Summary
Här presenterar vi ett protokoll för utveckling och karakterisering av en zebrafiskmodell av epilepsi som härrör från den övergående hämningen av DEPDC5-genen.
Abstract
Epilepsi representerar en av de vanligaste neurologiska störningarna, som påverkar uppskattningsvis 50 miljoner människor över hela världen. De senaste framstegen inom genetisk forskning har avslöjat ett stort spektrum av gener som är inblandade i olika former av epilepsi, vilket belyser den heterogena karaktären hos denna sjukdom. Lämpliga djurmodeller är nödvändiga för att undersöka de patologiska mekanismer som utlöses av genetiska mutationer som är inblandade i epilepsi och för att utveckla specialiserade, riktade terapier. Under de senaste åren har zebrafisk dykt upp som en värdefull ryggradsdjursorganism för modellering av epilepsier, med användning av både genetisk manipulation och exponering för kända epileptogena läkemedel, såsom pentylenetetrazole (PTZ), för att identifiera nya antiepileptiska terapier. Skadliga mutationer i mTOR regulator DEPDC5 har associerats med olika former av focal epilepsier och knock-down av zebrafish orthologue orsakar hyperaktivitet är associerad med spontana beslag-liknande episoder, samt förbättrad elektrografiska verksamhet och karakteristiska svänghjul simning. Här beskrev vi metoden som är involverad i att generera MODELLEN FÖR förlust av funktionsförlust för DEPDC5 och illustrera protokollet för bedömning av motorisk aktivitet vid 28 och 48 h efter befruktning (hpf), samt en metod för registrering av fältaktivitet i zebrafiskoptiska tectum. En illustration av effekten av epileptogenic drogen PTZ på neuronal aktivitet över tiden tillhandahålls också.
Introduction
På grund av sin lilla storlek, oviparösa utveckling och öppenhet i tidiga utvecklingsstadier har zebrafisk dykt upp som en värdefull ryggradsdjursorganism för modellering av mänskliga sjukdomar så olika som hjärt-, cancer- eller neurologiskasjukdomar 1,2. Zebrafisk kombinerar fördelarna med ett ryggradsdjur, inklusive det höga bevarandet av organarkitektur och genetisk kod, med den lilla storleken och lättheten i genetisk manipulering av enklare modellorganismer, vilket underlättar både grundläggande studier och translationella tillämpningar. I synnerhet har dess mottaglighet för automatiserad screening av beteende och fluorescerande markörer för cellulära processer gjort zebrafisk till en särskilt attraktiv modell för epilepsiforskning. Detta har visats av en hög ökning under det senaste decenniet av antalet publikationer med kemiskt inducerade och/ eller genetiska modeller avepilepsi 3,4,5 och, mer nyligen, rapporter om lovande terapier som erhållits från kemiska skärmar i dessa modeller6,7,8.
DEPDC5 är medlem i GATOR1-komplexet, en negativ regulator av mTOR-signalering9. Mutationer i depdc5 genen har först upptäckts 2013 i probands lider av autosomala dominerande focal epilepsier10,11, och har sedan rapporterats i ett antal kliniska villkor i samband med focal epipileptiska manifestationer och focal när dysplasi12. Den stora majoriteten av rapporterade mutationer förutspås orsaka förlust av funktion avgenen 12, och detta visades formellt för ett antal DEPDC5 muterade transkriptioner som är riktade mot nonsens medierad mRNA-förfall12,13. I samförstånd resulterar knock-down av genortroologen i zebrafisk med hjälp av antisense morpholino oligonucleotides (AMOs) i ett antal funktioner som är gemensamma för epileptiska modeller i denna organism, inklusive hyperaktivitet, vridhjulsliknande simning, spontana anfall och förbättrad neuronal aktivitet14,15,16,17,18. Intressant nog vände behandling med rapamycin, en hämmare av mTOR-signalering, beteendeegenskaperna i denna modell18, vilket stöder hypotesen att DEPDC5-funktionsförlust kan utlösa epilepsi på grund av en felreglering av mTOR-vägen9,19.
