Summary
여기의 미리 활성화 CD8 세포 독성을 조사 하는 프로토콜 설명 apoptotic 암 세포를 통해 실시간으로 현미경을 감지 하 여 암 세포에 대 한+ T 세포. 이 프로토콜 골수성 세포 유도 된 T 세포 억제 뒤에 메커니즘을 조사 하 고 면역 진압 골수성 세포의 봉쇄를 통해 T 세포를 보충 하기 위한 화합물을 평가할 수 있습니다.
Abstract
CD8의 종양-죽이 능력의 potentiation+ T 세포 종양 그들의 효율적인 종양 침투 함께 성공적인 immunotherapies의 핵심 요소입니다. 여러 연구 결과 종양 침투 골수성 세포 (예: 억압 파생 골수성 세포 (MDSCs) 및 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam))의 CD8 세포 독성 억제 표명+ T 세포 종양 microenvironment 및 그 대상 이러한 규제 골수성 세포 immunotherapies를 개선할 수 있습니다. 여기, 선물이 CD8의 종양 살해 능력에 monocytic MDSCs와 Tam의 면역 진압 효과 평가 하는 체 외 분석 결과 시스템+ T 세포. 이 위해, 우리는 먼저 순진한 교양 비장 CD8+ T 억제기 세포의 유무에서 안티-CD3/CD28 활성화 항 체와 세포 그리고 다음 공동 대상 암 세포는 fluorogenic의 존재를 미리 활성화 된 T 세포 배양 caspase 3 기판입니다. 암 세포에 기판에서 형광 T 세포 유도 된 종양 세포 apoptosis의 지표로 서 실시간 형광 현미경 검사 법에 의해 발견 되었다. 이 분석 결과에서 우리가 성공적으로 CD8에 의해 종양 세포 apoptosis의 증가 검색할 수 있습니다+ T 세포와 Tam 또는 MDSCs 사전 문화에 의해 그것의 억제. 이 기능 분석 결과 조사 CD8 유용+ T 억제 메커니즘 규제 골수성 세포 및 높은 처리량 검열을 통해 그것을 극복 하기 위해 식별 druggable 대상에 셀.
Introduction
그것은 알려져 그 CD8+ T 그들은 그들의 전체 세포 독성을 발휘 하는 때 세포 종양 세포를 제거할 수 있습니다. T 세포 수용 체 (TCR) CD8의 활성화 후+ T 세포 증식과 세포 독성 효과 기 세포로 분화. 확장 되 고 활성화 된 CD8+ T 세포를 perforin 등 대상 셀으로 전송 됩니다 caspase 3 apoptosis1중재와 같은 다양 한 용균성 경로 시작 하는 granzymes 세포 독성과 립 분 비. CD8+ T 세포 수 또한 유도 종양 세포 apoptosis 종양 괴 사 인자-α (TNF-α)에 대 한 수용 체 등 대상 세포에 수용 체를 활성화 하 여 첫 번째 apoptosis 신호 ligand (FasL), 또는 apoptosis 유도 ligand TNF 관련 (흔적). 또한, 활성화 된 CD8+ T 세포 분 비 인터페론-γ (IFN-γ) 종양 세포 증식을 억제 하 고 CD8 종양 세포의 감도 증가 시킬 수 있는+ T 세포를 통해 업 레 귤 레이 션 FasL 수용 체1의. CD8에 대 한 잠재력을 감안할 때+ T 종양 살해 능력, 그들의 세포 독성 (예를 들어, 검사점 억제제, 암 예방 접종, 그리고 공상 항 원 수용 체 (자동차) 표현 하는 T 세포의 입양 전송)를 강화 하는 몇 가지 전략 설립 되었습니다 그리고 특정 유형의 암2에 표시 된 중요 한 치료 효과. 그러나, 규정 하는 T 세포와 같은 세포 종양 침투 면역, 억압 파생 골수성 세포 (MDSCs), 및 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam) CD8 억제 수 있습니다 제안 증거를 축적+ T 세포 기능 및 효능을 제한 immunotherapies3,,45. 이러한 immunotherapies을 개선 하기 위해, 그것은 어떻게 면역 억압 셀 제한 CD8 이해 해야+ 세포 독성 T 세포. CD8 식별+ T 세포 억제 메커니즘 뿐만 아니라 druggable 목표, 그것을 극복 하기 위해 개발 및 생체 외 분석 실험의 활용이 필요 합니다.
