Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y la caracterización de un modelo de epilepsia de pez cebra resultante de la inhibición transitoria del gen DEPDC5.
Abstract
La epilepsia representa uno de los trastornos neurológicos más comunes, que afecta a unos 50 millones de personas en todo el mundo. Los avances recientes en la investigación genética han descubierto un amplio espectro de genes implicados en diversas formas de epilepsia, destacando la naturaleza heterogénea de este trastorno. Los modelos animales apropiados son esenciales para investigar los mecanismos patológicos desencadenados por mutaciones genéticas implicadas en la epilepsia y para desarrollar terapias especializadas y dirigidas. En los últimos años, el pez cebra se ha convertido en un organismo vertebrado valioso para modelar epilepsias, con el uso de la manipulación genética y la exposición a fármacos epileptogénicos conocidos, como el pentilentetrazol (PTZ), para identificar nuevas terapias antiepilépticas. Las mutaciones deletéreas en el regulador mTOR DEPDC5 se han asociado con diversas formas de epilepsias focales y el derribo del ortólogo del pez cebra causa hiperactividad asociada con episodios espontáneos similares a convulsiones, así como una mayor actividad electrográfica y una natación característica en la rueda giratoria. Aquí, describimos el método involucrado en la generación del modelo de pérdida de función DEPDC5 e ilustramos el protocolo para evaluar la actividad motora a las 28 y 48 h después de la fertilización (hpf), así como un método para registrar la actividad de campo en el tectum óptico del pez cebra. También se proporciona una ilustración del efecto del fármaco epileptogénico PTZ sobre la actividad neuronal a lo largo del tiempo.
Introduction
Debido a su pequeño tamaño, desarrollo ovíparo y transparencia en las primeras etapas de desarrollo, el pez cebra se ha convertido en un valioso organismo vertebrado para modelar enfermedades humanas tan diversas como trastornos cardiovasculares, cancerosos o neurológicos1,2. El pez cebra combina las ventajas de un vertebrado, incluida la alta conservación de la arquitectura de los órganos y el código genético, con el pequeño tamaño y la facilidad de manipulación genética de organismos modelo más simples, lo que facilita tanto los estudios fundamentales como las aplicaciones traslacionales. En particular, su capacidad para la detección automatizada de alto rendimiento del comportamiento y los marcadores fluorescentes de los procesos celulares ha hecho del pez cebra un modelo particularmente atractivo para la investigación de la epilepsia. Esto ha sido demostrado por un alto aumento en la última década del número de publicaciones con modelos químicos y/ogenéticos de epilepsia3,4, 5y, más recientemente, informes de terapias prometedoras obtenidas a partir de pantallas químicas en estos modelos 6,7,8.
DEPDC5 es miembro del complejo GATOR1, un regulador negativo de la señalización mTOR9. Las mutaciones en el gen DEPDC5 se descubrieron por primera vez en 2013 en probands que sufren de epilepsias focales autosómicas dominantes10,11, y desde entonces se han reportado en una serie de condiciones clínicas asociadas con manifestaciones epilépticas focales y displasia cortical focal12. Se predice que la gran mayoría de las mutaciones reportadas causan la pérdida de función del gen12,y esto se demostró formalmente para una serie de transcripciones mutadas de DEPDC5 que son el objetivo de la desintegración del ARNm mediada sin sentido12,13. De acuerdo, la eliminación del gen ortólogo en el pez cebra utilizando oligonucleótidos morfolinos antisentido (AMO) da como resultado una serie de características que son comunes a los modelos epilépticos en este organismo, incluida la hiperactividad, la natación en forma de rueda giratoria, las convulsiones espontáneas y la mejora de la actividad neuronal14,15,16,17,18. Curiosamente, el tratamiento con rapamicina, un inhibidor de la señalización mTOR, revirtió las características conductuales de este modelo18,apoyando la hipótesis de que la pérdida de función de DEPDC5 puede desencadenar epilepsia debido a una mala regulación de la vía mTOR9,19.