Övergående knock-down av genuttryck in vivo med antisense oligonucleotides som bär morpholino modifiering har varit ett ovärderligt verktyg för att studera rollen av specifika gener, i nivå med si/shRNA-baserade tekniker. Nyligen har AMO-baserade strategier också hittat kliniska applikationer, med en första AMO-behandling som får FDA-godkännande för behandling av Duchennes muskelatrofi 201620. Medan det rapporterades att fenotypen av akut AMO-baserad genknackning hos zebrafisk inte alltid korrelerar med de konstituerandeknockoutmodellerna 21, kan detta åtminstone i vissa fall bero på kompensatoriska mekanismer som framkallas av konstituerande genetiska modifieringar22. Frågan om specificitet hos den AMO-inducerade fenotypen är dock ett obestridligt problem som måste behandlas flitigt i studier med denna teknik23. För att säkerställa specificiteten hos den AMO-baserade knock-down fenotypen krävs flera nyckelkontroller. Dessa inkluderar en dos-responskurva som gör det möjligt att välja den lägsta dosen av AMO effektiv för gen knock-down, undvika övergripande toxicitet på grund av införandet av ett överskott av genetiskt material. Användning av en Mismatch AMO som inte riktar sig till någon viss region i genomet krävs också för att fastställa en lämplig dos och för att identifiera en specifik fenotyp. En andra AMO som riktar sig mot en annan region av samma gen, såsom en skarvblockerande AMO, är nödvändig för att bekräfta att fenotypen beror på att målgenen slås ner. Räddning av knock-down fenotyp med cDNA av genen, antingen den mänskliga ortoologen eller en kodon-modifierad version av zebrafish genen som inte kan riktas av AMO, ger ett starkt argument till förmån för fenotyp specificitet. Brist på räddning med samma cDNA som innehåller förlust av funktion mutationer (såsom införandet av ett tidigt stopp kodoner) är ytterligare ett bevis i denna riktning.
Här presenterar vi en metod för att generera en zebrafisk DEPDC5 funktionsförlustmodell och protokollet för beteendemässig fenotypning vid 28 och 48 h efter befruktning (hpf). Vid 28 hpf orsakar DEPDC5 funktionsförlust övergripande hyperaktivitet, vilket framgår av förbättrad spolening och ryckande rörelser hos embryona inom koringen. Ett automatiserat rörelsedetekteringssystem kan användas i detta skede för att kvantifiera den totala aktiviteten per embryo. Vid 48 hkf uppvisar zebrafisk stereotyp flykt simning som svar på beröring. Hos zebrafisk med nedreglerat uttryck av DEPDC5är simbanan betydligt mer vridande än i kontroller, fisken uppvisar en "korkskruv" eller "vändhjul" som mönster, liknande andra rapporterade epilepsimodeller i denna organism3,4. Elektrofysiologiska inspelningar erhölls i optik tectum i zebrafisk larver mellan 4-6 dagar post befruktning (dpf) och visa en baslinje ökning av neuronal aktivitet i DEPDC5 knock-down djur. Fördelen med denna modell är att den presenterar flera fenotypiska funktioner vid olika tidpunkter, vilket kan vara användbart för att övervaka och bedöma effekten av läkemedelsbehandlingar under utveckling.
Protocol
Experimentella förfaranden godkändes av de nationella och institutionella etiska kommittéerna.
1. Övergående knock-down av DEPDC5-genen i zebrafiskembryon
- Förberedelse av verktyg:
- Bered silikon elastomerbelagd injektion Petri disk: Blanda satsens bas- och härdningsmedel (se Materialförteckningen)i ett förhållande på 10:1. Fyll en 35 mm Petri skål halvvägs med blandningen. Vänta tills kiselet härdas innan du använder det (det kan ta flera dagar).
- Bered 1,2 mmol/L stamlösningar av antisense morpholino oligonukleotider (AMO; se Materialförteckning ). Tillsätt 250 μL sterilt vatten till 300 nmole lyofiliserad AMO för att få en 1,2 mmol/L stamlösning. För fullständig upplösning, värm injektionsflaskan i 5 minuter vid 65 °C. Vortex kort. Täta rörlocket med en plastfilm (se Materialförteckning ).
- För kontrollräddningsexperimenten, förbered ett uttryck plasmid som innehåller den mänskliga cDNA av DEPDC5 (se Materialförteckning)klonad i ryggraden pCS2 eller ett liknande zebrafiskkompatibelt uttryck plasmid. Som en negativ kontroll introducerades en mutation som orsakar ett tidigt stopp kodon (p.Arg487*) i cDNA.
- Förbered embryovatten: 0,06 g/L akvariesalt (se Materialförteckning)i omvänd osmosvatten + 0,5 mg/L metylenblått.