CD8 측정 하는 표준 방법은+ 세포 독성 T 세포는 크롬 릴리스 분석 결과는 대상에서 방사성 조사 (51Cr)의 릴리스 세포 CD8에 의해 lysed는+ T 세포, 결정6. 그러나,이 분석 결과 상대적으로 낮은 감도, 높은 배경, 초기 apoptotic 이벤트, 유해 처리 문제, 그리고 자동된 액체 처리와 검색을 지원 하기 위해 제한 된 호환성을 감지 하는 무 능력을 포함 하 여 몇 가지 단점이 있다 더 높은 처리량 응용 프로그램입니다. 또 다른 일반적인 방법은 흐름 cytometric 분석 대상 종양 세포의 apoptosis annexin V7을 바인딩 하 여 감지 합니다. 이 분석 결과에서 그것은 목표 세포 죽음 propidium 요오드 화물 (PI) 또는 7-aminoactinomycin D (7-AAD)와 이펙터 세포 활성화 대상 셀7에에서 apoptosis 이외에 CD107a 또는 CD69 식으로 표시를 사용 하 여 같은 다른 매개 변수를 검색할 수 . 그러나,이 분석 결과 크롬 방출 분석 결과에 비해 억압 세포의 많은 수를 요구 한다. 그것은 또한 분리 및 부착 대상 셀의 피의 요구 하 고이 결과 편견 수 있습니다. 실제로 크롬 릴리스 분석 결과 또는 흐름 cytometric 분석 결과 T 세포 기능에 억압 셀 효과 조사 하기 위해 일반적으로 사용 되지 않습니다. 대신, T 세포에 미리 로드 되는 형광 염료 (예를 들어, CFSE)의 희석으로 표시 하는 T 세포 확산의 측정 자주는 CD8의 억제 평가+ 억제기 세포 T 세포 기능. 경작된 한 T 세포에서 IFN-γ 생산의 T 세포 활성화8,9에 억압 셀의 효과 평가 하기 다른 표준 방법입니다. 그러나, 이러한 분석에서 결과 않습니다 반드시 연관 되지 죽이 CD8의 능력 목표 셀+ T 세포.
우리는 여기에 CD8 세포 독성 억제 세포, 특히 전이성 종양에서 세포의 효과 평가 하는 대체 기능 분석 결과 제시+ T 세포. 이 방법은 결정의 CD8 세포 독성+ T 세포, 종양 세포 apoptosis를 감지 하 여 억압 셀 안티-CD3/CD28 활성화 항 체 존재 유무를 교양 사전 fluorogenic caspase 3에서 형광으로 표시 기판6 을 사용 하 여 자동 시간 경과 현미경 (그림 1). 이 프로토콜은; 다른 방법에 비해 몇 가지 장점을 그것은 셀 수가 적은 필요, 높은 감도와 부착 종양 세포 죽음의 탐지를 가능 하 게, 실시간 이펙터 대상 상호 작용 이미지 수 이며 높은 처리량 검열 의무가.
이 프로토콜에 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs)와 그들의 조상 monocytic-MDSCs (M MDSCs) 생쥐에서 전이성 종양에서 고립 된 억압 셀으로 사용 됩니다. 전이성 유방암의 마우스 모델에서 대 식 세포의 뚜렷한 인구 특징 F4/80높은Ly6G-CD11b높은Ly6C낮은 축적 전이성 종양을 포함 하는 폐에. 이 대 식 세포 인구 정상적인 폐에서 자주 발견 이며 따라서 라는 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs)10. 이 마우스 모델에서 다른 골수성 세포 인구, 정의 F4/80높은Ly6G-CD11b높은Ly6C높은, 또한 축적 주로 어디 그것을 생겨나게 MAMs11전이성 폐에서. 그들의 특성을 바탕으로, CD11b높은Ly6C높은 어머니 조상 세포 M-MDSCs12를 나타낼 수 있습니다.
Protocol
관련 된 생쥐에 실시 했다 모든 절차 허가 영국 홈 오피스 (P526C60B3)에서 허가. 상업적인 시 약 및 장비에 대 한 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
1. 그들의 핵에 빨간색 형광 단백질을 표현 하는 대상 셀의 준비
- 적절 한 소스에서 대상 마우스 암 세포 라인을 얻을.
참고:이 프로토콜에서 E0771 마우스 유 방 종양 세포 (E0771-LG)13 의 높은 전이성 파생 사용 됩니다. 보호자 E0771 셀 C57BL/6 마우스14에서 시작 됩니다. - 해 동 고와 Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM) 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2에서 셀 문화 인큐베이터에서 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 포함 하 여 E0771-LG 셀의 유리병을 유지 합니다.
