Vi beskriver her en protokoll for å undersøke cytotoksisitet av pre-aktivert CD8+ T celler mot kreftceller ved å registrere apoptotisk kreft celler via sanntid mikroskopi. Denne protokollen kan undersøke mekanismene bak myelogen celle-indusert T celle undertrykkelse og evaluere forbindelser å fylle T celler via blokade av undertrykkende myelogen immunceller.
Potensiering av svulst-drapet evne til CD8+ T celler i svulster, sammen med deres effektiv svulst infiltrasjon, er nøkkelen til vellykket immunotherapies. Flere studier har indikert at svulsten infiltrere myeloide celler (f.eks myelogen-avledet suppressor cellene (MDSCs) og svulst-assosiert makrofager (TAMs)) undertrykke cytotoksisitet av CD8+ T celler i svulst microenvironment og at målretting disse regulatoriske myeloide celler kan forbedre immunotherapies. Her presenterer vi en i vitro analysen system for å vurdere immun undertrykkende effekter av monocytic-MDSCs og TAMs på svulst-drapet evne til CD8+ T celler. Dette vi først kultivert naive splenic CD8+ T celler med anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer i tilstedeværelse eller fravær av suppressor cellene, og deretter co kultivert pre-aktivert T cellene mål kreftceller i nærvær av en fluorogenic caspase-3 substrat. Fluorescens fra underlaget i kreftcellene ble oppdaget av sanntids fluorescens mikroskopi som en indikator på T-celle indusert svulst celle apoptose. I denne analysen, kan vi oppdage økningen av svulst celle apoptose av CD8+ T celler og sin undertrykkelse av pre kultur med TAMs eller MDSCs. Denne funksjonelle analysen er nyttig for å undersøke CD8+ T celle undertrykkelse mekanismer av regulatoriske myeloide celler og identifisere druggable mål å overvinne den via høy gjennomstrømning screening.
Det er kjent at CD8+ T celler kan eliminere kreftceller når de utøve sine full cytotoksisitet. Etter aktivering av T-celle reseptor (TCR), CD8+ T celler spredning og differensiere i cytotoksiske Effektor celler. Utvidet og aktivert CD8+ T celler skiller cytotoksiske korn, inkludert perforin og granzymes, som overføres til målcellene og starte ulike lytisk trasé som caspase-3 mediert apoptose1. CD8+ T celler kan også indusere svulst celle apoptose av reseptorer på målet celler, for eksempel reseptorer for tumor nekrose faktor-α (TNF-α), første apoptose signal ligand (FasL) eller TNF-relaterte apoptose-inducing ligand (sti). Videre aktivert CD8+ T celler skiller interferon-γ (IFN-γ) som kan undertrykke svulst celle spredning og øke sensitiviteten av kreftceller til CD8+ T celler via opp-regulering av FasL reseptor1. Gitt potensialet for CD8+ T svulst drapet evne, flere strategier for å øke deres cytotoksisitet (f.eks checkpoint hemmere, kreft vaksinasjon og adopsjon overføring av chimeric antigen reseptor (bil) uttrykker T celler) har blitt etablert og vist signifikant terapeutisk effekt på visse typer kreft2. Men samler bevis antyder at svulsten-infiltrere immunceller som regulatoriske T-celler, myelogen-avledet suppressor cellene (MDSCs), og svulst-assosiert makrofager (TAMs) kan undertrykke CD8+ T celle funksjoner og begrense effekten immunotherapies3,4,5. For å forbedre slike immunotherapies, er det viktig å forstå hvordan immun suppressor cellene grense CD8+ T celle cytotoksisitet. Identifikasjon av CD8+ T celle undertrykkelse mekanismer samt druggable mål å overvinne den, vil kreve utvikling og utnyttelse av in vitro analyser.