La eliminación transitoria de la expresión génica in vivo utilizando oligonucleótidos antisentido que transportan la modificación de morfolino ha sido una herramienta invaluable para estudiar el papel de genes específicos, a la par con las técnicas basadas en si/shRNA. Recientemente, las estrategias basadas en AMO también han encontrado aplicaciones clínicas, con una primera terapia AMO recibiendo la aprobación de la FDA para el tratamiento de la atrofia muscular de Duchenne en 201620. Si bien se informó que en el pez cebra el fenotipo de la eliminación aguda de genes basada en AMO no siempre se correlaciona con los modelos constitutivos de knock-out21,esto puede deberse al menos en algunos casos a mecanismos compensatorios engendrados por modificaciones genéticas constitutivas22. Sin embargo, la cuestión de la especificidad del fenotipo inducido por AMO es una preocupación indiscutible que debe abordarse diligentemente en los estudios que utilizan esta tecnología23. Para garantizar la especificidad del fenotipo de derribo basado en AMO, son necesarios varios controles clave. Estos incluyen una curva dosis-respuesta que permite la selección de la dosis más baja de AMO efectiva para la eliminación de genes, evitando la toxicidad general debido a la introducción de un exceso de material genético. También se requiere el uso de un AMO de desajuste que no se dirija a ninguna región particular del genoma para establecer una dosis adecuada y para identificar un fenotipo específico. Un segundo AMO que se dirige a una región diferente del mismo gen, como un AMO que bloquea el empalme, es necesario para confirmar que el fenotipo se debe a la caída del gen objetivo. El rescate del fenotipo de derribo con el ADNc del gen, ya sea el ortólogo humano o una versión modificada por codón del gen del pez cebra que no puede ser atacada por la AMO, proporciona un fuerte argumento a favor de la especificidad del fenotipo. La falta de rescate con el mismo ADNc que contiene mutaciones de pérdida de función (como la introducción de codones de parada temprana) es una prueba más en esta dirección.
Aquí, presentamos un método para generar un modelo de pérdida de función DEPDC5 de pez cebra y el protocolo para el fenotipado conductual a las 28 y 48 h después de la fertilización (hpf). A 28 hpf, la pérdida de función de DEPDC5 causa hiperactividad general, como lo demuestran los movimientos mejorados de enrollamiento y contracción de los embriones dentro del corion. En esta etapa se puede utilizar un sistema automatizado de detección de movimiento para cuantificar la actividad general por embrión. A 48 hpf, el pez cebra exhibe un escape estereotipado nadando en respuesta al tacto. En el pez cebra con expresión regulada a la baja de DEPDC5,la trayectoria de natación es significativamente más tortuosa que en los controles, los peces exhiben un patrón similar a "tornillo de corcho" o "rueda giratoria", similar a otros modelos de epilepsia reportados en este organismo3,4. Se obtuvieron registros electrofisiológicos en el tectum óptico en larvas de pez cebra entre 4-6 días después de la fecundación (dpf) y muestran un aumento basal de la actividad neuronal en los animales derribados DEPDC5. La ventaja de este modelo es que presenta varias características fenotípicas en diferentes puntos temporales, lo que puede ser útil para monitorear y evaluar la eficacia de las terapias farmacológicas durante el desarrollo.
Protocol
Los procedimientos experimentales fueron aprobados por los Comités Éticos Nacionales e Institucionales.
1. Derribo transitorio del gen DEPDC5 en embrión de pez cebra
- Preparación de herramientas:
- Prepare placas de Petri de inyección recubiertas de elastómero de silicio: Mezcle la base y el agente de curado del kit (consulte la Tabla de materiales)en una proporción de 10: 1. Llene una placa de Petri de 35 mm hasta la mitad con la mezcla. Espere a que el silicio se endurezca antes de usarlo (esto puede llevar varios días).