참고: 그것은 확인 되어야 한다 세포는 mycoplasma에 대 한 부정적. 이 위해, 2-3 일 문화 매체의 수집 500 μ (없을 경우에 항생제와 antimycotics), 위에서 설명한 대로 E0771 셀 (또는 셀 테스트) 문화. 12,419 x g 60에 매체 원심 세포 파편을 제거 하 고 상쾌한 새로운 튜브로 전송 하는 s. Mycoplasma 오염 상용 mycoplasma 테스트 키트를 사용 하 여 결정 ( 테이블의 자료를 참조) 또는 PCR15 제조업체의 지침에 따라. - 12 잘 플레이트, 그리고 문화에서 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2배양 기에서 하룻밤 사이 10% (v/v) FBS DMEM 셀에 잘 당 씨앗 5 x 103 E0771-LG 셀.
참고: 대상 셀의 확산 속도가 낮은 경우 (인구 36 h 보다 큰 시간을 두 배로), 1 x 104셀의 수를 늘릴 수 있습니다. - 10% (v/v) FBS DMEM 10 μ g/mL polybrene를 포함 하 여 1 mL와 매체를 대체 하 고 추가 25 μ lentiviral 입자 (1 x 106 화/mL)의 빨간 형광 단백질을 제한 핵 인코딩 (mKate2, 테이블의 자료를 참조).
- 37 ° C, 습도 95%와 5% CO2배양 기에서 24 h에 대 한 셀을 문화.
- 10% (v/v) FBS DMEM 매체를 대체 하 고 37 ° C, 습도 95%와 5% CO2배양 기에서 24-48 h에 대 한 셀을 문화.
- 10% (v/v) FBS DMEM 셀 시작 빨간 형광 단백질을 표현 하 고 그들은 80-90% 합칠 때까지 셀 문화 1 μ g/mL puromycin를 포함 하 여 매체를 바꿉니다.
참고: puromycin의 농도 목표 세포 유형 사이 다른 되며 취소 transfected 세포를 사용 하 여 최적화 합니다. - Subculture에 살아남은 10% (v/v) FBS DMEM 1 μ g/mL puromycin를 포함 하 여 1-3 구절에 대 한 세포 및 사용까지 주식 액체 질소 증기 위상 스토리지 시스템에 cryopreserve.
2. 마우스에서 종양의 억제 세포의 고립
참고:이 프로토콜에서 억압 셀 (즉, MAMs M MDSCs) E0771-LG 셀에 의해 설립 하는 전이성 종양을 포함 하는 폐에서 격리 됩니다. 조직 분리와 세포 분류는 다른 조직에서 세포를 분리 최적화 되어야 합니다.
- 1 x 106 암 세포 (E0771-LG) syngeneic (C57BL/6), 여성, 7-10 주 오래 된 쥐의 꼬리 정 맥에 주사.
- 14 일 후 전이성 종양을 포함 하는 폐를 분리 하 고 앞에서 설명한11으로 효소 소화를 통해 perfused 폐에서 단일 셀 정지를 준비 합니다.
참고:이 프로토콜에서 4 개의 마우스는 주입 암 세포 그리고 그들의 전이성 폐 충분 한 억제기 세포를 얻기 위해 결합 됩니다. - 얼음에 30 분 동안 반대로 마우스 CD16/CD32 항 체와 단일 셀 정지 품 어 하 고 또 다른 30 분10,11 CD45, F4/80, CD11b, Ly6C, 및 Ly6G ( 테이블의 자료를 참조)에 형광 성 항 체와 얼룩 , 13.
- 포함 하는 2% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA), PBS의 1 mL를 한번 스테인드 셀을 세척 하 고 다시 2% (w/v) BSA 포함 하는 PBS의 500-1000 μ와 셀 펠 릿을 일시 중단.
- DAPI의 3 μ M를 추가 및 정렬 M MDSCs (DAPI-CD45+F4/80+Ly6G-CD11b높은Ly6C높은)와 MAMs (DAPI-CD45++Ly6G F4/80-CD11b높은 Ly6C낮은) 셀 정렬 (보충 그림 1)를 사용 하 여.
참고: MAMs (Ly6C낮은)와 M-MDSCs (Ly6C높은) 구별을 Ly6C 수준 임계값 기반 거주 치경 대 식 세포 (RMAC)의. 정렬된 셀의 순도 90% 이상의 예상된 순수성을 가진 cytometry 통해 측정 됩니다. - 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) 페니실린/스, 2 m L-글루타민, 1% (v/v) 비 필수 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate, m 및 50 nM 2-mercaptoethanol (농축 DMEM, E DMEM 라는) 포함 된 DMEM의 400 μ와 정렬된 셀 resuspend
- Trypan 블루 제외 방법16 를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하 고 2 x 106 셀/E DMEM mL를 조정 합니다.
- 사용까지 얼음에 셀을 계속.