Metoden gullstandarden måle CD8+ T celle cytotoksisitet er krom utgivelsen analysen der utgivelsen av radioaktivt sonden (51Cr), fra målet celler som er lysed av CD8+ T celler er bestemt6. Denne analysen har imidlertid flere ulemper inkludert relativt lav følsomhet, høye, manglende evne til å oppdage tidlig apoptotisk hendelser, farlig disposisjon problemer og begrenset kompatibilitet med automatisert flytende håndtering og gjenkjenning for å støtte programmer med høyere ytelse. En annen vanlig metode er flyt cytometric analyser som apoptose av mål kreftceller oppdages av annexin V bindende7. I denne analysen er det mulig å oppdage andre parametere som mål celledød bruker propidium iodide (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og effektor celle aktivering angitt av CD107a eller CD69 uttrykk, i tillegg til apoptose i målcellene7 . Denne analysen krever imidlertid stort antall suppressor cellene sammenlignet med krom utgivelsen analysen. Det krever også løsgjøring og disaggregation av tilhenger målcellene og dette kan påvirke resultatene. Faktisk krom slipper analysen eller flyt cytometric analysen brukes vanligvis ikke til å undersøke suppressor celle effekter på T celle funksjoner. I stedet måling av T-celle spredning angitt av fortynning av en fluorescerende farge (f.eks CFSE) pre-lastet inn T celler brukes ofte til å evaluere hemming av CD8+ T celle funksjon av suppressor cellene. Oppdagelsen av IFN-γ produksjon fra kulturperler T-celler er en annen metode å evaluere effekten av suppressor cellene på T celle aktivering8,9. Men resultatene fra disse analyser ikke nødvendigvis samsvarer målcellen drepe evnen til CD8+ T celler.
Vi presenterer her en alternativ funksjonell analyse for å vurdere effekten av suppressor cellene, spesielt makrofager i metastatisk svulster, på cytotoksisitet av CD8+ T celler. Denne metoden angir cytotoksisitet av CD8+ T celler, pre kultivert med eller uten suppressor cellene i nærvær av anti-CD3/CD28 aktivering antistoffer, ved å registrere svulst celle apoptose, angitt av fluorescens fra en fluorogenic caspase-3 substrat6 bruke automatisert time-lapse mikroskopi (figur 1). Denne protokollen har flere fordeler sammenlignet med andre metoder; det krever bare et lite antall celler, gjør påvisning av tilhenger svulst celledød med høy følsomhet, kan bildet sanntid effektor til mål interaksjon og er mottakelig for høy gjennomstrømning screening.
I denne protokollen brukes metastasering-assosiert makrofager (mammaer) og deres stamfar monocytic-MDSCs (M-MDSCs) isolert fra metastatisk svulster i mus som suppressor cellene. I musen modeller for metastatisk brystkreft, forskjellige innbyggere makrofager preget som F4/80høyLy6G–CD11bhøyLy6Clav akkumuleres i lungene som inneholder metastatisk svulster. Denne macrophage befolkningen er sjelden funnet i normale lungene og dermed kalles metastasering-assosiert makrofager (mammaer)10. I disse musen modeller, en annen myelogen celle befolkningen, definert som F4/80høyLy6G–CD11bhøyLy6Chøy, også tjener hovedsakelig i metastatisk lungene hvor det gir stige til mammaer11. Basert på deres egenskaper, representere CD11bhøyLy6Chøy MAM progenitor celler M-MDSCs12.
Denne metoden er basert på to separate co kultur trinn: co dyrking CD8+ T celler med potensielle suppressor cellene og co dyrking av pre-betinget CD8+ T celler med mål kreftceller (figur 1). Steg 1 co kultur er ganske ligner CD8+ T celle spredning analyser vanligvis brukes til å fastslå effekten av suppressor cellene på CD8+ T celle-funksjonen. Men samsvarer T celle spredning ikke alltid med deres cytotoksisitet. For eksempel vi har funnet at co kultur med M-MDSCs eller mammaer økt i stedet for redusert spredning av CD8+ T celler i nærvær av CD3/CD28 aktivere antistoffer (supplerende figur 3), mens disse pre betinget CD8+ T-celler viste redusert cytotoksisitet mot målet celler (Figur 4, figur 5, figur 6). Disse resultatene markere betydningen av evalueringen av funksjonelle aktiviteten, dokumentert av målet kreft celle apoptose, som denne CD8+ T celle cytotoksisitet analysen.
