Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להתפתחות ואפיון של מודל דג זברה של אפילפסיה הנובע מהעיכוב הארעי של הגן DEPDC5.
Abstract
אפילפסיה מייצגת את אחת ההפרעות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר, המשפיעה על כ -50 מיליון אנשים ברחבי העולם. ההתקדמות האחרונה במחקר הגנטי חשפה קשת גדולה של גנים מעורבים בצורות שונות של אפילפסיה, המדגיש את האופי ההטרוגני של הפרעה זו. מודלים מתאימים של בעלי חיים חיוניים לחקירת המנגנונים הפתולוגיים המופעלים על ידי מוטציות גנטיות הכרוכות באפילפסיה ולפיתוח טיפולים ייעודיים וממוקדים. בשנים האחרונות, דגי זברה התגלו כאורגניזם בעל חוליות בעל ערך למידול אפילפסיות, עם שימוש הן במניפולציה גנטית והן בחשיפה לתרופות אפילפטוגניות ידועות, כגון פנטילנטטרזול (PTZ), כדי לזהות טיפולי אנטי אפילפטיים חדשניים. מוטציות מזיקות ברגולטור mTOR DEPDC5 קושרו לצורות שונות של אפילפסיות מוקדיות והפלה של האורתולוג של דג הזברה גורמת להיפראקטיביות הקשורה לפרקים ספונטניים דמויי התקפים, כמו גם פעילות אלקטרוגרפית משופרת ושחייה אופיינית לגלגל מסתובב. כאן תיארנו את השיטה הכרוכה ביצירת מודל אובדן התפקוד של DEPDC5 וממחישים את הפרוטוקול להערכת פעילות מוטורית במהירות של 28 ו-48 שעות לאחר ההפריה (hpf), וכן שיטה להקלטת פעילות שדה בקטקום אופטי של דגי הזברה. איור של ההשפעה של PTZ התרופה אפילפטוגנית על פעילות עצבית לאורך זמן מסופק גם.
Introduction
בשל גודלו הקטן, התפתחותו ושקיפותו בשלבים המוקדמים של ההתפתחות, דגי זברה התגלו כאורגניזם בעל חוליות בעל ערך למידול מחלות אנושיות מגוונות כמו הפרעות לב וכלי דם, סרטן או נוירולוגיות1,2. דגי זברה משלבים את היתרונות של בעל חוליות, כולל שימור גבוה של ארכיטקטורת איברים וקוד גנטי, עם הגודל הקטן והקלות של מניפולציה גנטית של אורגניזמים מודל פשוט יותר, ולכן להקל הן מחקרים בסיסיים ויישומים תרגומיים. בפרט, הנוחות שלה סינון אוטומטי תפוקה גבוהה של התנהגות וסמנים פלואורסצנטיים של תהליכים תאיים הפכה את דגי הזברה למודל אטרקטיבי במיוחד למחקר אפילפסיה. זה הוכח על ידי עלייה גבוהה בעשור האחרון של מספר הפרסומים הכוללים מודלים כימיים ו / או גנטיים של אפילפסיה3,4,5 ולאחרונה, דיווחים על טיפולי מבטיחים שהתקבלו ממסכים כימיים בדגמים אלה6,7,8.
DEPDC5 הוא חבר במתחם GATOR1, רגולטור שלילי של איתות mTOR9. מוטציות בגן DEPDC5 התגלו לראשונה בשנת 2013 בפרובנדים הסובלים מאפילפסיה מוקדית אוטוזומלית דומיננטית10,11, ומאז דווחו במספר מצבים קליניים הקשורים לביטויים אפילפטיים מוקדיים ודיספלזיה קליפת המוח מוקד12. הרוב הגדול של המוטציות המדווחות צפויות לגרום לאובדן תפקוד של הגן12, וזה הוכח באופן רשמי עבור מספר תמלילים מוטציה DEPDC5 אשר ממוקדים על ידי שטויות בתיווך mRNA ריקבון12,13. בהסכמה, הפלה של אורתולוג הגן בדגי זברה באמצעות אנטיסנס מורפולינו אוליגונוקלאוטידים (AMOs) גורמת למספר תכונות הנפוצות במודלים אפילפטיים באורגניזם זה, כולל היפראקטיביות, שחייה דמוית גלגל מסתובב, התקפים ספונטניים ופעילות עצבית משופרת14,15,16,17,18. מעניין, טיפול עם rapamycin, מעכב של איתות mTOR, הפך את התכונות ההתנהגותיות של מודלזה 18, תמיכה בהשערה כי DEPDC5 אובדן תפקוד יכול לעורר אפילפסיה עקב misregulation של מסלול mTOR9,19.