- Injektionsdagen, förbered mikroinjektionsborrosilikatglasnålar med hjälp av en puller (se Materialförteckning). Upprätta lämpliga temperaturinställningar på nåldragaren. Använd en 10 cm lång, 1/0,5 OD/ID mm borosilikatglas kapillär för att generera två ~5 cm kapillärer med tunna spetsar med en längd av ca 1 cm.
- Om nålarnas spets är mycket fin, förhindra utmatning av lösningen, bryt själva änden av den avsmalnande spetsen med tång under ett mikroskop.
- Strax före injektionen, förbered arbetslösningarna för amos. Bered alltid en ny lösning för att säkerställa att resultaten reproducerbara. Värm AMO-beståndsflaskan vid 65 °C i 5 minuter. Förbered ett 5 μL injektionsprov som innehåller fast grönt färgämne (0,02 % slutlig koncentration, se materialförteckningen)och den AMO som späds vid arbetskoncentrationen i vatten.
- Bestäm arbetskoncentrationen av AMO empiriskt för varje gen med hjälp av en dosresponskurva. Arbetskoncentrationen representerar en koncentration där AMO är effektivt för att slå ner genen utan att orsaka allmän toxicitet, såsom bruttomorfologiska defekter. Vanligtvis kommer AMO-arbetskoncentrationer att ligga i intervallet 0,2 mmol/L till 1 mmol/L (0,4 mmol/L fastställdes som den effektiva koncentrationen för denna studie18). Injicera kontrollen Mismatch morpholino i samma koncentration som den effektiva AMO.
- Virvel rören och centrifugera kort för att få dropparna till botten av rören.
- För räddningsförsök bereda ett injektionsprov på 5 μL med AMO utspädd vid arbetskoncentrationen och cDNA-uttrycket plasmid utspädd i vatten till en slutlig koncentration som ska bestämmas empiriskt. För uttryck av DEPDC5 och den negativa kontrollplasmiden var 100 ng/μL effektivt för fenotypisk räddning.
- Embryoberedning:
- Dagen före mikroinjektionen satte du upp zebrafiskparningstankarna. Injektionens morgon, ta bort avdelarna för att möjliggöra gytning. Samla äggen i 100 mm Petri-rätter fyllda med embryovatten med en fin sikt. Injicera inom 20-30 min från insamlingen, medan äggen är i ett cellstadiet.
- Välj 60-80 ägg med en pastapipett i plast och ordna dem i den kiselbelagda Petri-skålen för injektion. Kiselytan förhindrar att äggen glider under injektionerna. Ta bort det mesta av embryovattnet och lämna precis tillräckligt för att täcka äggen halvvägs.
- Mikroinjektioner:
- Fyll en glasnål med injektionslösning. Placera nålen vertikalt i ett av rören som innehåller injektionslösningen och se till att nålens nedre ände vidrör lösningen. Vänta flera minuter tills den färgade injektionslösningen stiger med kapilläritet och är synlig vid nålens spets.
- Montera den fyllda nålen på mikroinjektorns injiceringshandtag (se Materialförteckning ).
- Slå på luftkompressorn och justera tryckinställningen för att generera en insprutningsvolym på ~2 nL.
- För att beräkna volymen av den injicerade lösningen, placera en droppe mineralolja på en mikrotombild. Injicera den färgämnesinnehållande lösningen med hjälp av de inställda tryck- och tidsparametrarna. Mät diametern på den injicerade vätskesfären och beräkna den totala volymen med hjälp av formeln Volume=4/3*π*(d/2)3, där d=den uppmätta diametern på den injicerade bolusen.
- Använd ett dissekerande kikarmikroskop med en 4X-förstoring, injicera äggen i encellsstadiet genom att passera genom chorion och äggula och projicera lösningen direkt i cellen.
- Samla de injicerade embryona i en 100 mm Petri-skål med embryovatten, märk skålen och inkubera dem vid 28 °C.
- Se till att inkubatortemperaturen är stabil över tid, eftersom embryonas utvecklingshastighet är termokänslig. Till exempel skulle tillväxten accelereras vid högre temperaturer och utvecklingsstadiet är avgörande för att korrekt bedöma fenotyp24.
- Kontrollera äggens kvalitet 6-8 timmar efter injektionen och ta bort döda och obefruktade embryon med en pastapipett av plast.
- Nästa morgon, räkna och ta bort döda embryon i varje maträtt med en plast Pasteur pipett.
2. Beteendeanalys
- Global aktivitetsanalys på 28 hpf:
- Utför testet på eftermiddagen dagen efter mikroinjektion (28 hpf), vilket säkerställer att den tid på dagen då testet utförs är konsekvent över experiment för att utföra giltig statistisk analys eftersom embryoutvecklingen är mycket snabb.