- Preparar soluciones de stock de 1,2 mmol/L de oligonucleótidos morfolino antisentido (AMO; ver Tabla de Materiales). Añadir 250 μL de agua estéril a 300 mmol liofilizados AMO para obtener una solución de 1,2 mmol/L. Para una disolución completa, caliente los viales durante 5 min a 65 °C. Vórtice brevemente. Selle la tapa del tubo con una película de plástico (consulte la Tabla de materiales).
- Para los experimentos de rescate de control, prepare un plásmido de expresión que contenga el ADNc humano de DEPDC5 (ver Tabla de Materiales)clonado en la columna vertebral de pCS2 o un plásmido de expresión similar compatible con el pez cebra. Como control negativo, se introdujo una mutación que causa un codón de parada temprana (p.Arg487*) en el ADNc.
- Preparar agua embrionaria: 0,06 g/L de sal de acuario (ver Tabla de Materiales)en agua de ósmosis inversa + 0,5 mg/L de azul de metileno.
- El día de la inyección, prepare agujas de vidrio de borosilicato de microinyección utilizando un puller (ver Tabla de Materiales). Establezca los ajustes de temperatura adecuados en el extracción de agujas. Use un capilar de vidrio de borosilicato de 10 cm de largo, 1/0.5 OD / ID mm para generar dos capilares de ~ 5 cm con puntas delgadas con una longitud de aproximadamente 1 cm.
- Si la punta de las agujas es muy fina, evitando la eyección de la solución, rompa el extremo de la punta cónica con pinzas bajo un microscopio.
- Justo antes de la inyección, prepare las soluciones de trabajo de las AMO. Siempre prepare una solución fresca para garantizar la reproducibilidad de los resultados. Calentar los viales de caldo AMO a 65 °C durante 5 min. Preparar una muestra de inyección de 5 μL que contenga colorante Fast Green (concentración final del 0,02%, ver Tabla de Materiales)y el AMO diluido a la concentración de trabajo en agua.
- Determinar empíricamente la concentración de trabajo de la AMO para cada gen utilizando una curva dosis-respuesta. La concentración de trabajo representa una concentración en la que el AMO es eficaz para derribar el gen sin causar toxicidad general, como defectos morfológicos graves. Típicamente, las concentraciones de trabajo AMO estarán en un rango de 0.2 mmol / L a 1 mmol / L (se determinó 0.4 mmol / L como la concentración efectiva para este estudio18). Inyecte el control Mismatch morpholino a la misma concentración que el AMO efectivo.
- Vórtice los tubos y centrífuga brevemente para llevar las gotas al fondo de los tubos.
- Para experimentos de rescate, preparar una muestra de inyección de 5 μL con el AMO diluido a la concentración de trabajo y el plásmido de expresión de ADNc diluido en agua a una concentración final que se determinará empíricamente. Para la expresión de DEPDC5 y el plásmido control negativo, 100 ng/μL fue eficaz para el rescate fenotípico.
- Preparación embrionaria:
- El día anterior a la microinyección, configure los tanques de apareamiento del pez cebra. La mañana de la inyección, retire los divisores para permitir el desove. Recoge los huevos en placas de Petri de 100 mm rellenas de agua embrionaria utilizando un tamiz fino. Inyecte dentro de los 20-30 minutos posteriores a la recolección, mientras los óvulos están en la etapa de una célula.
- Elija 60-80 huevos con una pipeta Pasteur de plástico y colóquelos en la placa de Petri recubierta de silicio para inyección. La superficie de silicio evitará que los huevos se deslicen durante las inyecciones. Retire la mayor parte del agua del embrión, dejando lo suficiente para cubrir los huevos hasta la mitad.
- Microinyecciones:
- Llene una aguja de vidrio con solución inyectable. Coloque la aguja verticalmente en uno de los tubos que contienen la solución inyectable, asegurándose de que el extremo inferior de la aguja esté tocando la solución. Espere varios minutos hasta que la solución de inyección de color se eleve por capilaridad y sea visible en la punta de la aguja.
- Monte la aguja llena en el mango de inyección del microinyector (ver Tabla de Materiales).
- Encienda el compresor de aire y ajuste la configuración de presión para generar un volumen de inyección de ~ 2 nL.