הפלה חולפת של ביטוי גנים ב- vivo באמצעות אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס הנושאים את שינוי מורפולינו היה כלי רב ערך לחקר התפקיד של גנים ספציפיים, בדומה לטכניקות מבוססות si / shRNA. לאחרונה, אסטרטגיות מבוססות AMO מצאו גם יישומים קליניים, עם טיפול AMO הראשון שקיבל את אישור ה-FDA לטיפול בניוון שרירים Duchenne בשנת 201620. אמנם דווח כי בדגי זברה הפנוטיפ של נוק-אאוט גנטי חריף מבוסס AMO לא תמיד תואם עם מודלי נוק-אאוט מכוננים21, זה יכול להיות בשל לפחות במקרים מסוימים מנגנוני פיצוי נוצר על ידי שינויים גנטיים מכוננים22. עם זאת, הנושא של הספציפיות של פנוטיפ המושרה AMO הוא חשש בלתי מעורער כי יש לטפל בחריצות במחקרים באמצעות טכנולוגיה זו23. על מנת להבטיח את הספציפיות של פנוטיפ מבוסס AMO, מספר פקדי מפתח נחוצים. אלה כוללים עקומת תגובת מינון המאפשרת את הבחירה של המינון הנמוך ביותר של AMO יעיל עבור נוק-אאוט גנים, הימנעות רעילות כללית עקב כניסת עודף של חומר גנטי. השימוש AMO mismatch שאינו מכוון לאזור מסוים בגנום נדרש גם לביסוס מינון מתאים ובזיהוי פנוטיפ ספציפי. AMO שני אשר מכוון לאזור אחר של אותו גן, כגון AMO חסימת חיבור, יש צורך לאשר כי פנוטיפ נובע ההפלה של גן היעד. הצלת הפנוטיפ הנוק-אאוט עם ה- cDNA של הגן, האורתולוג האנושי או גרסה מותאמת קודון של גן דג הזברה שלא ניתן למקד על ידי ה- AMO, מספקת טיעון חזק לטובת הספציפיות הפנוטיפ. חוסר הצלה עם אותו cDNA המכיל מוטציות אובדן פונקציה (כגון הקדמה של קודונים עצירה מוקדמת) הוא הוכחה נוספת בכיוון זה.
כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת מודל אובדן תפקוד של דג זברה DEPDC5 והפרוטוקול עבור פנוטיפינג התנהגותי ב 28 ו 48 שעות לאחר ההפריה (hpf). ב 28 hpf, DEPDC5 אובדן תפקוד גורם היפראקטיביות כללית, כפי שמעיד על ידי סליל משופר ותנועות עוויתות של העוברים בתוך chorion. ניתן להשתמש במערכת אוטומטית לזיהוי תנועה בשלב זה כדי לכמת את הפעילות הכוללת לכל עובר. ב-48 כ"ס, דגי הזברה מציגים בריחה סטריאוטיפית בתגובה למגע. בדגי זברה עם ביטוי מופחת של DEPDC5, מסלול השחייה הוא הרבה יותר נזיקי מאשר בפקדים, הדגים המציגים "פקק בורג" או "גלגל מסתובב" כמו דפוס, בדומה לדגמים אחרים שדווחו אפילפסיה באורגניזם זה3,4. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות הושגו בקטטום האופטי בזחלי דגי זברה בין 4-6 ימים לאחר ההפריה (dpf) ומציגות עלייה בסיסית בפעילות העצבית בבעלי חיים נופלים DEPDC5. היתרון של מודל זה הוא שהוא מציג מספר תכונות פנוטיפיות בנקודות זמן שונות, אשר יכול להיות שימושי בניטור והערכה של היעילות של טיפולים תרופתיים במהלך הפיתוח.
Protocol
הליכים ניסיוניים אושרו על ידי הוועדות האתיות הלאומיות והמוסדיות.
1. נוק-אאוט חולף של גן DEPDC5 בעובר דג זברה
- הכנת כלים:
- הכן סיליקון מצופה הזרקה מנות פטרי: לערבב את הבסיס ואת סוכן ריפוי של הערכה (ראה טבלה של חומרים) ביחס 10:1. ממלאים צלחת פטרי 35 מ"מ באמצע התערובת. המתן עד שהסיליקון יתקשה לפני השימוש בו (זה יכול לקחת כמה ימים).
- הכן 1.2 mmol / L פתרונות מלאי של אנטיסנס מורפולינו אוליגונוקלאוטידים (AMO; ראה טבלה של חומרים). הוסף 250 μL של מים סטריליים ל 300 נמולה ליופילי AMO כדי לקבל פתרון מלאי 1.2 mmol / L. לפירוק מלא, מחממים את הבקבוקונים במשך 5 דקות ב 65 °C (65 °F). מערבולת בקצרה. לאטום את מכסה הצינור עם סרט פלסטיק (ראה שולחן חומרים).
- לניסויי ההצלה של הבקרה, הכינו ביטוי פלסמיד המכיל את ה- cDNA האנושי של DEPDC5 (ראה טבלת חומרים) המשובט בעמוד השדרה של pCS2 או ביטוי דומה תואם זברה plasmid. כשליטה שלילית, מוטציה הגורמת לקודון עצירה מוקדמת (p.Arg487*) הוצגה ב- cDNA.
- הכן מי עובר: 0.06 גר'/ל' מלח אקווריום (ראו טבלת חומרים)במי אוסמוזה הפוכים + 0.5 מ"ג/ל' מתילן כחול.
