Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y la caracterización de un modelo de epilepsia de pez cebra resultante de la inhibición transitoria del gen DEPDC5.
La epilepsia representa uno de los trastornos neurológicos más comunes, que afecta a unos 50 millones de personas en todo el mundo. Los avances recientes en la investigación genética han descubierto un amplio espectro de genes implicados en diversas formas de epilepsia, destacando la naturaleza heterogénea de este trastorno. Los modelos animales apropiados son esenciales para investigar los mecanismos patológicos desencadenados por mutaciones genéticas implicadas en la epilepsia y para desarrollar terapias especializadas y dirigidas. En los últimos años, el pez cebra se ha convertido en un organismo vertebrado valioso para modelar epilepsias, con el uso de la manipulación genética y la exposición a fármacos epileptogénicos conocidos, como el pentilentetrazol (PTZ), para identificar nuevas terapias antiepilépticas. Las mutaciones deletéreas en el regulador mTOR DEPDC5 se han asociado con diversas formas de epilepsias focales y el derribo del ortólogo del pez cebra causa hiperactividad asociada con episodios espontáneos similares a convulsiones, así como una mayor actividad electrográfica y una natación característica en la rueda giratoria. Aquí, describimos el método involucrado en la generación del modelo de pérdida de función DEPDC5 e ilustramos el protocolo para evaluar la actividad motora a las 28 y 48 h después de la fertilización (hpf), así como un método para registrar la actividad de campo en el tectum óptico del pez cebra. También se proporciona una ilustración del efecto del fármaco epileptogénico PTZ sobre la actividad neuronal a lo largo del tiempo.
Debido a su pequeño tamaño, desarrollo ovíparo y transparencia en las primeras etapas de desarrollo, el pez cebra se ha convertido en un valioso organismo vertebrado para modelar enfermedades humanas tan diversas como trastornos cardiovasculares, cancerosos o neurológicos1,2. El pez cebra combina las ventajas de un vertebrado, incluida la alta conservación de la arquitectura de los órganos y el código genético, con el pequeño tamaño y la facilidad de manipulación genética de organismos modelo más simples, lo que facilita tanto los estudios fundamentales como las aplicaciones traslacionales. En particular, su capacidad para la detección automatizada de alto rendimiento del comportamiento y los marcadores fluorescentes de los procesos celulares ha hecho del pez cebra un modelo particularmente atractivo para la investigación de la epilepsia. Esto ha sido demostrado por un alto aumento en la última década del número de publicaciones con modelos químicos y/ogenéticos de epilepsia3,4, 5y, más recientemente, informes de terapias prometedoras obtenidas a partir de pantallas químicas en estos modelos 6,7,8.
DEPDC5 es miembro del complejo GATOR1, un regulador negativo de la señalización mTOR9. Las mutaciones en el gen DEPDC5 se descubrieron por primera vez en 2013 en probands que sufren de epilepsias focales autosómicas dominantes10,11, y desde entonces se han reportado en una serie de condiciones clínicas asociadas con manifestaciones epilépticas focales y displasia cortical focal12. Se predice que la gran mayoría de las mutaciones reportadas causan la pérdida de función del gen12,y esto se demostró formalmente para una serie de transcripciones mutadas de DEPDC5 que son el objetivo de la desintegración del ARNm mediada sin sentido12,13. De acuerdo, la eliminación del gen ortólogo en el pez cebra utilizando oligonucleótidos morfolinos antisentido (AMO) da como resultado una serie de características que son comunes a los modelos epilépticos en este organismo, incluida la hiperactividad, la natación en forma de rueda giratoria, las convulsiones espontáneas y la mejora de la actividad neuronal14,15,16,17,18. Curiosamente, el tratamiento con rapamicina, un inhibidor de la señalización mTOR, revirtió las características conductuales de este modelo18,apoyando la hipótesis de que la pérdida de función de DEPDC5 puede desencadenar epilepsia debido a una mala regulación de la vía mTOR9,19.