I denne analysen, har vi identifisert som CD8+ T celler krever ca 15 h co kultur for å indusere maksimal apoptose av E0771-LG musen mammary kreftceller (figur 5). Denne forsinkelsen kan skyldes lag mellom første kontakt Effektor celler med mål samt tilhørende immun synapse dannelse og tiden det tar å indusere apoptotisk signaler i mål målt ved aktivering av caspase-3 (supplerende film 1 ). Vi har også identifisert som antall apoptotisk tumorceller nådd et platå etter 24 h, som er trolig på grunn av eliminering av mål av T-celler og/eller tap av fluorescerende signal fra døde celler. Denne evnen til å identifisere av topp apoptose er en stor fordel av denne analysen siden bestemmelse av en optimal tidspunkt er viktig for riktig sammenligninger mellom ulike forhold. I vårt tilfelle for eksempel forskjellen i cytotoksisitet mellom kontroll CD8+ T celler og MDSC/MAM-utdannede CD8+ T celler var mye større på 15-18 h sammenlignet med 72 h (figur 5), og dermed et sluttpunkt eksperimentere med en 72 h inkubasjonstid ville gi misvisende resultater.
Denne metoden kan også visualisering av sanntids effektor til mål celle interaksjon, som gir bedre innsikt i mekanismen underliggende begrenset cytotoksisitet av CD8+ T celler pre inkubert med suppressor cellene. For eksempel vi observerte at CD8+ T celler pre inkubert med M-MDSCs eller mammaer oppdaget og interaksjon med mål kreftceller, men ikke alltid få apoptose (supplerende Movie 4, utfyllende film 5, utfyllende filmen 6). Selv om vi ikke tallfeste denne hendelsen, ville det være mulig og interessant å kvantifisere og sammenligne andelen møter og samhandling tiden sammen med apoptose induksjon. En annen stor fordel er at denne metoden krever et lite antall celler (f.eks 1 x 103 mål) og 4 x 103 Effektor celler per brønn. Faktisk kan denne protokollen videre miniatyriserte for 384-vel plate format hvis ønskelig. Derfor er denne analysen egnet for høy gjennomstrømning screening og eksperimenter der cellen tallene er begrenset som i vitro testing ved bruk av dyrebare celler avledet fra i vivo eller ex vivo prøver.
På den annen side, er en begrensning av gjeldende analysen tilstedeværelsen av betydelig antall døde Effektor celler i noen forhold. For å øke nøyaktigheten i atskillende apoptose av mål kreftceller enn effektor CD8+ T celler, kjerner i målet celler er merket og en kjerner størrelsesbegrensningen (som utelukker Effektor celler) brukes for dataanalyse i dette analysen (figur 2). Men er det noen tilfeller der overlegg av aggregater av (grønn) apoptotisk CD8+ T celler på ikke-apoptotisk mål kreftceller, som kan forvirre resultatene. Denne begrensningen kan begrenses ved bruk av en død celle fjerning kolonne på Effektor celler før co kultur med mål kreftceller, forutsatt at tilstrekkelig antall Effektor celler er tilgjengelig. Med mer komplekse mikroskopi systemer, det kan også være mulig å redusere falske positive signalet ved merking effektor CD8+ T celler med en fluorophore forskjellig fra målet cellen kjerner og fluorogenic caspase-3 underlaget.