- ביום ההזרקה, להכין מחטי זכוכית borosilicate מיקרו-ג'ק באמצעות פולר (ראה שולחן חומרים). קבע הגדרות טמפרטורה מתאימות על מושך המחט. השתמש באורך 10 ס"מ, 1/0.5 OD / ID mm borosilicate זכוכית נימי כדי ליצור שני נימים ~ 5 ס"מ עם טיפים דקים עם אורך של כ 1 ס"מ.
- אם קצה המחטים הוא בסדר גמור, מניעת פליטה של פתרון, לשבור את הקצה מאוד של הקצה מחודד באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ.
- רגע לפני ההזרקה, הכינו את פתרונות העבודה של עמוסים. תמיד להכין פתרון טרי כדי להבטיח את השחזור של התוצאות. מחממים את בקבוקוני מלאי AMO ב 65 °C (5 דקות). הכן מדגם הזרקה 5 μL המכיל צבע ירוק מהיר (0.02% ריכוז סופי, ראה טבלה של חומרים ) ואת AMO מדולל בריכוז העבודה במים.
- קבע את ריכוז העבודה של AMO אמפירית עבור כל גן באמצעות עקומת תגובת מינון. ריכוז העבודה מייצג ריכוז שבו AMO יעיל בהפלת הגן מבלי לגרום לרעילות כללית, כגון פגמים מורפולוגיים ברוטו. בדרך כלל, ריכוזי עבודה AMO יהיה בטווח של 0.2 mmol / L כדי 1 mmol / L (0.4 mmol / L נקבע הריכוז היעיל עבור מחקר זה18). הזריקו את השליטה מורפולינו אי התאמה באותו ריכוז כמו AMO יעיל.
- מערבולת את הצינורות ואת הצנטריפוגות בקצרה כדי להביא את הטיפות לתחתית הצינורות.
- לניסויי הצלה, הכינו דגימת הזרקה של 5 μL עם AMO מדולל בריכוז העבודה ואת ביטוי cDNA plasmid מדולל במים לריכוז סופי שייקבע אמפירית. עבור הביטוי של DEPDC5 ואת פלסמיד שליטה שלילית, 100 ng / μL היה יעיל להצלה פנוטיפית.
- הכנת עוברים:
- יום לפני המיקרו-ינון, הקם את מיכלי ההזדווגות של דגי הזברה. בבוקר ההזרקה, להסיר את המחווצים כדי לאפשר השרצה. אסוף את הביצים בצלחות פטרי 100 מ"מ מלא במי עובר באמצעות מסננת בסדר. הזריקו תוך 20-30 דקות מהאיסוף, בעוד הביצים נמצאות בשלב תא אחד.
- בחרו 60-80 ביצים עם פיפטת פסטר מפלסטיק וסידרו אותן בצלחת הפטרי מצופה הסיליקון להזרקה. משטח הסיליקון ימנע מהביצים להחליק במהלך הזריקות. הסר את רוב מי העובר, משאיר רק מספיק כדי לכסות את הביצים באמצע הדרך.
- מיקרו-טג'קציה:
- מלא מחט זכוכית עם פתרון הזרקה. מניחים את המחט אנכית באחד הצינורות המכילים את פתרון ההזרקה, ומבטיחים כי הקצה התחתון של המחט נוגע בתמיסה. המתן מספר דקות עד פתרון ההזרקה הצבעוני עולה על ידי נימיות והוא גלוי בקצה המחט.
- הר את המחט המלאה על ידית ההזרקה של microinjector (ראה טבלה של חומרים).
- הפעל את מדחס האוויר ולהתאים את הגדרת הלחץ כדי ליצור נפח הזרקה של ~ 2 nL.
- כדי לחשב את נפח הפתרון המוזרק, הנח טיפה של שמן מינרלי על שקופית מיקרוטום. הזרק את הפתרון המכיל צבע באמצעות הפרמטרים של הלחץ והזמן שנקבעו. למדוד את הקוטר של כדור הנוזל מוזרק ולחשב את הנפח הכולל באמצעות הנוסחה נפח = 4/3 * π *(d/2)3, שבו d = הקוטר הנמדד של בולוס מוזרק.
- באמצעות מיקרוסקופ משקפת מנתח עם הגדלה פי 4, הזריקו את הביצים בשלב התא הבודד על ידי מעבר דרך הכוריון והחלמון, והקרנת הפתרון ישירות בתוך התא.
- לאסוף את העוברים מוזרק בצלחת פטרי 100 מ"מ עם מי עובר, לתייג את המנה לדגור אותם ב 28 °C (70 °F).
- ודא כי טמפרטורת החממה יציבה לאורך זמן, כמו קצב התפתחות העוברים הוא רגיש תרמוסיטי. לדוגמה, הצמיחה תואץ בטמפרטורות גבוהות יותר והשלב ההתפתחותי הוא קריטי להערכה נכונה של הפנוטיפ24.
- בדוק את איכות הביצים 6-8 שעות לאחר ההזרקה ולהסיר עוברים מתים ולא מופרים באמצעות פיפטת פסטר פלסטיק.
- למחרת בבוקר, לספור ולהסיר עוברים מתים בכל מנה עם פיפטת פסטר פלסטיק.