- Para calcular el volumen de la solución inyectada, coloque una gota de aceite mineral en un portaobjetos de microtomo. Inyecte la solución que contiene el colorante utilizando los parámetros de presión y tiempo establecidos. Mida el diámetro de la esfera de fluido inyectada y calcule el volumen total utilizando la fórmula Volumen = 4/3 * π * (d /2) 3, donde d = el diámetro medido del bolo inyectado.
- Usando un microscopio binocular de disección con un aumento de 4X, inyecte los óvulos en la etapa de una sola célula pasando a través del corion y la yema, y proyectando la solución directamente dentro de la célula.
- Recoger los embriones inyectados en una placa de Petri de 100 mm con agua embrionaria, etiquetar la placa e incubarlos a 28 °C.
- Asegúrese de que la temperatura de la incubadora sea estable en el tiempo, ya que la tasa de desarrollo de los embriones es termosensible. Por ejemplo, el crecimiento se aceleraría a temperaturas más altas y la etapa de desarrollo es crítica para evaluar adecuadamente el fenotipo24.
- Compruebe la calidad de los óvulos 6-8 h después de la inyección y retire los embriones muertos y no fertilizados utilizando una pipeta Pasteur de plástico.
- A la mañana siguiente, cuente y retire los embriones muertos en cada plato con una pipeta Pasteur de plástico.
2. Análisis de comportamiento
- Análisis de actividad global a 28 hpf:
- Realice la prueba la tarde del día después de la microinyección (28 hpf), asegurándose de que la hora del día en la que se realiza la prueba sea consistente con los experimentos para realizar análisis estadísticos válidos ya que el desarrollo de los embriones es muy rápido.
- Llene un plato de 35 mm (plato de prueba) con agua embrionaria y deje que se caliente en la incubadora (28 ° C) durante al menos 15 minutos antes de comenzar la prueba.
- Coloque una rejilla de malla de plástico (1.2x1.2 mm) cortada a medida, en la parte inferior del plato de prueba.
- Haga que otro experimentador aleatoriza el orden de las pruebas de los embriones y enmascare los nombres de las condiciones que se van a probar.
- Asegúrese de que la tasa de mortalidad no cambie entre las condiciones y en comparación con los embriones no inyectados para garantizar la especificidad del fenotipo. El porcentaje de embriones muertos en todas las condiciones no debe exceder del 10-13%18.
- Coloque 10-12 embriones aún dentro de su corion en la malla de plástico usando una pipeta Pasteur de plástico. Llene el plato de prueba con suficiente agua embrionaria para mantener los embriones sumergidos pero no flotando. Si es necesario, mueva los embriones con cuidado usando una punta de plástico para colocarlos en la rejilla.
- Usando una cámara de video (ver Tabla de Materiales)conectada a un microscopio de disección, registre la actividad espontánea de enrollamiento durante un período de tiempo definido (los videos de 10-20 minutos de duración suelen ser suficientes para obtener muestras representativas de ráfagas de actividad para la cuantificación)
- Devuelva los embriones a su respectivo plato y vuelva a colocarlos en la incubadora. Repita el experimento con tantos embriones como sea necesario para cada condición (según lo determinado por un análisis de potencia del 90%).
- Para analizar el movimiento espontáneo total, utilice un sistema ZebraLab (consulte la Tabla de materiales). Utilizando el módulo de cuantificación de actividades, cargue el video grabado y diseñe las arenas de seguimiento alrededor de cada embrión según corresponda. Establezca el umbral de congelación y ráfaga en 10 y 50, respectivamente.
- Ejecute el análisis de video automatizado, que cuantifica la actividad total dentro de cada una de las arenas definidas, luego recupere el conjunto de datos como una hoja de cálculo y realice el análisis utilizando un software de análisis de datos.
- Touch-Evoked-Escape-Response (TEER) a 48 hpf:
- Realice la prueba por la mañana dos días después de la inyección (48 h después de la fertilización).