- Fyll en 35 mm skål (provfat) med embryovatten och låt den värmas upp i inkubatorn (28 °C) i minst 15 minuter innan testet påbörjas.
- Placera ett nätgaller av plast (1,2x1,2 mm) som är avskuret till storleken, på botten av provskålen.
- Få en annan experimenterare att randomisera ordningen för testning av embryona och maskera namnen på de villkor som ska testas.
- Se till att dödligheten inte förändras mellan förhållandena och jämfört med icke injicerade embryon för att säkerställa fenotypens specificitet. Procenten av döda embryon under alla förhållanden får inte överstiga 10-13 %18.
- Placera 10-12 embryon fortfarande i deras korition på plastnätet med en pastapipett av plast. Fyll provskålen med tillräckligt med embryovatten för att hålla embryona nedsänkta men inte flytande. Flytta vid behov embryona med försiktighet med hjälp av en plastspets för att placera dem på gallret.
- Använd en videokamera (se Materialförteckning)som är fäst vid ett dissekeringsmikroskop, registrera den spontana spoleaktiviteten under en definierad tidsperiod (10-20 min långa videor är vanligtvis tillräckliga för att få representativa prover av aktivitetssprängningar för kvantifieringen)
- Sätt tillbaka embryona i deras respektive maträtt och lägg tillbaka dem i inkubatorn. Upprepa experimentet med så många embryon som behövs för varje tillstånd (som bestäms av en 90% effektanalys).
- Om du vill analysera total spontan rörelse använder du ett ZebraLab-system (se Materialförteckning ). Ladda upp den inspelade videon med hjälp av aktivitets kvantifieringsmodulen och utforma spårningsarenorna runt varje embryo efter behov. Ställ in frys- och sprängtröskeln på 10 respektive 50.
- Kör den automatiska videoanalysen, som kvantifierar total aktivitet inom var och en av de definierade arenorna, återställ sedan datauppsättningen som ett kalkylblad och utför analysen med hjälp av en dataanalysprogramvara.
- Touch-Evoked-Escape-Response (TEER) vid 48 hpf:
- Utför testet på morgonen två dagar efter injektionen (48 timmar efter befruktningen).
- Minst 2 timmar före testningen deklarera embryona med fin tång. Se till att tiden på dagen för dechorionation och beteendetestet är konsekvent över experiment.
- Fyll en 130 mm skål (provfat) med embryovatten och låt den värmas upp i inkubatorn (28 °C) i minst 15 minuter innan testet påbörjas.
- Räkna och ta bort döda och morfologiskt deformerade larver. Registrera siffrorna för varje villkor.
- Få en annan experimenterare att randomisera ordningen och kodifiera namnen på de villkor som ska testas.
- Montera kameran (se Materialförteckningen)över provskålen och se till att hela provskålen är inom synfältet. Att placera en linjal inom synfältet ger en intern kalibrering för avstånd.
- Med en pasteurpipett i plast sätter du ett embryo i mitten av testskålen och börjar inspelningen med en förvärvshastighet på 30 fps.
- Med en fin plastspets, rör något embryots svans med en blinkande rörelse.
- Stoppa inspelningen när larven har avslutat sin rörelse.
- Ta bort embryot från testskålen och lägg det i en ny maträtt fylld med embryovatten. Upprepa testet med så många embryon som behövs för varje tillstånd (enligt en effektanalys på 90 %).
- Sätt tillbaka embryona i originalrätten och lägg tillbaka dem i inkubatorn.
- Om du vill analysera parametrarna för simbeteendet läser du in den inspelade videon i ImageJ-analysprogramvaran. Ladda ner och installera plugin-programmet Manuell spårning i ImageJ (se Materialförteckning). Starta plugin-programmet genom att välja Verktyg | Plugin | Manuell spårning i menyn.
- I dialogfönstret introducerar du bildens kalibrerade skala. Att inkludera en linjal i kamerafältet underlättar konverteringen av cm till pixlar.
- Välj Lägg till spår och starta banans spårning genom att klicka på bilden av zebrafisk larven i den första ramen. Ramarna avancerar automatiskt med varje punkt som läggs till i spårningen.
- Fortsätt spåra rörelsen till slutet av simningsavsnittet.
- Välj Slutspår i spårningsfönstret, hämta X-Y-koordinaterna och beräkna total sträcka, hastighet och svängvinkel.