2. ניתוח התנהגות
- ניתוח פעילות גלובלית ב 28 hpf:
- לערוך את הבדיקה אחר הצהריים של היום לאחר microinjection (28 כ"ס), להבטיח כי השעה ביום שבו הבדיקה מתבצעת עקבי על פני ניסויים לבצע ניתוח סטטיסטי תקף כמו התפתחות העוברים הוא מהיר מאוד.
- מלא צלחת 35 מ"מ (צלחת בדיקה) עם מי עובר ולאפשר לו להתחמם באינקובטור (28 °C (28 °C) לפחות 15 דקות לפני תחילת הבדיקה.
- מניחים רשת רשת פלסטיק (1.2x1.2 מ"מ) חתוכה לגודל, בתחתית צלחת הבדיקה.
- יש ניסוי אחר אקראי את סדר הבדיקה של העוברים ולהסוות את שמות התנאים להיבדק.
- ודא כי שיעור התמותה אינו משתנה בין התנאים בהשוואה לעוברים שאינם מוזרקים כדי להבטיח את הספציפיות של הפנוטיפ. אחוז העוברים המתים בכל התנאים לא יעלה על 10-13%18.
- מניחים 10-12 עוברים עדיין בתוך chorion שלהם על רשת הפלסטיק באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק. מלאו את צלחת הבדיקה במספיק מי עובר כדי לשמור על העוברים שקועים אך לא צפים. במידת הצורך, להזיז את העוברים בזהירות באמצעות קצה פלסטיק למקם אותם על הרשת.
- באמצעות מצלמת וידאו (ראה טבלה של חומרים) המצורפת למיקרוסקופ ניתוח, להקליט את פעילות הסליל הספונטני במשך פרק זמן מוגדר (10-20 דקות קטעי וידאו באורך מספיקים בדרך כלל כדי לקבל דוגמאות מייצגות של פרצי פעילות לכימות)
- מחזירים את העוברים למנה שלהם ומחזירים אותם לאינקובטור. חזור על הניסוי עם כמה שיותר עוברים לפי הצורך עבור כל תנאי (כפי שנקבע על ידי ניתוח כוח 90%).
- כדי לנתח תנועה ספונטנית מוחלטת, השתמש במערכת ZebraLab (ראה טבלת חומרים). באמצעות מודול כימות הפעילות, העלה את הווידאו המוקלט ותכנן את זירות המעקב סביב כל עובר בהתאם לצורך. הגדר את סף ההקפאה ואת סף הפרץ ל- 10 ו - 50, בהתאמה.
- הפעל את ניתוח הווידאו האוטומטי, המכמת את הפעילות הכוללת בתוך כל אחת מהזירות המוגדרות, ולאחר מכן שחזר את ערכת הנתונים כגליונות אלקטרוני ובצע את הניתוח באמצעות תוכנת ניתוח נתונים.
- Touch-עוררed-Escape-Response (TEER) ב-48 כ"ס:
- לבצע את הבדיקה בבוקר יומיים לאחר הזריקה (48 שעות לאחר ההפריה).
- לפחות 2 שעות לפני הבדיקה, dechorionate העוברים באמצעות מלקחיים עדינים. ודא כי השעה ביום עבור dechorionation ואת מבחן ההתנהגות הוא עקבי על ניסויים.
- מלא צלחת 130 מ"מ (צלחת בדיקה) עם מי עובר ולאפשר לו להתחמם באינקובטור (28 °C (28 °C) לפחות 15 דקות לפני תחילת הבדיקה.
- לספור ולהסיר זחלים מתים ומעוותים מורפולוגית. רשום את המספרים עבור כל תנאי.
- יש ניסוי אחר אקראי הסדר ולתעד את שמות התנאים להיבדק.
- הר את המצלמה (ראה שולחן חומרים) מעל צלחת הבדיקה לוודא כי צלחת הבדיקה כולה היא בתוך שדה הראייה. הצבת סרגל בתוך שדה הראייה מספקת כיול פנימי למרחק.
- עם פיפטת פסטר מפלסטיק, לשים עובר במרכז צלחת הבדיקה ולהתחיל את ההקלטה באמצעות שיעור רכישה של 30 fps.
- עם קצה פלסטיק עדין, לגעת מעט את הזנב של העובר עם תנועת הבהוב.
- עצור את ההקלטה כאשר הזחל הפסיק את תנועתו.
- מוציאים את העובר מצלחת הבדיקה ומניחים אותו בצלחת חדשה מלאה במי עובר. חזור על הבדיקה עם כמה שיותר עוברים לפי הצורך עבור כל תנאי (כפי שנקבע על ידי ניתוח כוח 90%).
- מחזירים את העוברים למנה המקורית שלהם ומחזירים אותם לאינקובטור.
- כדי לנתח את הפרמטרים של התנהגות השחייה, טען את הווידאו המוקלט לתוכנת ניתוח ImageJ. הורד והתקן את תוסף המעקב הידני של ImageJ (ראה טבלת חומרים). הפעל את התוסף על-ידי בחירת כלים | | תוסף מעקב ידני בתפריט.
- בחלון הדו-שיח, הצג את קנה המידה המכויל של התמונה. הכללת סרגל בשדה המצלמה מאפשרת המרה של ס"מ לפיקסלים.