3. 절연 CD8의+ T에서 쥐의 비장 세포
- 다음과 같이 대상 암 세포 라인 (즉, 이 프로토콜에 C57BL/6 쥐)에 syngeneic은 마우스에서 비장 격리:
- CO2 흡입 하 여 동물을 안락사.
- 깨끗 한 절 개 보드에 동물을 놓고 70% (v/v) 에탄올과 피부를 닦아.
- 가 위를 사용 하 여 비장을 노출 하는 복 부 피부를 잘라
- 비장, 위장에 열 등 한 위치, 분리 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 mL를 포함 하는 튜브에 배치.
- 살 균 5 mL 주사기의 내부 플런저를 사용 하 여 100 μ 셀 거르는 50 mL 튜브에 설정에 비장 갈기.
- PBS의 총 10 mL를 사용 하 여 필터를 통해 세포를 전달 합니다.
- 337 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한 발음.
- 1 ml의 PBS 2 mM EDTA와 0.5% (w/v) BSA (버퍼를 실행 하는)를 포함 하는 셀 펠 릿 resuspend 고 40 μ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링 합니다.
- 라이브 셀 수를 계산 하 고 1 x 108 셀/ml 실행 버퍼를 사용 하 여 조정 합니다.
참고: 작은 유지 순도 검사에 대 한 사전 농축 샘플 셀의 aliquot. - CD8을 풍요롭게+ T 세포의 부정적인 선택 키트를 사용 하 여 자기 정렬 ( 테이블의 자료를 참조).
- Splenocytes 셀의 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브 1 x 108 (1 mL)을 전송.
- Biotinylated 항 체의 50 μ를 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
- 활용 하는 streptavidin 자석 구슬의 125 μ를 추가 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- 버퍼, 실행의 1.325 mL을 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 혼합.
- 자석에 튜브를 배치 하 고 2.5 분 동안 실 온에서 품 어.
- 자석를 선택 하 고 새 튜브로 풍부한 세포 현 탁 액을 붓는 다.
- 200 μ E DMEM의 풍부한 셀 resuspend (즉,., 20% (v/v) FBS, 포함 된 DMEM 1% (v/v) 페니실린/스, 2 mM L-글루타민, 1% (v/v) 비 필수 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate, 및 50 nM 2-mercaptoethanol).
- 라이브 셀의 수를 계산 하 고 2 x 106 셀/E DMEM mL를 조정 합니다. 셀 37 ° C에서 CO에2 인큐베이터까지 계속 사용.
참고: 작은 유지 순도 검사 후 농축 샘플 셀의 aliquot. - CD8의 순도 결정+ T 세포 cytometry에 의해 다음과 같이:
- 사전 농축 (단계 3.6)에서 1 x 104 의 세포 또는 후 농축 (단계 3.9) 샘플을가지고 고 실행 버퍼를 사용 하 여 100 μ를 각각의 총 볼륨을 조정.
- 얼음에 30 분 동안 반대로 마우스 CD16/CD32 항 체와 단일 셀 정지 품 어 하 고 또 다른 30 분을 CD45, CD3, CD4, CD8 ( 테이블의 자료를 참조) 형광 항 체와 얼룩.
- 2% (w/v) BSA를 포함 하는 PBS의 500 μ와 스테인드 셀을 세척 하 고 다시 2% (w/v) BSA 포함 하는 PBS의 500-1000 μ와 셀 펠 릿을 일시 중단.
- DAPI의 3 μ M을 추가 하 고 c d 3의 비율을 결정+CD4-CD8 총 CD45에 셀+ + 세포 인구.
4. 활성화 및 격리 된 CD8의 확장+ T 세포
- 50 μ 당 aliquot 1 x 105 세포 CD8+ T U-하단 96 잘 접시의 우물으로 (단계 3.9에서에서 준비) 세포.
- (단계 2.7에서에서 준비) 50 μ 억제기 세포 당 1 x 105 셀 추가 또는 우물에의 전자 DMEM 50 μ.
- E-DMEM, 4 × 104 U/mL 식민지 자극 요소 (CSF-1) 1, 240 U/mL interleukin-2 (일리노이-2), 8 μ g/mL 반대로 마우스 CD3ε 항 체, 및 16 μ g/mL 반대로 마우스 CD28 항 체의 구성 된 정품 인증 매체를 준비 합니다.