3. Elektrofysiologisk analys
- Reagens och verktygsberedning:
- Bered 1% agarosa i embryovatten (se avsnitt 1.1.4). Alikvot den flytande agarosen i mikrocentrifugrör och håll dessa på ett värmeblock vid 42 °C för att förhindra att agarosen härdas.
- Förbered inspelningslösningen (i mmol/L): NaCl 134, KCl 2.9, CaCl2 2.1, MgCl2 1.2, glukos 10, HEPES 10, pH 7.8.
- Dra borosilikatglasmikropipetter med en spetsöppning på 1,5-2 μm (5-6 Mm2·kg·s−3· Ett−2 motstånd) opolerat.
- Beredning av zebrafisklarver för elektrofysiologi:
- Placera fisken i en petriskål med glasbotten (se Materialförteckningen)och ta bort överflödiga extracellulära medier för att säkerställa att fisken förs så nära täckspjuten som möjligt.
- Använd en pastapipett i plast, tillsätt varm flytande agarosa på och runt larven. Använd precis tillräckligt med agarose för att täcka fisken. Medan agarosen härdar, använd fina tång för att orientera fisken i ett rakt läge, ventral sida ner, i mitten av skålen.
- Tillsätt 2 ml av inspelningslösningen som innehåller 10 μM Pankuroniumbromid (se Materialförteckningen)för att blockera neuromuskulär överföring. Tillägget av paralyzern är nödvändigt för att eliminera artefakter på grund av små rörelser under inspelningarna.
- Elektrofysiologisk inspelning
- Fyll mikropipetten med inspelningslösning.
- Med patchklämman förstärkare (se Tabell över material)i spänningsklämma konfiguration, mät elektrodbeständighet i badet för att bekräfta dess korrekta värde.
- Använd ett 20x-mål, placera larvens huvud i det centrala synfältet och sänk mikropipetten för att nå inspelningspositionen i hjärnan, inom det optiska tectumet.
- Byt plåstrets klämförstärkare till strömklämma och fäst hållströmmen på 0 mA.
- Använd ett lågpassfilter på 1 kHz, en förvärvsfrekvens på 1 kHz och en digital vinst på 10, registrera spontan aktivitet i 60 minuter för att bestämma baslinjeaktivitetsnivåer.
- Efter 1 timmes baslinjeregistrering, tillsätt 200 μL pentylenetetrazol (PTZ, se Materialförteckning)lösning 300 mmol/L till badet för en slutlig koncentration på 20 mmol/L PTZ.
- Registrera neuronal aktivitet i PTZ i ytterligare 120 min.
- Fastställande av depolariseringshändelse
- Fältinspelningshändelser har mycket långsam dynamik (frekvenser av intresse ligger i intervallet 0,005-0,2 s-1). Filtrera därför signalen med ett lågt pass (Butterworth 5: e ordningen LPF vid 100 s-1) för att undvika alias. Delsampla inspelade spänningsdata från anskaffningsramhastigheten (i detta fall 1 ks-1) ner till 250 s-1 (RAW SIGNAL).
- För att identifiera tidsstämplarna för varje depolariseringshändelse använder du en DETEKTERINGSSIGNAL, som är en filtrerad version av den inspelade signalen (Butterworth 1st order HPF på 0,01 s-1).
- Genom att eliminera lågfrekventa komponenter kan detektion av depolariseringshändelser utföras med en enkel tröskelmetod. Använd ett fast tröskelvärde för bruseliminering och händelsedetektering (0,3 mV användes för denna studie).
- Karakterisera depolariseringshändelsen med en serie tröskelvärden som inträffar med tidsintervall som är mindre än 4 s. Beräkna början och slutet av depolariseringshändelsen som bestäms från på varandra följande sekvenser av tröskelvärden. Händelser som är kortare än 40 ms kan ignoreras som brus.
- Beräkna amplituden för händelserna i den ofiltrerade (RAW-signalen) för att eliminera fel på grund av effekten av lågpassfiltrering på händelsens topp. Välj depolariseringsvågen från råsignalen med hjälp av de tidsstämplar som bestäms i den filtrerade signalen. Mät amplituden som skillnaden mellan de högsta och lägsta värdena för den våg som valts från den råa signalen.
OBS: Skriptfilerna för att utföra steg 3.4 – Fastställande av avpolariseringshändelse – och för att erhålla figur 1 tillhandahålls som kompletterande fil som bifogas den här artikeln.