- בחר הוסף רצועה והתחל את מעקב המסלול על-ידי לחיצה על התמונה של זחל דג הזברה במסגרת הראשונה. המסגרות מתקדמות באופן אוטומטי עם כל נקודה המתווספת למעקב.
- המשך תעקבו אחר התנועה עד סוף פרק השחייה.
- בחרו 'סיום רצועה' בחלון המעקב, אחזרו את הקואורדינטות X-Y וחשבו את המרחק הכולל, המהירות וזווית המפנה.
3. ניתוח אלקטרופיזיולוגי
- ריאגנט והכנת כלים:
- הכן 1% אגרוז במי העובר (ראה סעיף 1.1.4). Aliquot הנוזל agarose בצינורות microcentrifuge ולשמור אותם על בלוק חימום ב 42 °C (70 °F) כדי למנוע את האגרה מהקשחה.
- הכן את פתרון ההקלטה (ב mmol / L): NaCl 134, KCl 2.9, CaCl2 2.1, MgCl2 1.2, גלוקוז 10, HEPES 10, pH 7.8.
- משוך מיקרופיטים מזכוכית בורוסיליקט עם פתח קצה של 1.5-2 מיקרומטר (5-6 מ"מ2·קג"ב−3· התנגדות−2) לא מלוטשת.
- הכנת זחלי דגי זברה לאלקטרופיזיולוגיה:
- מניחים את הדג בצלחת פטרי בתחתית זכוכית (ראו טבלת חומרים) ומסירים עודף מדיה חוץ-תאית על מנת להבטיח שהדגים יובאו קרוב ככל האפשר למכת השער.
- בעזרת פיפטת פסטר מפלסטיק, מוסיפים אגרוז נוזלי חם על הזחל וסביבו. השתמש מספיק אגרוז כדי לכסות את הדגים. בעוד אגרוז מתקשה, להשתמש במלקחיים עדינים כדי לכוון את הדגים במצב ישר, בצד הגחון למטה, במרכז המנה.
- הוסף 2 מ"ל של פתרון ההקלטה המכיל 10 μM Pancuronium ברומיד (ראה טבלה של חומרים) כדי לחסום שידור עצבי שרירי. התוספת של המשתק יש צורך לחסל חפצים בשל תנועות קטנות במהלך ההקלטות.
- הקלטה אלקטרופיזיולוגית
- מלא את המיקרופיט בתמיסת הקלטה.
- עם מגבר מהדק התיקון (ראה טבלה של חומרים) בתצורת מהדק מתח, למדוד עמידות אלקטרודה באמבטיה כדי לאשר את הערך הנכון שלה.
- באמצעות מטרה של פי 20, מקם את ראש הזחל בשדה הראייה המרכזי והנמיך את המיקרופיט כדי להגיע למיקום ההקלטה במוח, בתוך הקטטום האופטי.
- החלף את מגבר מהדק התיקון למצמד הנוכחי ותקן את זרם ההחזקה ל- 0 mA.
- באמצעות מסנן נמוך של 1 kHz, קצב רכישה של 1 kHz ורווח דיגיטלי של 10, שיא פעילות ספונטנית במשך 60 דקות לקביעת רמות פעילות בסיסית.
- לאחר 1 שעה של הקלטה בסיסית, להוסיף 200 μL פנטילנטטרזול (PTZ, ראה טבלת חומרים) פתרון 300 mmol / L לאמבטיה לריכוז סופי של 20 mmol / L PTZ.
- להקליט את הפעילות העצבית PTZ במשך 120 דקות נוספות.
- קביעת אירוע דה-קוטבי
- לאירועי הקלטת שדות יש דינמיקה איטית מאוד (תדרי עניין נמצאים בטווח של 0.005-0.2s-1). לכן, לסנן את האות עם מעבר נמוך (Butterworth 5 סדר LPF ב 100 s-1) כדי למנוע כינוי. תצמצם את נתוני המתח המתועדים מקצב הפריימים של הרכישה (במקרה זה, 1 ks-1) עד 250 s-1 (אות RAW).
- כדי לזהות את חותמות הזמן עבור כל אירוע של דה-פולאריזציה, השתמש באות זיהוי, שהוא גרסה מסוננת בעלת מעבר גבוה של האות המוקלט (HPF מסדר 1 של Butterworth ב- 0.01s-1).
- על ידי ביטול רכיבי התדר הנמוך, זיהוי אירועי דה-קוטביות יכול להתבצע בשיטת סף פשוטה. השתמש בסף קבוע לחיסול רעשים וזיהוי אירועים (0.3 mV שימש למחקר זה).
- לאפיין את אירוע depolarization על ידי סדרה של מעברי סף המתרחשים במרווחי זמן קטנים מ 4 s. חשב את ההתחלה ואת סופו של אירוע depolarization כפי שנקבע מתוך רצפים רצופים של מעברי סף. ניתן להשליך אירועים קצרים מ-40 מילישיות כרעש.