La eliminación transitoria de la expresión génica in vivo utilizando oligonucleótidos antisentido que transportan la modificación de morfolino ha sido una herramienta invaluable para estudiar el papel de genes específicos, a la par con las técnicas basadas en si/shRNA. Recientemente, las estrategias basadas en AMO también han encontrado aplicaciones clínicas, con una primera terapia AMO recibiendo la aprobación de la FDA para el tratamiento de la atrofia muscular de Duchenne en 201620. Si bien se informó que en el pez cebra el fenotipo de la eliminación aguda de genes basada en AMO no siempre se correlaciona con los modelos constitutivos de knock-out21,esto puede deberse al menos en algunos casos a mecanismos compensatorios engendrados por modificaciones genéticas constitutivas22. Sin embargo, la cuestión de la especificidad del fenotipo inducido por AMO es una preocupación indiscutible que debe abordarse diligentemente en los estudios que utilizan esta tecnología23. Para garantizar la especificidad del fenotipo de derribo basado en AMO, son necesarios varios controles clave. Estos incluyen una curva dosis-respuesta que permite la selección de la dosis más baja de AMO efectiva para la eliminación de genes, evitando la toxicidad general debido a la introducción de un exceso de material genético. También se requiere el uso de un AMO de desajuste que no se dirija a ninguna región particular del genoma para establecer una dosis adecuada y para identificar un fenotipo específico. Un segundo AMO que se dirige a una región diferente del mismo gen, como un AMO que bloquea el empalme, es necesario para confirmar que el fenotipo se debe a la caída del gen objetivo. El rescate del fenotipo de derribo con el ADNc del gen, ya sea el ortólogo humano o una versión modificada por codón del gen del pez cebra que no puede ser atacada por la AMO, proporciona un fuerte argumento a favor de la especificidad del fenotipo. La falta de rescate con el mismo ADNc que contiene mutaciones de pérdida de función (como la introducción de codones de parada temprana) es una prueba más en esta dirección.
Aquí, presentamos un método para generar un modelo de pérdida de función DEPDC5 de pez cebra y el protocolo para el fenotipado conductual a las 28 y 48 h después de la fertilización (hpf). A 28 hpf, la pérdida de función de DEPDC5 causa hiperactividad general, como lo demuestran los movimientos mejorados de enrollamiento y contracción de los embriones dentro del corion. En esta etapa se puede utilizar un sistema automatizado de detección de movimiento para cuantificar la actividad general por embrión. A 48 hpf, el pez cebra exhibe un escape estereotipado nadando en respuesta al tacto. En el pez cebra con expresión regulada a la baja de DEPDC5,la trayectoria de natación es significativamente más tortuosa que en los controles, los peces exhiben un patrón similar a “tornillo de corcho” o “rueda giratoria”, similar a otros modelos de epilepsia reportados en este organismo3,4. Se obtuvieron registros electrofisiológicos en el tectum óptico en larvas de pez cebra entre 4-6 días después de la fecundación (dpf) y muestran un aumento basal de la actividad neuronal en los animales derribados DEPDC5. La ventaja de este modelo es que presenta varias características fenotípicas en diferentes puntos temporales, lo que puede ser útil para monitorear y evaluar la eficacia de las terapias farmacológicas durante el desarrollo.
La epilepsia es una enfermedad neurológica compleja, con una amplia gama de etiologías que están empezando a dilucidarse con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación genética25,26,27. Los modelos animales versátiles son esenciales para una estrategia traslacional eficiente que proporcionará información sobre los mecanismos patológicos de las epilepsias genéticamente vinculadas, así como terapias dirigidas para las distintas formas de esta afección. Los modelos de pez cebra han sido muy efectivos para reproducir las principales características de la epilepsia y proporcionar lecturas confiables para la detección de fármacos antiepilépticos5,28. Las convulsiones espontáneas se pueden detectar en peces cebra modificados genéticamente15,29,30,31 y el análisis neurofisiológico en estos modelos28 ha confirmado la base neuronal del comportamiento epiléptico32,33. Las larvas de pez cebra de tamaño pequeño son susceptibles de pantallas químicas en formato de 96 pozos utilizando la detección automatizada de comportamiento simple, como la natación espontánea, lo que permite la detección rápida de posibles terapias.
El modelo de derribo DEPDC5 presentado aquí se obtiene mediante la inyección de AMO en el embrión de pez cebra para bloquear la expresión génica durante el desarrollo. Este modelo presenta varias características fenotípicas clave durante diferentes puntos de tiempo del desarrollo larvario, que pueden usarse como indicadores de la eficiencia de la terapia durante un protocolo de detección química o genética. El derribo de genes mediado por AMO es una técnica poderosa, que muestra ventajas sobre los modelos de convulsiones inducidas químicamente, ya que se dirige específicamente a la expresión de un gen de interés, lo que permite la identificación de los mecanismos patógenos subyacentes desencadenados por una mutación genética. Los inductores químicos, que sin embargo son herramientas potentes para la detección de drogas, pueden actuar a través de múltiples vías celulares que podrían no ser siempre relevantes para la mutación genética en estudio. Si bien la inyección de AMO es en sí misma una técnica simple cuando es dominada por el experimentador, también presenta una serie de limitaciones. Las inyecciones deben realizarse en el embrión en etapa de una célula; en nuestras manos, las inyecciones en etapas posteriores aumentaron en gran medida la variabilidad del fenotipo. Esto limita el tiempo disponible para la inyección; por lo tanto, una estrategia de generación de óvulos para inyección en una secuencia de tiempo es útil. Utilizamos rutinariamente 4-5 cruces que abrimos a intervalos de 15-20 min, permitiendo la inyección de un embrague antes de obtener el siguiente. Además, se debe tener cuidado de evaluar el fenotipo al mismo tiempo en puntos entre diferentes experimentos, ya que los comportamientos estereotipados evolucionan rápidamente durante los primeros días de desarrollo. El volumen y la concentración de AMO también deben controlarse cuidadosamente, ya que la toxicidad general debida a la inyección de cantidades excesivas enmascarará el fenotipo específico. Los diferentes controles presentados en la introducción son esenciales para determinar la dosis correcta de inyección y el fenotipo correspondiente.