- Al menos 2 h antes de la prueba, descoronar los embriones con fórceps finos. Asegúrese de que la hora del día para la deelección y la prueba de comportamiento sea consistente en los experimentos.
- Llene un plato de 130 mm (plato de prueba) con agua embrionaria y deje que se caliente en la incubadora (28 ° C) durante al menos 15 minutos antes de comenzar la prueba.
- Contar y eliminar larvas muertas y morfológicamente deformadas. Registre los números de cada condición.
- Haga que otro experimentador aleatoriza el orden y codifique los nombres de las condiciones que se van a probar.
- Monte la cámara (consulte la Tabla de materiales)sobre el plato de prueba asegurándose de que todo el plato de prueba esté dentro del campo de visión. Colocar una regla dentro del campo de visión proporciona una calibración interna para la distancia.
- Con una pipeta Pasteur de plástico, coloque un embrión en el centro del plato de prueba y comience la grabación utilizando una tasa de adquisición de 30 fps.
- Con una punta de plástico fina, toque ligeramente la cola del embrión con un movimiento de movimiento.
- Detenga la grabación cuando la larva haya terminado su movimiento.
- Retire el embrión del plato de prueba y colóquelo en un nuevo plato lleno de agua de embriones. Repita la prueba con tantos embriones como sea necesario para cada condición (según lo determinado por un análisis de potencia del 90%).
- Devuelva los embriones a su plato original y vuelva a colocarlos en la incubadora.
- Para analizar los parámetros del comportamiento de natación, cargue el video grabado en el software de análisis ImageJ. Descargue e instale el complemento de seguimiento manual de ImageJ (consulte la Tabla de materiales). Inicie el complemento eligiendo Herramientas | | de plugins Seguimiento manual en el menú.
- En la ventana de diálogo, introduzca la escala calibrada de la imagen. Incluir una regla en el campo de la cámara facilita la conversión de cm a píxeles.
- Seleccione Agregar pista e inicie el trazado de trayectoria haciendo clic en la imagen de la larva de pez cebra en el primer fotograma. Los fotogramas avanzan automáticamente con cada punto que se añade al seguimiento.
- Continúe rastreando el movimiento hasta el final del episodio de natación.
- Seleccione Finalizar pista en la ventana de seguimiento, recupere las coordenadas X-Y y calcule la distancia total, la velocidad y el ángulo de giro.
3. Análisis electrofisiológico
- Preparación de reactivos y herramientas:
- Preparar agarosa al 1% en agua embrionaria (ver sección 1.1.4). Alícuota la agarosa líquida en tubos de microcentrífuga y manténgalos en un bloque de calentamiento a 42 °C para evitar que la agarosa se endurezca.
- Preparar la solución de grabación (en mmol/L): NaCl 134, KCl 2.9, CaCl2 2.1, MgCl2 1.2, glucosa 10, HEPES 10, pH 7.8.
- Tire de las micropipetas de vidrio de borosilicato con una abertura de punta de 1.5-2 μm (5-6 Mm2·kg·s−3· A−2 resistencia) sin pulir.
- Preparación de larvas de pez cebra para electrofisiología:
- Coloque el pescado en una placa de Petri con fondo de vidrio (consulte la Tabla de materiales)y retire el exceso de medios extracelulares para asegurarse de que el pescado se acerque lo más posible al deslizamiento de la cubierta.
- Usando una pipeta Pasteur de plástico, agregue agarosa líquida tibia sobre y alrededor de la larva. Use suficiente agarosa para cubrir el pescado. Mientras la agarosa se endurece, use forrceps finos para orientar el pescado en una posición recta, ventral hacia abajo, en el centro del plato.
- Añadir 2 ml de la solución de grabación que contiene bromuro de pancuronio de 10 μM (ver Tabla de materiales)para bloquear la transmisión neuromuscular. La adición del paralista es necesaria para eliminar artefactos debido a pequeños movimientos durante las grabaciones.
- Registro electrofisiológico
- Llene la micropipeta con una solución de grabación.