- חשב את המשרעת של האירועים ב- UNFILTERED (אות RAW) כדי למנוע שגיאות עקב ההשפעה של סינון המעבר הנמוך על שיא האירוע. בחר את גל הדה-קוטביות מהאות הגולמי באמצעות חותמות הזמן שנקבעו באות המסונן. מדוד את המשרעת כהבדל בין הערכים המרביים למינימום של הגל שנבחר מהאות הגולמי.
הערה: קבצי ה- Script לביצוע שלב 3.4 — קביעת אירועי דה-קוטביות - ולהשגת איור 1 מסופקים כקובץ משלים המצורף למאמר זה.
Representative Results
איור 1 מציג עקבות מתח מייצגים של 4-6 dpf זחל זברה זחל הקלטות שדה חוץ-תאי במקרה של שני מצבים גנטיים: בקרת אי התאמה ו- DEPDC5 נוק-אאוט. בפרק הבסיס של ההקלטה, ביטול ביטול של DEPDC5 מציג מופע גבוה יותר של אירועים ספונטניים, בעוד שפקד אי-התאמה מציג מעט מאוד תנודות. דפוסי פעילות אלה מייצגים את הגידול המשמעותי בפעילות העצבית עקב אובדן תפקוד של DEPDC5, כפי שדיווחנו בעבר18. לאחר יישום PTZ, הן בקרת אי-התאמה והן חיקוי של DEPDC5 מציגים מספר מוגבר של אירועי דה-קוטביות. במהלך התקופה הראשונה לאחר יישום PTZ (10 - 60 דקות), שיעור של 0.8 אירועים לדקה נצפה הן בקרת אי התאמה ו- DEPDC5, שבו רוב האירועים הם של משרעת גבוהה (>1 mV). במהלך תקופת התגובה האחרונה (60 - 120 דקות לאחר יישום PTZ), קצב אירועי depolarization עולה לסביבות אירוע אחד לדקה, ורוב האירועים הם של משרעת נמוכה (≤1 mV).
איור 1: דוגמאות להקלטות שדה במוח זחלי דגי הזברה. (A)סקירה כללית של הקלטה של 180 דקות להקלטה של בקרת אי התאמה ונוק-אאוט של DEPDC5. ראשית, פעילות בסיסית ספונטנית נרשמה, ואז PTZ הוחל באמבטיה (בר אדום). (B)היסטוגרמה זמן גירוי פרי של אירועי depolarization עבור בקרת אי התאמה ו- DEPDC5 לדפוק למטה. האירועים סווגו כמשרעת גבוהה (>1 mV - כחול) ומשרעת נמוכה (≤1 mV - שחור). (C-E) עקבות לדוגמה של התקופות השונות של ההקלטה: (C) פעילות ספונטנית, (D) אירועי משרעת גבוהה במהלך התקופה הראשונה לאחר יישום PTZ, (E) אירועי משרעת נמוכה בתקופה האחרונה לאחר יישום PTZ. שים לב כי קבצי Script כדי להשיג נתונים אלה מסופקים כקובץ משלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים: קבצי Script עבור שלב 3.4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
אפילפסיה היא מחלה נוירולוגית מורכבת, הכוללת מגוון רחב של אטיולוגיות שמתחילות להתבהר עם הופעתן של טכנולוגיות ריצוף גנטי25,26,27. מודלים חייתיים מגוונים חיוניים לאסטרטגיה תרגומית יעילה שתניב הן תובנות למנגנונים הפתולוגיים של אפילפסיות המקושרות גנטית, כמו גם טיפולים ממוקדים לצורות הייחודיות של מצב זה. מודלים של דגי זברה היו יעילים מאוד בשחזור תכונות עיקריות של אפילפסיה ובספקת קריאות אמינות להקרנת תרופות אנטי-אפילפטיות5,28. התקפים ספונטניים ניתן לזהות דג זברה מהונדס גנטית15,29,30,31 וניתוח נוירופיזיולוגי במודלים אלה28 אישר את הבסיס העצבי של התנהגות דמוית אפילפטי32,33. זחלי דגי זברה קטנים ניתנים למסכים כימיים בפורמט של 96 טוב באמצעות זיהוי אוטומטי של התנהגות פשוטה, כגון שחייה ספונטנית, המאפשרת זיהוי מהיר של טיפולים פוטנציאליים.