참고: CSF-1 T 세포 활성화를 위해 필요 하지 않습니다 하지만이 프로토콜 (MAMs 및 M MDSCs) 억제기 세포의 생존을 위해 필수적 이다. 따라서, 그것은 문화 조건에 일관성을 유지 하기 위해 대상 암 세포와 T 세포의 공동 문화에 그대로 유지 됩니다. CSF-1 나노-모 랄 농도 모든 조직에서 발견 되 고 monocyte/대 식 세포 생존 vivo에서, 필요 때문이이 셀에 대 한 생리 적 맥락 이다. - 50 μ 활성화 중간 (단계 4.3)의 추가 함께 또는 테스트 시 약 없이 전자 DMEM의 50 μ.
- 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2 에서 인큐베이터에 접시를 놓고 4 일 셀 문화.
5. 설치 대상의 공동 문화의와 전 활성화 한 CD8 세포+ T 세포
- 1: 100 희석된 증가율 감소 성 지하실 멤브레인 매트릭스 (자료 테이블)의 30 μ 플랫 바닥 96 잘 접시 현미경 검사 법, 적합의 우물에 추가 하 고 적어도 1 시간에 대 한 CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어.
- 대상 셀 (즉, E0771-LG 제한 핵 빨간 형광 단백질을 표현)을 준비 합니다.
- 1 분 동안 실 온에서 0.05 %trypsin / EDTA의 1 mL와 대상 셀을 품 어 그리고 부드러운 pipetting으로 세포를 수확.
- DMEM 10% (v/v) FBS를 포함 하 여 9 mL을 추가 하 고 5 분 동안 337 x g 에 세포 현 탁 액을 원심.
- 다시 E-DMEM의 500 μ 셀을 일시 중지 및 라이브 셀 수 있습니다.
참고: 계산 하기 전에 대상 셀 필터링 셀 단일 세포 현 탁 액을 생산 하는 40μm 셀 스 트레이너를 통해. - E-DMEM을 추가 하 여 2 × 104 셀/mL (= 당 50 μ 1 x 103 셀)를 밀도 조정 하 고 얼음에 셀을 계속.
- 효과 기 세포를 준비 (즉, 전 활성화 CD8+ T 세포).
- Resuspend+ T pipetting, 전송 부동 CD8 철저 하 여 96 잘 접시 (4.5 단계)의에 셀 새로운 1.5 mL 튜브에 세포.
참고: MAMs M MDSCs 단단히 잘 준수와 pipetting에 의해 분리 되지. - 남아 있는 세포를 수집 하려면 우물에 PBS의 200 μ를 추가 하 고 단계 5.3.1에서에서 튜브로 전송 합니다.
- 셀 E DMEM 한번 (337 x g에서 원심 분리기)의 1 mL을 5 분, 발음 그리고 세척 상쾌한 삭제), E-DMEM의 100 μ와 resuspend 및.
- (Trypan 블루 제외 메서드를 사용 하 여) 라이브 셀의 수를 계산, 1.6 x 105 셀/mL (= 4 x 103 셀/25 μ), 밀도 조정 하 고 얼음에 셀을 계속.
- Resuspend+ T pipetting, 전송 부동 CD8 철저 하 여 96 잘 접시 (4.5 단계)의에 셀 새로운 1.5 mL 튜브에 세포.
- 5.1 단계에서 격판덮개의 각 우물에서 지하실 멤브레인 매트릭스 발음
- 각 잘으로 대상 셀 (5.2.4 단계)의 1 x 103 셀/50 μ를 추가 하 고 잘 혼합.
참고: 잘 매체, 96의 내부 60 우물만의 증발 때문에 지 효과 피하기 위해 접시는 분석을 위해 사용 될 해야 합니다. - 25 μ E DMEM 4 x 103 U/mL 일리노이-2와 10 μ M fluorogenic caspase 3 기판 ( 테이블의 자료를 참조)를 포함 하 여의 추가 합니다.
- 4 x 103 셀/25 μ CD8의 추가+ T 세포 (단계 5.3.4)에 우물에 적절 한와 섞어 잘.
참고: 잘에서 너무 많은 세포의 존재 때문에 분석 더 어렵다. 이 모델, 4:1 이펙터: 대상 비율 (총 셀 번호 5 x 103 셀/잘) 최적 이었지만 8:1 비율 차선. 웰 스는 다음과 같은 네 개의 컨트롤을 포함 하는 데이터 분석을 원조 하는 데 필요한: 셀 공동 문화 웰 스 (1 x 103 셀/잘) 매체와 caspase 3 기판 없이 사용 밀도에서 이펙터 (1 x 103 셀을 대상 / 잘)와 caspase 3 기판 없이 매체에. - 실험적인 우물에서 매체의 증발을 줄이기 위해 모든 빈 우물 (접시의 주변에서 특히 우물)에 PBS 또는 살 균 물 200 μ를 추가 합니다.
