms 的事件可以丢弃为噪声。
- 计算未过滤 （RAW SIGNAL） 中事件的振幅，以消除由于低通过滤对事件峰值的影响而产生的错误。使用过滤信号中确定的时间戳从原始信号中选择去极化波。测量振幅，作为从原始信号中选择的波片的最大值和最小值之间的差值。
注意： 执行步骤 3.4 - 去极化事件确定和获取 图 1 的脚本文件作为附加到本文的 辅助文件 提供。
Representative Results
图1 显示了在两种遗传条件下4-6 dpf斑马鱼幼虫细胞外场记录的代表性电压痕迹：不匹配控制和 DEPDC5 击倒。在记录的基线期间 ，DEPDC5 击倒显示自发事件发生率较高，而不匹配控制显示的波动很少。这些活动模式代表了由于 DEPDC5功能丧失导致神经元活动显著增加，正如我们之前报告的18。在 PTZ 应用后，不匹配控制和 DEPDC5 击倒都显示去极化事件的数量有所增加。在 PTZ 应用后的第一个期间（10~60 分钟），在不匹配控制和 DEPDC5 击倒中观察到每分钟 0.8 个事件的速率，其中大多数事件的振幅都很高（> 1 mV）。在后一个响应期间（PTZ 应用后 60 至 120 分钟），去极化事件的速度增加到每分钟 1 个事件左右，大多数事件振幅较低（≤ 1 mV）。
图1：斑马鱼幼虫大脑中现场记录的示例痕迹。 （A） 对不匹配控制幼虫和DEPDC5击倒的180分钟记录概述。首先，记录了自发的基线活动，然后在浴缸（红条）中应用了PTZ。（B） 灭极事件的围刺激时间直方图，用于不匹配控制和 DEPDC5 击倒。事件分为高振幅（>1 mV - 蓝色）和低振幅（≤1 mV - 黑色）。（C-E）记录不同时期的示例：（C）自发活动，（D）PTZ 应用后第一期的高振幅事件，PTZ应用后的后一个时期的低振幅事件。请注意，获取这些数字的脚本文件作为 补充文件提供。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充文件：步骤 3.4 的脚本文件。请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
癫痫是一种复杂的神经系统疾病，其特征是多种病因，随着基因测序技术25、26、27的出现，这些病因开始被阐明。多功能动物模型对于有效的转化策略至关重要，该策略将同时深入了解基因联系癫痫的病理机制，并为此情况的不同形式提供有针对性的治疗方法。斑马鱼模型在复制癫痫的主要特征和提供可靠的读数抗癫痫药物筛查5，28。在转基因斑马鱼15、29、30、31和神经生理分析中可以检测到自发性癫痫发作，这些模型28证实了癫痫样行为的神经元基础32、33。小型斑马鱼幼虫可以采用96井格式的化学屏幕，可自动检测简单行为，如自发游泳，从而能够快速检测潜在的治疗方法。
这里介绍的 DEPDC5 击倒模型是通过将AMO注射到斑马鱼胚胎中以阻止基因表达而获得的。该模型在幼虫发育的不同时间点呈现几个基石表型特征，可在化学或基因筛选协议期间用作治疗效率指标。AMO介导基因击倒是一项强大的技术，它比化学诱导的癫痫发作模型显示出优势，因为它特别针对感兴趣的基因的表达，从而能够识别由基因突变触发的潜在致病机制。化学诱导剂是药物筛选的有力工具，它可以通过多个细胞通路起作用，这些通路可能并不总是与正在研究的基因突变相关。虽然 AMO 注射本身是实验者掌握的简单技术，但它也存在许多局限性。注射必须在一个细胞阶段胚胎进行：在我们手中，后期注射大大增加了表型的变异性。这限制了注射的时间;因此，按时间顺序生成卵子进行注射的策略是有用的。我们通常使用 4-5 十字架，我们以 15-20 分钟间隔打开，允许在获得下一个离合器之前注射一个离合器。此外，由于成见行为在发育的最初几天发展迅速，因此必须注意在不同实验之间的同时点评估表型。AMO 的体积和浓度也必须仔细控制，因为注射过量导致的一般毒性会掩盖特定表型。介绍中提出的不同对照对于确定正确的注射剂量和相应的表型至关重要。
幼虫斑马鱼大脑的现场记录是研究不同脑部疾病涉及的基因突变对全球神经元活动34的有害影响的有用工具。在这些实验条件下看到的去极化事件是评估不同癫痫条件下药物电生理作用的既定方法。然而，对这些影响的评估大多在质量上而不是定量上进行，并在分析中具有主观观察者的作用。在这里，我们开发一个自动检测策略，可以客观地量化去极化的速度，其振幅和持续时间，并可以评估这些参数的进展，随着时间的推移，或通过不同的基因或药理干预。
这里提出的代表性结果表明，与4-6 dpf斑马鱼的不匹配控制相比 ，DEPDC5 击倒基因模型的预期场活动，在PTZ应用引入癫痫状电图活动之前和之后。此前，我们已显示 DEPDC5 击倒条件18的基底活动显著增加。在这里，我们表明，这两种情况对PTZ（一种化学癫痫活动诱因）的反应在时间上具有类似的轨迹，从频率相对较低、振幅较高的去极化事件开始，并持续一个频率较高、振幅较低的去极化事件。现场记录事件具有缓慢的动态（感兴趣的频率在 0.005-0.2 s-1之间），因此本协议中使用低通和高通滤镜来隔离感兴趣的事件。消除低频噪声后，使用简单的阈值进行去极化事件的检测。由于信号的统计数据受到去极化事件的极大影响，因此我们无法使用总信号的标准偏差来确定此阈值。数据集中标准偏差值的变异性大于观察到的记录噪声水平。因此，在对痕迹进行目视检查后，我们使用了0.3mV阈值的固定值，以避免不同水平的去极化活动引起的偏差。
所述协议提供了一个标准化和简单的方法来评估运动行为和神经元场活动，通过细胞外电流夹电压记录，以及自动检测光结节中的去极化事件，以描述斑马鱼模型中的癫痫状表型。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢进行神经生理实验的ICM电生理学平台的工作人员。我们还感谢安卡玛丽安的技术帮助。SC 得到了电车赠款 #21488 的支持。EK 得到了 AFM 赠款 #18469 和 ERC 合并剂授予 （ALS-网络） 的支持。HC 得到了梅迪卡莱基金会 （PLP20141031462） 和 ARSLA 的博士学位支持。在广告和RM方面，这项工作得到了罗马尼亚国家科学研究和创新局、国家科学研究中心-UEFISCDI（项目编号PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010、PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007） 的三笔赠款的支持。 和COFUND-神经-NMDAR-PSY），由欧盟地平线2020研究与创新计划赠款 - 赠款协议第668863-SyBil-AA，以及由美国政府资助的国家科学基金会赠款NSF-IOS-1656830。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
| Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1.5mm, ID: 0.5 mm |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
| Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
| Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
| Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
| Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
| Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
| Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
| HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
| Human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
| ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
| KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
| Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
| Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60 mM in water |
| Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
| pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
| Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300 mM (dissolved in recording solution) |
| Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
| Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
| Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
| Zebralab | Viewpoint, France | N/A |
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