- Con el amplificador de abrazadera de parche (consulte la Tabla de materiales)en configuración de abrazadera de voltaje, mida la resistencia del electrodo en el baño para confirmar su valor correcto.
- Usando un objetivo 20x, coloque la cabeza de la larva en el campo de visión central y baje la micropipeta para alcanzar la posición de grabación en el cerebro, dentro del tectum óptico.
- Cambie el amplificador de abrazadera de parche a la abrazadera de corriente y fije la corriente de retención a 0 mA.
- Utilizando un filtro de paso bajo de 1 kHz, una tasa de adquisición de 1 kHz y una ganancia digital de 10, registre la actividad espontánea durante 60 minutos para determinar los niveles de actividad basales.
- Después de 1 h de registro basal, agregue 200 μL de pentilentetrazol (PTZ, ver Tabla de Materiales)solución de 300 mmol/L al baño para una concentración final de 20 mmol/L PTZ.
- Registre la actividad neuronal en PTZ durante otros 120 min.
- Determinación de eventos de despolarización
- Los eventos de registro de campo tienen una dinámica muy lenta (las frecuencias de interés están en el rango de 0.005-0.2 s-1). Por lo tanto, filtre la señal con un paso bajo (Butterworth 5th order LPF a 100 s-1) para evitar el aliasing. Submuestrea los datos de voltaje registrados desde la velocidad de fotogramas de adquisición (en este caso, 1 ks-1) hasta 250 s-1 (SEÑAL RAW).
- Para identificar las marcas de tiempo para cada evento de despolarización, utilice una SEÑAL DE DETECCIÓN, que es una versión filtrada de paso alto de la señal grabada (Butterworth 1st order HPF at 0.01 s-1).
- Al eliminar los componentes de baja frecuencia, la detección de eventos de despolarización se puede realizar utilizando un método de umbral simple. Utilice un umbral fijo para la eliminación de ruido y la detección de eventos (se utilizaron 0,3 mV para este estudio).
- Caracterizar el evento de despolarización mediante una serie de cruces de umbrales que se producen en intervalos de tiempo inferiores a 4 s. Calcule el inicio y el final del evento de despolarización según lo determinado a partir de secuencias consecutivas de cruces de umbral. Los eventos que son más cortos que 40 ms se pueden descartar como ruido.
- Calcular la amplitud de los eventos en el no filtrado (RAW SIGNAL) para eliminar errores debidos al efecto del filtrado de paso bajo en el pico del evento. Seleccione la wavelet de despolarización de la señal sin procesar utilizando las marcas de tiempo determinadas en la señal filtrada. Mida la amplitud como la diferencia entre los valores máximo y mínimo de la wavelet seleccionada de la señal sin procesar.
NOTA: Los archivos de script para realizar el paso 3.4 (Determinación de eventos de despolarización) y para obtener la Figura 1 se proporcionan como Archivo complementario adjunto a este artículo.
Representative Results
La Figura 1 muestra trazas de voltaje representativas de registros de campo extracelular de larvas de pez cebra de 4-6 dpf en el caso de dos condiciones genéticas: control de desajuste y derribo de DEPDC5. En el período de referencia de la grabación, el derribo de DEPDC5 muestra una mayor ocurrencia de eventos espontáneos, mientras que el control Desajuste muestra muy pocas fluctuaciones. Estos patrones de actividad son representativos del aumento significativo de la actividad neuronal debido a la pérdida de función de DEPDC5,como hemos informado previamente18. Después de la aplicación de PTZ, tanto el control de desajuste como el derribo de DEPDC5 muestran un mayor número de eventos de despolarización. Durante el primer período después de la aplicación de PTZ (10 – 60 min), se observa una tasa de 0,8 eventos por minuto tanto en el control de desajuste como en el derribo de DEPDC5, donde la mayoría de los eventos son de alta amplitud (>1 mV). Durante este último período de respuesta (60 – 120 min después de la aplicación de PTZ), la tasa de eventos de despolarización aumenta a alrededor de 1 evento por minuto, y la mayoría de los eventos son de baja amplitud (≤1 mV).