- 37 ° C, 습도 95%, 5% CO2에서 유지 되는 시간 경과 형광 현미경으로 접시를 설정 합니다.
참고: 균등 모든 셀, 크로스-패턴에 접시를 흔들어 고 인큐베이터에 전송 하기 전에 10-20 분에 대 한 평평한 표면에 실내 온도에 유지 하는 접시.
6. 셀의 이미징
참고: 자세한 이미지 수집 설정 현미경 및 사용; fluorophores 달라 집니다. 다음 일반 인수 매개 변수는 최적의 결과 대 한 고용 한다.
- 현미경에 적합 한 자동 루틴을 사용 하 여, 96 잘 접시의 각 실험 잘에서 총 면적의 적어도 25%를 덮고 이미지 획득.
- 현미경 단계 대조로 형광 채널 제한 핵 빨간 형광 성 단백질 (mKate2)에 대 한 적합 한 이미지를 설정 하 고 녹색 fluorogenic에 대 한 적합 한 형광 채널 활성화 (caspase 3 기판 여기에서 488 nm) (그림 2).
- 단계 대조에 적어도 72 h에 대 한 모든 1 ~ 3 h 2 형광 채널 실험 우물에서 이미지를 캡처하십시오.
7. 이미지 분석 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여
참고: 자세한 이미지 분석 설정을 사용 하는 소프트웨어와 함께 달라 집니다 ( 테이블의 자료를 참조); 최적의 결과 대 한 다음과 같은 일반적인 분석 절차를 채택 한다.
- 스펙트럼 확인 취소 혼합 분리 형광 신호에서 대상 셀 핵에서 방출 되는 apoptotic 핵에서 방출 되 고 필요한 경우이; 분석 프로토콜을 설정 하는 데 필요한
- 보기 컨트롤 잘만 대상 세포 (mkate2 표시 된) 녹색 형광 채널에서 caspase 3 기판 없이 매체에 포함 된.
- 녹색 형광 적색 핵 (핵 표시 녹색)에 의해 방출 되는 여부 관찰
- 핵에서 녹색 형광 이면 액세스 이미징 소프트웨어에 스펙트럼 unmixing 제어 및 녹색에서 녹색 신호 사라질 때까지 제거 하는 빨간색의 비율 증가 (우리의 경험에서는, 이것은 일반적으로 밝은 mKate2에 대 한 6-7% 형광)입니다.
- 녹색 형광 어떤 핵에서 명백 하지 않으면 아무 스펙트럼 unmixing은 필요 합니다.
참고:이 스펙트럼 unmixing 보정 테스트 또한 매체 포함 된 caspase 3 기판에에서 대상 셀의 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 통해 형광 보다는 caspase 3 출혈의 활성화 때문에 녹색 형광을 방출 하는 몇 가지 대상 셀 핵 인 대상 세포 (10% 미만), 자발적인 apoptosis의 매우 낮은 수준이 이다. 통해 진정한 형광 흘릴 때 녹색 형광은 모든 핵에서 이러한 조건 하에서 분명 하다. - 빨강 및 녹색 채널에 caspase 3 기판 없이 매체에 잘만 효과 기 세포 (핵 레이블 없음)를 포함 하는 컨트롤을 개별적으로 볼.
- 녹색 또는 빨간색 형광 핵에 의해 방출 되는 여부를 관찰 합니다. 빨간색도 녹색 형광은 개별 채널에 아무 스펙트럼 unmixing 경우 필요.
참고: 우리의 경험, CD8 마우스에서+ T 세포는 자동 형광 이며 따라서 아무 스펙트럼 unmixing이 세포에 필요한. 이 스펙트럼 unmixing 보정 테스트 매체 포함 된 caspase 3 기판에에서 효과 기 세포의 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 자발적인 apoptosis caspase 3의 활성화 때문에 녹색 형광을 방출 하는 이펙터 세포 핵에 결과의 몇 가지 수준이 이다. 통해 진정한 형광 흘릴 때 녹색 형광은 모든 핵에서 이러한 조건 하에서 분명 하다.
- 형광 두 채널에 형광 개체를 해결 하려면 샘플에 대 한 관련 매개 변수 형광 배경 빼기 메서드 (예: TopHat)를 사용 합니다.
참고: 녹색 채널에 우리 사용 TopHat (핵 반지름 = 10.0 µ m, 녹색 형광 임계값 = 0.7 녹색 교정 단위). 빨강 채널에서 TopHat 사용 (핵 반지름 = 10.0 µ m, 빨간색 형광 임계값 = 0.5 레드 보정 단위). - 가장자리-분할에 대 한 적절 한 매개 변수를 사용 하 여 개별 형광 핵 해결.