Representative Results
Figur 1 visar representativa spänningsspår av 4-6 dpf zebrafisk larva extracellulära fältinspelningar vid två genetiska förhållanden: Missmatchningskontroll och DEPDC5-knock-down. Under inspelningens baslinjeperiod visar knock-down för DATAPDC5 en högre förekomst av spontana händelser, medan kontrollen Mismatch visar mycket få fluktuationer. Dessa aktivitetsmönster är representativa för den betydande ökningen av neuronal aktivitet på grund av förlust av funktion av DEPDC5, som vi tidigare har rapporterat18. Efter PTZ-programmet visar både Mismatch-kontroll och DEPDC5 knock-down ett ökat antal depolariseringshändelser. Under den första perioden efter PTZ-ansökan (10– 60 min) observeras en frekvens på 0,8 händelser per minut i både Mismatch-kontroll och DEPDC5-knock-down, där de flesta händelserna är av hög amplitud (>1 mV). Under den senare svarsperioden (60– 120 min efter PTZ-applicering) ökar andelen depolariseringshändelser till cirka 1 händelse per minut, och majoriteten av händelserna är av låg amplitud (≤1 mV).
Bild 1: Exempel spår av fältinspelningar i zebrafisklarvernas hjärna. (A) Översikt över 180 minuters inspelning för en Mismatch control larva och en DEPDC5 Knock-down. Först registrerades spontan baslinjeaktivitet, sedan applicerades PTZ i bad (röd stapel). (B) Peri-stimulanstid histogram av depolarization händelser för Mismatch kontroll och DEPDC5 knock-down. Händelserna klassificerades som hög amplitud (>1 mV - blå) och låg amplitud (≤1 mV - svart). (C-E) Exempel spår av de olika perioderna av inspelningen: (C) spontan aktivitet, (D) Hög amplitud händelser under den första perioden efter PTZ ansökan, (E) Låg amplitud händelser under den senare perioden efter PTZ ansökan. Observera att skriptfilerna för att hämta dessa siffror tillhandahålls som kompletterande fil. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande fil: Skriptfiler för steg 3.4. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Epilepsi är en komplex neurologisk sjukdom, med ett brett utbud av etiologier som börjar belysas med tillkomsten av genetisk sekvenseringsteknik25,26,27. Mångsidiga djurmodeller är nödvändiga för en effektiv translationell strategi som kommer att ge både insikter om de patologiska mekanismerna hos genetiskt kopplade epilepsier, liksom riktade terapier för de distinkta formerna av detta tillstånd. Zebrafiskmodeller har varit mycket effektiva för att reproducera viktiga egenskaper hos epilepsi och ge tillförlitliga avläsningar för antiepileptiskläkemedelsscreening 5,28. Spontana anfall kan detekteras i genetiskt modifieradezebrafiskar 15,29,30,31 och neurofysiologisk analys i dessa modeller28 har bekräftat den neuronala grunden för det epileptiskabeteendet 32,33. Små zebrafisklarver är mottagliga för kemiska skärmar i 96-brunnsformat med hjälp av automatiserad detektion av enkelt beteende, såsom spontan simning, vilket möjliggör snabb upptäckt av potentiella terapier.
Depdc5 knock-down modellen som presenteras här erhålls genom injektion av AMO i zebrafisk embryot för att blockera genuttryck under utveckling. Denna modell presenterar flera keystone fenotypiska funktioner under olika tidpunkter för larv utveckling, som kan användas som indikatorer på terapi effektivitet under ett kemiskt eller genetiska screening protokoll. Den AMO-medierade genen knock-down är en kraftfull teknik, som visar fördelar jämfört med kemiskt inducerad beslag modeller, eftersom det specifikt riktar sig mot uttryck av en gen av intresse, vilket möjliggör identifiering av de underliggande patogena mekanismer som utlöses av en genetisk mutation. Kemiska inducerare, som ändå är potenta verktyg för läkemedelsscreening, kan agera genom flera cellulära vägar som kanske inte alltid är relevanta för den genetiska mutationen som studeras. Medan AMO injektion är i sig en enkel teknik när behärskas av experimenteraren, Det presenterar också ett antal begränsningar. Injektionerna måste utföras på embryot i ett cellstadiet. i våra händer ökade injektioner i senare skeden kraftigt fenotypens variabilitet. Detta begränsar den tid som är tillgänglig för injektion; Därför är en strategi att generera ägg för injektion i en tidssekvens användbar. Vi använder rutinmässigt 4-5 kors som vi öppnar med 15-20 minuters intervall, vilket möjliggör injektion av en koppling innan vi får nästa. Vidare måste man vara noga med att bedöma fenotypen samtidigt som det finns punkter mellan olika experiment, eftersom stereotypa beteenden utvecklas snabbt under de första dagarna av utvecklingen. Volymen och koncentrationen av amos måste också kontrolleras noggrant, eftersom allmän toxicitet på grund av att injicera alltför stora mängder kommer att maskera den specifika fenotypen. De olika kontroller som presenteras i inledningen är avgörande för att bestämma rätt injektionsdos och motsvarande fenotyp.