Figura 1:Ejemplos de rastros de registros de campo en el cerebro de larvas de pez cebra. (A) Descripción general de la grabación de 180 minutos para una larva de control de desajuste y un derribo DEPDC5. Primero, se registró la actividad basal espontánea, luego se aplicó PTZ en baño (barra roja). (B) Histogramas de tiempo de periestímulo de los eventos de despolarización para el control de desajuste y el derribo de DEPDC5. Los eventos se clasificaron en alta amplitud (>1 mV - azul) y baja amplitud (≤1 mV - negro). (C-E) Ejemplos de trazas de los diferentes períodos del registro: (C) actividad espontánea, (D) Eventos de alta amplitud durante el primer período después de la aplicación de PTZ, (E) Eventos de baja amplitud durante el último período después de la aplicación de PTZ. Tenga en cuenta que los archivos de script para obtener estas cifras se proporcionan como Archivo suplementario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo suplementario: Archivos de script para el paso 3.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La epilepsia es una enfermedad neurológica compleja, con una amplia gama de etiologías que están empezando a dilucidarse con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación genética25,26,27. Los modelos animales versátiles son esenciales para una estrategia traslacional eficiente que proporcionará información sobre los mecanismos patológicos de las epilepsias genéticamente vinculadas, así como terapias dirigidas para las distintas formas de esta afección. Los modelos de pez cebra han sido muy efectivos para reproducir las principales características de la epilepsia y proporcionar lecturas confiables para la detección de fármacos antiepilépticos5,28. Las convulsiones espontáneas se pueden detectar en peces cebra modificados genéticamente15,29,30,31 y el análisis neurofisiológico en estos modelos28 ha confirmado la base neuronal del comportamiento epiléptico32,33. Las larvas de pez cebra de tamaño pequeño son susceptibles de pantallas químicas en formato de 96 pozos utilizando la detección automatizada de comportamiento simple, como la natación espontánea, lo que permite la detección rápida de posibles terapias.
El modelo de derribo DEPDC5 presentado aquí se obtiene mediante la inyección de AMO en el embrión de pez cebra para bloquear la expresión génica durante el desarrollo. Este modelo presenta varias características fenotípicas clave durante diferentes puntos de tiempo del desarrollo larvario, que pueden usarse como indicadores de la eficiencia de la terapia durante un protocolo de detección química o genética. El derribo de genes mediado por AMO es una técnica poderosa, que muestra ventajas sobre los modelos de convulsiones inducidas químicamente, ya que se dirige específicamente a la expresión de un gen de interés, lo que permite la identificación de los mecanismos patógenos subyacentes desencadenados por una mutación genética. Los inductores químicos, que sin embargo son herramientas potentes para la detección de drogas, pueden actuar a través de múltiples vías celulares que podrían no ser siempre relevantes para la mutación genética en estudio. Si bien la inyección de AMO es en sí misma una técnica simple cuando es dominada por el experimentador, también presenta una serie de limitaciones. Las inyecciones deben realizarse en el embrión en etapa de una célula; en nuestras manos, las inyecciones en etapas posteriores aumentaron en gran medida la variabilidad del fenotipo. Esto limita el tiempo disponible para la inyección; por lo tanto, una estrategia de generación de óvulos para inyección en una secuencia de tiempo es útil. Utilizamos rutinariamente 4-5 cruces que abrimos a intervalos de 15-20 min, permitiendo la inyección de un embrague antes de obtener el siguiente. Además, se debe tener cuidado de evaluar el fenotipo al mismo tiempo en puntos entre diferentes experimentos, ya que los comportamientos estereotipados evolucionan rápidamente durante los primeros días de desarrollo. El volumen y la concentración de AMO también deben controlarse cuidadosamente, ya que la toxicidad general debida a la inyección de cantidades excesivas enmascarará el fenotipo específico. Los diferentes controles presentados en la introducción son esenciales para determinar la dosis correcta de inyección y el fenotipo correspondiente.