참고: 우리가 가장자리에 녹색 또는 빨간색 형광 채널 분할을 사용 하지 않았다. - 이미지를 사용 하 여 대상 핵의 최소 크기를 결정 (caspase 기판)와 대상 셀만 포함 하는 우물에서 빨강 채널에서.
참고: 우리는 80 µ m2를 사용합니다. - Apoptotic 이펙터 핵의 평균 크기를 결정 (caspase 기판)와 이펙터 셀만 포함 하는 우물에서 녹색 채널에서 이미지를 사용 합니다.
참고: 단일 apoptotic 이펙터 핵이이 실험에서 40-80 µ m2 에서 배열 했다. - (예를 들어, 최소 공간, 최소 직경) 적절 한 최소 크기 제한을 사용 하 여 형광 대상 세포 핵의 수를 계산 하는 분석 절차 설정 (그림 2, 대상 검출 마스크).
참고: 우리가 사용 하는 최소 핵 지역 (레드 형광) = 80 µ m2. - Apoptotic 핵 apoptotic 이펙터 핵 (그림 2, 크기 제한 apoptosis 마스크)의 평균 크기 보다 큰 수를 계산 하는 분석 절차를 설정 합니다.
참고: 크기 필터 80 µ m2 로 설정 (즉, 유일한 지역 녹색 형광이이 크기 보다 큰의 세어 졌다, 따라서 단일 apoptotic 이펙터 핵을 제외). 이러한 매개 변수를 사용 하 여 apoptotic 효과 기 세포의 일부 집계 계산 될 수 있지만 apoptotic 대상 셀 핵 계산에서 분석의 정확도 증가 한다. - 분석 절차를 설정 apoptotic 대상 셀 의 수를 계산 하는 핵을 계산 하 여 어디 (에서 단계 7.6) 빨간 형광 신호 및 (단계 7.7)에서 녹색 형광 신호 크기 제한 크게 공동 지역화 (그림 2, R /G 중복 마스크)입니다.
참고: 적절 한 공동 지역화 대상 핵의 평균 크기의 100%를 30%에서 범위 수 있습니다. 오버랩 크기 필터 40 µ m2로 설정 되었습니다. - 전체 시간에 걸쳐 apoptotic 대상 세포 핵의 수 뿐만 아니라 각 실험 조건에 대 한 우물에 대상 세포 핵의 수를 결정 합니다.
8. 데이터 분석 사용 하 여 계산 하 고 그래프 소프트웨어
- Apoptotic 대상 셀 핵 실험 웰 스에 대 한 전체 시간에 걸쳐 단계 7.9에서에서 얻은 수 그래프. 각 실험 조건에 대해 여러 우물 사용, 그래픽 결과 ± 표준 편차 의미를 제시.
- 각 잘 각 잘 각 시간 지점에서 대상 셀의 수에 의해 apoptotic 세포의 수를 분할 하 여 대상 셀의 인구는의 apoptotic 분수를 계산 합니다.
- 8.2 단계에서 얻은 결과 그래프.
- 각 곡선 (AUC) 곡선 아래의 영역을 결정 합니다. 원하는 경우 각 곡선의 모집단의 피크 apoptotic 분수 또한 피크 발생 시간 포인트 뿐만 아니라 결정 될 수 있습니다. 실험 조건에 대 한 결정 AUC 크게 다른 적절 한 통계적 테스트를 사용 하 여 여부를 결정 합니다.
참고: 웰 치의 보정으로 짝이 없는 t-검정 AUC 결과에 적용 되었습니다.
Representative Results
이 메서드는 대상 암 세포 effector CD8+ T의 간단한 공동 문화 기반 셀 억압 셀 안티-CD3/CD28 활성화 항 체의 존재 유무에 관계 없이 미리 배양 되어 있다. CD8 검색+ 공동 문화에 따라의 CD8 세포 독성에 억압 셀의 효과의 평가 활성화 시간이 지남에 T 세포 이용한 암 세포 apoptosis+ T 세포.