Los registros de campo del cerebro larvario del pez cebra son una herramienta útil para investigar los efectos nocivos de las mutaciones genéticas implicadas en diferentes trastornos cerebrales sobre la actividad neuronal global34. Los eventos de despolarización observados bajo estas condiciones experimentales son un método establecido para evaluar los efectos electrofisiológicos de los fármacos en diferentes condiciones epilépticas15,35. Sin embargo, la evaluación de estos efectos se ha realizado principalmente cualitativamente en lugar de cuantitativamente, y teniendo un observador subjetivo como actor en el análisis. Aquí, desarrollamos una estrategia de detección automática que puede cuantificar objetivamente la tasa de despolarizaciones, su amplitud y duración, y puede evaluar el progreso de estos parámetros a lo largo del tiempo, o con diferentes intervenciones genéticas o farmacológicas.
Los resultados representativos presentados aquí muestran la actividad de campo esperada del modelo genético de derribo DEPDC5 en comparación con un control de desajuste en pez cebra de 4-6 dpf, antes y después de la aplicación de PTZ para introducir actividad electrográfica epileptiforme. Anteriormente, hemos mostrado un aumento significativo en la actividad basal de la condición de derribo DEPDC5 18. Aquí, mostramos que la respuesta de estas dos condiciones a PTZ, un inductor químico de actividad epilepiforme, tiene una trayectoria similar en el tiempo, comenzando con un período de eventos de despolarización de frecuencia relativamente baja y alta amplitud y continuando con un período de eventos de despolarización de mayor frecuencia y menor amplitud. Los eventos de registro de campo tienen una dinámica lenta (las frecuencias de interés están en el rango de 0.005-0.2 s-1),por lo tanto, tanto los filtros de paso bajo como los de paso alto se utilizan en este protocolo para aislar los eventos de interés. Después de eliminar el ruido de baja frecuencia, la detección de eventos de despolarización se realiza utilizando un umbral simple. Dado que las estadísticas de la señal se ven muy afectadas por la presencia de eventos de despolarización, no pudimos utilizar la desviación estándar de la señal total para determinar este umbral. La variabilidad del valor de la desviación estándar entre los conjuntos de datos fue mayor que los niveles de ruido de registro observados. Por lo tanto, después de la inspección visual de las trazas, utilizamos un valor fijo del umbral de 0,3 mV, con el fin de evitar el sesgo inducido por diferentes niveles de actividad de despolarización.
El protocolo descrito proporciona un método estandarizado y simple para evaluar el comportamiento motor y la actividad del campo neuronal, a través del registro de voltaje de la abrazadera de corriente extracelular junto con la detección automática de eventos de despolarización en el tectum óptico, para caracterizar fenotipos epilepetiformes en modelos de pez cebra.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer al personal de la plataforma de electrofisiología ICM donde se realizaron los experimentos de neurofisiología. También agradecemos a Anca Marian por su ayuda técnica. SC fue apoyado por la Subvención de Trampolín #21488. EK fue apoyado por la Subvención AFM # 18469 y la Beca ERC Consolidator (ALS-Networks). HC fue apoyado por los premios de doctorado de la Fondation pour la Recherche Médicale (PLP20141031462) y ARSLA. Para AD y RM, este trabajo fue apoyado por tres subvenciones de la Autoridad Nacional Rumana para la Investigación Científica y la Innovación, CNCS-UEFISCDI (números de proyecto PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007 y COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), una subvención del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea – acuerdo de subvención n.º 668863-SyBil-AA, y una subvención de la Fundación Nacional de ciencias NSF-IOS-1656830 financiada por el Gobierno de los Estados Unidos.
Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60mM in water |
Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution) |
Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
Zebralab | Viewpoint, France | N/A |