Los registros de campo del cerebro larvario del pez cebra son una herramienta útil para investigar los efectos nocivos de las mutaciones genéticas implicadas en diferentes trastornos cerebrales sobre la actividad neuronal global34. Los eventos de despolarización observados bajo estas condiciones experimentales son un método establecido para evaluar los efectos electrofisiológicos de los fármacos en diferentes condiciones epilépticas15,35. Sin embargo, la evaluación de estos efectos se ha realizado principalmente cualitativamente en lugar de cuantitativamente, y teniendo un observador subjetivo como actor en el análisis. Aquí, desarrollamos una estrategia de detección automática que puede cuantificar objetivamente la tasa de despolarizaciones, su amplitud y duración, y puede evaluar el progreso de estos parámetros a lo largo del tiempo, o con diferentes intervenciones genéticas o farmacológicas.
Los resultados representativos presentados aquí muestran la actividad de campo esperada del modelo genético de derribo DEPDC5 en comparación con un control de desajuste en pez cebra de 4-6 dpf, antes y después de la aplicación de PTZ para introducir actividad electrográfica epileptiforme. Anteriormente, hemos mostrado un aumento significativo en la actividad basal de la condición de derribo DEPDC5 18. Aquí, mostramos que la respuesta de estas dos condiciones a PTZ, un inductor químico de actividad epilepiforme, tiene una trayectoria similar en el tiempo, comenzando con un período de eventos de despolarización de frecuencia relativamente baja y alta amplitud y continuando con un período de eventos de despolarización de mayor frecuencia y menor amplitud. Los eventos de registro de campo tienen una dinámica lenta (las frecuencias de interés están en el rango de 0.005-0.2 s-1),por lo tanto, tanto los filtros de paso bajo como los de paso alto se utilizan en este protocolo para aislar los eventos de interés. Después de eliminar el ruido de baja frecuencia, la detección de eventos de despolarización se realiza utilizando un umbral simple. Dado que las estadísticas de la señal se ven muy afectadas por la presencia de eventos de despolarización, no pudimos utilizar la desviación estándar de la señal total para determinar este umbral. La variabilidad del valor de la desviación estándar entre los conjuntos de datos fue mayor que los niveles de ruido de registro observados. Por lo tanto, después de la inspección visual de las trazas, utilizamos un valor fijo del umbral de 0,3 mV, con el fin de evitar el sesgo inducido por diferentes niveles de actividad de despolarización.
El protocolo descrito proporciona un método estandarizado y simple para evaluar el comportamiento motor y la actividad del campo neuronal, a través del registro de voltaje de la abrazadera de corriente extracelular junto con la detección automática de eventos de despolarización en el tectum óptico, para caracterizar fenotipos epilepetiformes en modelos de pez cebra.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al personal de la plataforma de electrofisiología ICM donde se realizaron los experimentos de neurofisiología. También agradecemos a Anca Marian por su ayuda técnica. SC fue apoyado por la Subvención de Trampolín #21488. EK fue apoyado por la Subvención AFM # 18469 y la Beca ERC Consolidator (ALS-Networks). HC fue apoyado por los premios de doctorado de la Fondation pour la Recherche Médicale (PLP20141031462) y ARSLA. Para AD y RM, este trabajo fue apoyado por tres subvenciones de la Autoridad Nacional Rumana para la Investigación Científica y la Innovación, CNCS-UEFISCDI (números de proyecto PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007 y COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), una subvención del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea – acuerdo de subvención n.º 668863-SyBil-AA, y una subvención de la Fundación Nacional de ciencias NSF-IOS-1656830 financiada por el Gobierno de los Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
| Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1.5mm, ID: 0.5 mm |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
| Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
| Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
| Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
| Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
| Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
| Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
| HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
| Human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
| ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
| KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
| Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
| Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60 mM in water |
| Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
| pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
| Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300 mM (dissolved in recording solution) |
| Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
| Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
| Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
| Zebralab | Viewpoint, France | N/A |
References
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