Fältinspelningar av larv zebrafisk hjärnan är ett användbart verktyg för att undersöka de skadliga effekterna av genetiska mutationer inblandade i olika hjärnsjukdomar på den globala neuronal aktivitet34. Depolariseringshändelser som ses under dessa experimentella förhållanden är en etablerad metod för att bedöma elektrofysiologiska effekter av läkemedel under olika epileptiskatillstånd 15,35. Bedömningen av dessa effekter har dock till största delen gjorts kvalitativt snarare än kvantitativt, och att ha en subjektiv observatör som aktör i analysen. Här utvecklar vi en automatisk detektionsstrategi som objektivt kan kvantifiera depolariseringshastigheten, deras amplitud och varaktighet och kan utvärdera framstegen för dessa parametrar över tid eller med olika genetiska eller farmakologiska interventioner.
De representativa resultaten som presenteras här visar den förväntade fältaktiviteten hos depdc5 knock-down genetisk modell i jämförelse med en Mismatch kontroll i 4-6 dpf zebrafisk, före och efter tillämpningen av PTZ att införa epileptiform-liknande elektrografiska verksamhet. Tidigare har vi visat en betydande ökning av basalaktiviteten i DEPDC5 knockdown villkor18. Här visar vi att svaret på dessa två villkor på PTZ, en kemisk epileptiform aktivitet inducerare, har en liknande bana i tid, börjar med en period av relativt låg frekvens, hög amplitud depolarisering händelser och fortsätter med en period av högre frekvens, lägre amplitud depolarisering händelser. Fältinspelningshändelser har långsam dynamik (frekvenser av intresse ligger i intervallet 0,005-0,2 s-1), därför används både lågpass- och high-pass-filter i det här protokollet för att isolera händelser av intresse. Efter att ha eliminerat lågfrekvent brus utförs detektion av depolariseringshändelser med ett enkelt tröskelvärde. Eftersom signalens statistik påverkas kraftigt av förekomsten av depolariseringshändelser, kunde vi inte använda standardavvikelsen för den totala signalen för att bestämma denna tröskel. Variabiliteten för värdet av standardavvikelsen mellan datamängder var större än de observerade inspelningsbullernivåerna. Därför, efter visuell inspektion av spåren, använde vi ett fast värde av tröskeln på 0,3 mV, för att undvika partiskhet som induceras av olika nivåer av depolariseringsaktivitet.
Det beskrivna protokollet ger en standardiserad och enkel metod för att utvärdera motorbeteendet och neuronal fältaktiviteten, via extracellulär strömspänningsregistrering i kombination med automatisk detektion av depolariseringshändelser i det optiska tectum, för att karakterisera epileptiform-liknande fenotyper i zebrafiskmodeller.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka personalen på ICM:s elektrofysiologiska plattform där neurofysiologiska experiment utfördes. Vi tackar också Anca Marian för teknisk hjälp. SC stöddes av Trampoline Grant #21488. EK fick stöd av AFM Grant #18469 och ERC Consolidator Grant (ALS-Networks). HC fick stöd av doktorspriser från Fondation pour la Recherche Médicale (PLP20141031462) och ARSLA. För AD och RM stöddes detta arbete av tre bidrag från Rumäniens nationella myndighet för vetenskaplig forskning och innovation, CNCS-UEFISCDI (projektnummer PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007 och COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), ett bidrag från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 – bidragsavtal nr 668863-SyBil-AA och ett nationellt vetenskapsstiftelsebidrag NSF-IOS-1656830 finansierat av den amerikanska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
| Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1.5mm, ID: 0.5 mm |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
| Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
| Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
| Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
| Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
| Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
| Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
| HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
| Human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
| ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
| KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
| Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
| Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60 mM in water |
| Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
| pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
| Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300 mM (dissolved in recording solution) |
| Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
| Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
| Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
| Zebralab | Viewpoint, France | N/A |
References
- Kabashi, E., Champagne, N., Brustein, E., Drapeau, P. In the swim of things: Recent insights to neurogenetic disorders from zebrafish. Trends in Genetics. 26 (8), 373-381 (2010).
- Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The Power of Zebrafish in personalised medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. , (2017).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. , (2005).
- Cunliffe, V. T. Building a zebrafish toolkit for investigating the pathobiology of epilepsy and identifying new treatments for epileptic seizures. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
- Griffin, A., Krasniak, C., Baraban, S. C. Advancing epilepsy treatment through personalized genetic zebrafish models. Progress in Brain Research. , (2016).
- Griffin, A., Hamling, K. R., Knupp, K., Hong, S. G., Lee, L. P., Baraban, S. C. Clemizole and modulators of serotonin signalling suppress seizures in Dravet syndrome. Brain. , (2017).
- Orellana-Paucar, A. M., et al. Insights from zebrafish and mouse models on the activity and safety of ar-turmerone as a potential drug candidate for the treatment of epilepsy. PLoS ONE. , (2013).
- Baxendale, S., et al. Identification of compounds with anti-convulsant properties in a zebrafish model of epileptic seizures. Disease Models & Mechanisms. , (2012).
- Bar-Peled, L., et al. A tumor suppressor complex with GAP activity for the Rag GTPases that signal amino acid sufficiency to mTORC1. Science. 340 (6136), 1100-1106 (2013).
- Ishida, S., et al. Mutations of DEPDC5 cause autosomal dominant focal epilepsies. Nature Genetics. , (2013).
- Dibbens, L. M., et al. Mutations in DEPDC5 cause familial focal epilepsy with variable foci. Nature Genetics. , (2013).
- Baulac, S., Weckhuysen, S. DEPDC5-Related Epilepsy. GeneReviews®. , (1993).
- Picard, F., et al. DEPDC5 mutations in families presenting as autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Neurology. , (2014).
- Teng, Y., et al. Knockdown of zebrafish lgi1a results in abnormal development, brain defects and a seizure-like behavioral phenotype. Human Molecular Genetics. , (2010).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. , (2013).
- Suls, A., et al. De novo loss-of-function mutations in CHD2 cause a fever-sensitive myoclonic epileptic encephalopathy sharing features with dravet syndrome. American Journal of Human Genetics. , (2013).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS ONE. , (2016).
- de Calbiac, H., et al. DEPDC5 knockdown causes mTOR-dependent motor hyperactivity in zebrafish. Annals of Clinical and Translational Neurology. , (2018).
- Panchaud, N., Péli-Gulli, M. P., De Virgilio, C. Amino acid deprivation inhibits TORC1 through a GTPase-activating protein complex for the Rag family GTPase Gtr1. Science Signaling. , (2013).
- Lim, K. R. Q., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Design, Development and Therapy. , (2017).
- Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. , (2015).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. , (2015).
- Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. , (2017).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics an official public. 203 (3), 253-310 (1995).
- Møller, R. S., Dahl, H. A., Helbig, I. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics. Expert Review of Molecular Diagnostics. , (2015).
- Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. , (2013).
- Dunn, P., et al. Next generation sequencing methods for diagnosis of epilepsy syndromes. Frontiers in Genetics. , (2018).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: Legacies and new directions. Nature Neuroscience. , (2015).
- Zhang, Y., et al. Pharmacological characterization of an antisense knockdown zebrafish model of Dravet syndrome: Inhibition of epileptic seizures by the serotonin agonist fenfluramine. PLoS ONE. , (2015).
- Swaminathan, A., et al. Non-canonical mTOR-Independent Role of DEPDC5 in Regulating GABAergic Network Development. Current Biology. , (2018).
- Samarut, É, et al. γ-Aminobutyric acid receptor alpha 1 subunit loss of function causes genetic generalized epilepsy by impairing inhibitory network neurodevelopment. Epilepsia. , 2061-2074 (2018).
- Turrini, L., et al. Optical mapping of neuronal activity during seizures in zebrafish. Scientific Reports. , (2017).
- Rosch, R. E., Hunter, P. R., Baldeweg, T., Friston, K. J., Meyer, M. P. Calcium imaging and dynamic causal modelling reveal brain-wide changes in effective connectivity and synaptic dynamics during epileptic seizures. PLoS Computational Biology. , (2018).
- Baraban, S. C. Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2013).
- Afrikanova, T., et al. Validation of the Zebrafish Pentylenetetrazol Seizure Model: Locomotor versus Electrographic Responses to Antiepileptic Drugs. PLoS ONE. , (2013).