Så langt denne protokollen blitt benyttet for å undersøke antigen uspesifisert aktivering av CD8+ T celler. Selv om MDSCs og TAMs i svulst microenvironment undertrykke T celle funksjoner gjennom antigen uspesifisert mekanismer, undertrykke MDSCs i perifere lymfoide vev T celle svar i en antigen bestemt måte18. Undersøke immun undertrykkende funksjoner slik celletyper, i vitro spredning analysen bruker CD8+ T celler fra OT-1 transgene mus er vanlig. I denne analysen, OT-1 T-celler (uttrykke ovalbumin (OVA) bestemt T-celle reseptor) er co kultivert med suppressor MDSCs i nærvær av OVA peptider som gjelder for den første kulturen i analysen vår cytotoksisitet (i.e., aktivering av T celler i tilstedeværelse eller fravær av suppressors). Det er også mulig å manipulere mål kreftceller å uttrykke OVA, som kan indusere antigen-spesifikke kreft cellen dreping av OT-1 T celler. Derfor vil analysen også aktivere undersøkelse av MAM/MDSC-mediert undertrykkelse av antigen-spesifikke T celle aktivering. Det er også mulig å bruke analysen for å undersøke menneskelige celler, aktivisering antistoffer mot CD3 og CD28 er kommersielt tilgjengelig, og en protokoll for å isolere menneskelige TAMs fra klinisk prøver har vært etablert19.
Kollektivt denne analysen er ganske allsidig og kan brukes til å undersøke cytotoksisitet andre immun celletyper. Foreløpig i våre laboratorier, det blir utvidet for å undersøke antigen-avhengig celle cytotoksisitet under ulike forhold, og er også utviklet for høy gjennomstrømning screening.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) og MRC (MR/N022556/1 (JWP, TK), UK). NOC og DDS anerkjenner støtte fra National fenotypiske Screening sentrum Phenomics Discovery initiativ og kreft forskning UK (NOC)
0.05% Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
12-Well Cell Culture Plate | Freiner Bio-One | 665-180 | |
1x PBS | Gibco | 14190-094 | |
2-mercaptethanol | Sigma | M6250-10ML | |
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube | FALCON | 352054 | |
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom ) | Costar | 3799 | Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells |
96-well plate (Flat bottom) | Nunc | 165305 | Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay |
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody | BIO-RAD | MCA497A647 | Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1×10^6 cells |
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody | Biolegend | 100730 | Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1×10^6 cells |
anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102111 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340 |
anti-mouse CD3e Antibody | Biolegend | 100314 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720 |
APC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100236 | Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1×10^6 cells |
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody | Biolegend | 128026 | Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1×10^6 cells |
Bovine Serum Albmin | Sigma | A1470-100G | |
Cell Strainer (100μm Nylon) | FALCON | 352360 | To smash the spleen |
Cell Strainer (40μm Nylon) | FALCON | 352340 | To filter the lung digestion |
DAPI | Biolegend | 422801 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium | Gibco | 41966-029 | |
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell Technologies | 19853 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
FITC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100406 | Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Geltrex Ready-to-Use | Gibco | A1596-01 | Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay |
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent | Essen BioScience | 4476 | Lenti viral particules encoding mKate2 |
IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | Detector (fluorescence microscope) | |
IncuCyte ZOOM 2018A | Essen BioScience | Analysis software | |
L-Glutamine (100X) | Gibco | A2916801 | |
Lung Dissociation Kit | Miltenyi | 130-095-927 | Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
Non-essential amino acid (100X) | Gibco | 11140-035 | |
NucView488 | Biotium | 10403 | Fluoregenic caspase-3 substrate |
PE anti-mouse Ly6G Antibody | Biolegend | 127607 | Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1×10^6 cells |
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody | Biolegend | 101216 | Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | Penicillin Streptomycin for primary culture of cells |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103132 | Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268 | |
Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
Recombinant murine IL-2 | Peprotech | 212-12 | Activation of isolated CD8+ T cells |
Sodium pyruvate (100X) | Gibco | 11360-070 | |
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 101320 | |
: Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm) : Green channel excitation: 440 – 480 nm : Green channel emission: 504 – 544 nm : Red channel excitation: 565-605 nm : Red channel emission: 625 – 705 nm |