מודל ההפלה של DEPDC5 המוצג כאן מתקבל על ידי הזרקת AMO לעובר דג הזברה כדי לחסום ביטוי גנים במהלך הפיתוח. מודל זה מציג מספר תכונות פנוטיפיות keystone במהלך נקודות זמן שונות של התפתחות זחל, אשר יכול לשמש אינדיקטורים של יעילות הטיפול במהלך פרוטוקול הקרנה כימית או גנטית. ההנמקה הגנטית בתיווך AMO היא טכניקה רבת עוצמה, המציגה יתרונות על פני מודלים של התקפים הנגרמים כימית, שכן היא מכוונת באופן ספציפי לביטוי גן מעניין, ובכך מאפשרת זיהוי של המנגנונים הפתוגניים הבסיסיים המופעלים על ידי מוטציה גנטית. תורמים כימיים, שהם בכל זאת כלים חזקים להקרנות סמים, יכולים לפעול דרך מסלולים תאיים מרובים שאולי לא תמיד רלוונטיים למוטציה הגנטית הנחקרת. בעוד הזרקת AMO היא כשלעצמה טכניקה פשוטה כאשר שולט על ידי הנסיין, זה גם מציג מספר מגבלות. הזריקות צריכות להתבצע בעובר שלב תא אחד; בידיים שלנו, זריקות בשלבים מאוחרים יותר הגדילו מאוד את השונות של פנוטיפ. זה מגביל את הזמן הזמין להזרקה; לכן, אסטרטגיה של יצירת ביצים להזרקה ברצף זמן היא שימושית. אנו משתמשים באופן שגרתי 4-5 צלבים שאנו פותחים במרווחים של 15-20 דקות, ומאפשרים הזרקה של מצמד אחד לפני קבלת הבא. יתר על כן, יש לנקוט זהירות כדי להעריך את הפנוטיפ בו זמנית נקודות בין ניסויים שונים, כמו התנהגויות סטריאוטיפיות להתפתח במהירות בימים הראשונים של ההתפתחות. הנפח והריכוז של AMOs חייב גם להיות נשלט בקפידה, כמו רעילות כללית עקב הזרקת כמויות מוגזמות יהיה להסוות את פנוטיפ ספציפי. הפקדים השונים המוצגים במבוא חיוניים לקביעת מינון ההזרקה הנכון והפנוטיפ המתאים.
הקלטות שדה של מוח דג הזברה הזחלי הן כלי שימושי לחקירת ההשפעות המזיקות של מוטציות גנטיות המעורבות בהפרעות מוחיות שונות על הפעילות העצבית העולמית34. אירועי דה-קוטביות שנראו בתנאים ניסיוניים אלה הם שיטה מבוססת להערכת השפעות אלקטרופיזיולוגיות של תרופות בתנאים אפילפטיים שונים15,35. עם זאת, ההערכה של השפעות אלה נעשתה בעיקר באופן איכותי ולא כמותי, ויש משקיף סובייקטיבי כשחקן בניתוח. כאן, אנו מפתחים אסטרטגיית זיהוי אוטומטית שיכולה לכמת באופן אובייקטיבי את קצב ההבהרה, המשרעת ומשך הזמן שלהם, ויכולה להעריך את ההתקדמות של פרמטרים אלה לאורך זמן, או עם התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות שונות.
התוצאות הייצוגיות המוצגות כאן מראות את פעילות השדה הצפויה של המודל הגנטי של DEPDC5 בהשוואה לבקרת אי התאמה בדגי זברה 4-6 dpf, לפני ואחרי היישום של PTZ להציג פעילות אלקטרוגרפית דמוית אפילפטיפורם. בעבר, הראינו עלייה משמעותית בפעילות בסיסית של מצב הנוקאאוט של DEPDC5 18. כאן, אנו מראים כי התגובה של שני תנאים אלה PTZ, תמריץ פעילות אפילפטיפורם כימי, יש מסלול דומה בזמן, החל בתקופה של תדירות נמוכה יחסית, אירועי פירוק משרעת גבוהה והמשך עם תקופה של תדירות גבוהה יותר, אירועי טיהור משרעת נמוכה יותר. לאירועי הקלטת שדות יש דינמיקה איטית (תדרים מעניינים נמצאים בטווח של 0.005-0.2s-1), ולכן הן מסנני מעבר נמוך והן מסנני מעבר גבוה משמשים בפרוטוקול זה כדי לבודד את אירועי העניין. לאחר ביטול רעש התדר הנמוך, זיהוי אירועי דה-פולאריזציה מתבצע באמצעות סף פשוט. מכיוון שהסטטיסטיקה של האות מושפעת מאוד מנוכחותם של אירועי דה-קוטביות, לא יכולנו להשתמש בסטיית התקן של האות הכולל כדי לקבוע סף זה. השונות בערך סטיית התקן בערכות נתונים הייתה גדולה מרמות רעש ההקלטה שנצפו. לכן, לאחר בדיקה חזותית של העקבות, השתמשנו בערך קבוע של הסף של 0.3 mV, על מנת למנוע את ההטיה הנגרמת על ידי רמות שונות של פעילות depolarization.
הפרוטוקול המתואר מספק שיטה סטנדרטית ופשוטה להערכת ההתנהגות המוטורית ופעילות השדה העצבי, באמצעות הקלטת מתח מלחציים זרם חוץ תאי בשילוב עם זיהוי אוטומטי של אירועי דה-פולאריזציה בקטטום האופטי, כדי לאפיין פנוטיפים דמויי אפילפטיפורם במודלים של דגי זברה.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לצוות פלטפורמת האלקטרופיזיולוגיה של ICM בה בוצעו הניסויים הנוירופיזיולוגיים. אנו מודים גם לאנקה מריאן על העזרה הטכנית. SC נתמך על ידי מענק טרמפולינה #21488. EK נתמך על ידי מענק AFM #18469 ומענק איחוד ERC (ALS-Networks). HC נתמך על ידי פרסי דוקטורט מן פונדציה לשפוך la Recherche Médicale (PLP20141031462) ו ARSLA. עבור AD ו- RM, עבודה זו נתמכה על ידי שלושה מענקים מהרשות הלאומית הרומנית למחקר מדעי וחדשנות, CNCS-UEFISCDI (מספרי פרויקטים PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007, ו- COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), מענק מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי – הסכם מענק מס' 668863-SyBil-AA, ומענק NSF-IOS-1656830 במימון ממשלת ארה"ב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
| Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1.5mm, ID: 0.5 mm |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
| Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
| Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
| Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
| Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
| Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
| Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
| HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
| Human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
| ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
| KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
| Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
| Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60 mM in water |
| Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
| pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
| Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300 mM (dissolved in recording solution) |
| Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
| Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
| Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
| Zebralab | Viewpoint, France | N/A |
References
- Kabashi, E., Champagne, N., Brustein, E., Drapeau, P. In the swim of things: Recent insights to neurogenetic disorders from zebrafish. Trends in Genetics. 26 (8), 373-381 (2010).
- Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The Power of Zebrafish in personalised medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. , (2017).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. , (2005).
- Cunliffe, V. T. Building a zebrafish toolkit for investigating the pathobiology of epilepsy and identifying new treatments for epileptic seizures. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
- Griffin, A., Krasniak, C., Baraban, S. C. Advancing epilepsy treatment through personalized genetic zebrafish models. Progress in Brain Research. , (2016).
- Griffin, A., Hamling, K. R., Knupp, K., Hong, S. G., Lee, L. P., Baraban, S. C. Clemizole and modulators of serotonin signalling suppress seizures in Dravet syndrome. Brain. , (2017).
- Orellana-Paucar, A. M., et al. Insights from zebrafish and mouse models on the activity and safety of ar-turmerone as a potential drug candidate for the treatment of epilepsy. PLoS ONE. , (2013).
- Baxendale, S., et al. Identification of compounds with anti-convulsant properties in a zebrafish model of epileptic seizures. Disease Models & Mechanisms. , (2012).
- Bar-Peled, L., et al. A tumor suppressor complex with GAP activity for the Rag GTPases that signal amino acid sufficiency to mTORC1. Science. 340 (6136), 1100-1106 (2013).
- Ishida, S., et al. Mutations of DEPDC5 cause autosomal dominant focal epilepsies. Nature Genetics. , (2013).
- Dibbens, L. M., et al. Mutations in DEPDC5 cause familial focal epilepsy with variable foci. Nature Genetics. , (2013).
- Baulac, S., Weckhuysen, S. DEPDC5-Related Epilepsy. GeneReviews®. , (1993).
- Picard, F., et al. DEPDC5 mutations in families presenting as autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Neurology. , (2014).
- Teng, Y., et al. Knockdown of zebrafish lgi1a results in abnormal development, brain defects and a seizure-like behavioral phenotype. Human Molecular Genetics. , (2010).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. , (2013).
- Suls, A., et al. De novo loss-of-function mutations in CHD2 cause a fever-sensitive myoclonic epileptic encephalopathy sharing features with dravet syndrome. American Journal of Human Genetics. , (2013).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS ONE. , (2016).
- de Calbiac, H., et al. DEPDC5 knockdown causes mTOR-dependent motor hyperactivity in zebrafish. Annals of Clinical and Translational Neurology. , (2018).
- Panchaud, N., Péli-Gulli, M. P., De Virgilio, C. Amino acid deprivation inhibits TORC1 through a GTPase-activating protein complex for the Rag family GTPase Gtr1. Science Signaling. , (2013).
- Lim, K. R. Q., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Design, Development and Therapy. , (2017).
- Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. , (2015).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. , (2015).
- Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. , (2017).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics an official public. 203 (3), 253-310 (1995).
- Møller, R. S., Dahl, H. A., Helbig, I. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics. Expert Review of Molecular Diagnostics. , (2015).
- Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. , (2013).
- Dunn, P., et al. Next generation sequencing methods for diagnosis of epilepsy syndromes. Frontiers in Genetics. , (2018).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: Legacies and new directions. Nature Neuroscience. , (2015).
- Zhang, Y., et al. Pharmacological characterization of an antisense knockdown zebrafish model of Dravet syndrome: Inhibition of epileptic seizures by the serotonin agonist fenfluramine. PLoS ONE. , (2015).
- Swaminathan, A., et al. Non-canonical mTOR-Independent Role of DEPDC5 in Regulating GABAergic Network Development. Current Biology. , (2018).
- Samarut, É, et al. γ-Aminobutyric acid receptor alpha 1 subunit loss of function causes genetic generalized epilepsy by impairing inhibitory network neurodevelopment. Epilepsia. , 2061-2074 (2018).
- Turrini, L., et al. Optical mapping of neuronal activity during seizures in zebrafish. Scientific Reports. , (2017).
- Rosch, R. E., Hunter, P. R., Baldeweg, T., Friston, K. J., Meyer, M. P. Calcium imaging and dynamic causal modelling reveal brain-wide changes in effective connectivity and synaptic dynamics during epileptic seizures. PLoS Computational Biology. , (2018).
- Baraban, S. C. Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2013).
- Afrikanova, T., et al. Validation of the Zebrafish Pentylenetetrazol Seizure Model: Locomotor versus Electrographic Responses to Antiepileptic Drugs. PLoS ONE. , (2013).