일반적으로, 암 세포 증가 그들의 핵에서 녹색 형광 핵 타겟팅 caspase 바이오 센서의 활성화에 따라 때 이러한 세포 CD8 접촉+ T 세포 항 체 억제 세포 (부재에서 여 전 활성화 그림 3; 보충 영화 1)입니다. Caspase 기판에서 녹색 형광 apoptosis 시작 된 후 적어도 15 h에 대 한 감지 했다. + T effector CD8의 몇 가지 자발적인 apoptosis이이 세포 분리 (그림 4; 경작 했다 경우에 세포도 시간이 지남에 따라 관찰 되었다 보충 영화 2). 그러나, 핵 크기 CD8의+ T 세포는 암 세포 보다 작은 및 따라서 apoptotic '이펙터' 셀에서에서 제외할 수 있습니다 '대상' 셀 계산 apoptotic 메서드에서 크기 제한 이미지 분석 (그림 2 및 그림 4). 비록 일부 대상 암 세포 표시 없이 녹색 형광 작은 둥근된 모양,이 영향을 주지 않습니다 분석 이러한 세포 apoptosis (보충 영화 3), 보다는 오히려 유사 분열을 겪고 있다 고 따라서 apoptotic '대상'에서 제외 됩니다. 셀 레드/그린 오버랩 마스크 (보충 그림 2)에 의해 계산 됩니다. 대상 암 세포의 자발적인 apoptosis는 단일 문화 (보충 영화 3)에 가끔 발견 된다. 그러나, 대상 암 공동 문화와 전 활성화 한 CD8 세포+ T 세포가 암 세포 (그림 4)의 단에 자발적인 apoptosis 수준 이상의 증가 된 종양 세포 apoptosis. 일반적으로, 효과 기 세포를 대상 암 세포의 최적 비율을 사용 하 여, 피크 apoptotic 대상 암 세포의 수를 관찰할 수 있습니다 (그림 5A). 이 피크는 더 뚜렷한 데이터 (그림 5B) 타깃 셀의 apoptotic 분수로 표현 되는 때입니다. 이 실험에서 대상 종양 세포의 기저 apoptosis 24 h에 정점 (apoptotic 분수 = 0.08), CD8 하지만+ T 세포 유도 된 apoptosis 17 h에서 최대 수준에 도달 (apoptotic 분수 = 0.66).
우리 더 발견 CD8+ T 셀 MAMs 또는 M-MDSCs incubated 미리 만들 수 있는 대상 암 세포와 접촉 하지만이 연락처 CD8에 비해 암 세포 apoptosis의 적은 경우에 발생 하는 듯+ T 세포는 전 하지 않고 활성화 억제 세포 (그림 3 및 그림 4; 보충 영화 4와 보충 영화 5). 비록는 CD8+ T 전 골수성 세포와 때때로 incubated 세포 암 세포 apoptosis 유도, 거기 또한 apoptosis의 시간 과정을 자극 하지 대상 암 세포의 일부 확산은 실험 (보충 영화 6)입니다. 이러한 결과와 일치, 피크 분수 apoptotic 세포의 CD8과 교양+ T 세포 전 골수성 세포와 인 큐베이 팅 (apoptotic 분수 MDSC와 20 h 0.25 맘-e 23 h 0.38 =) 암 세포의 그것 보다 훨씬 낮은 CD8와 교양+ T 세포 억제기 세포 (그림 6)와 함께 미리 incubated 되지 않은.
그림 1: 실험 절차를 보여주는 계획. 순진한 비장 CD8+ T 세포 또는 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs) 없이 안티-CD3/CD28 활성화 항 체와 교양 또는 monocytic-골수성 파생 억제기 세포 (M-MDSCs). 4 일 후, CD8 부동+ T 세포를 수집 하 여 fluorogenic caspase 3 기판의 암 세포를 대상으로 공동 경작. Apoptotic 암 세포 실시간 형광 현미경에서 검출 된다. 표시 된 이미지는 라이브 셀 이미징 플랫폼을 사용 하 여 인수 했다 ( 테이블의 자료를 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: apoptotic 대상 셀 apoptotic effector 세포에서 별개의 식별. 빨강 채널에서 상위 행: 이미지 수집 대상 검출 마스크 (핑크 분석 마스크) 대상 세포 핵의 식별 수 있습니다. 가운데 행: 이미지 녹색 채널에 인수 apoptotic 이펙터 및 대상 셀을 나타냅니다. Asize 제한 된 apoptosis 마스크 (청록 분석 마스크; 보다 큰 80 µ m2) 단일 apoptotic 효과 기 세포는 분석에서 제외 될 수. 아래쪽 행: 합성 이미지 병합 된 레드와 위상 대비 이미지 (왼쪽)와 빨강/녹색 녹색 채널 중첩 마스크 (오른쪽). 빨간 형광 (노란색 분석 마스크)와 함께 공동 지역화, 크기 제한 녹색 형광의 식별 apoptotic 효과 기 세포 (흰색의 집계를 제외 하 여 대상 핵 (노란색 화살표) apoptotic의 더 정확한 탐지를 허용 화살촉)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
CD8 사이 상호 작용 그림 3:+ T 세포와 암 세포. E0771 LG_NLR 대상 세포 (T) 공동 effector CD8과 교양의 대표적인 시간 경과 영화에서 스틸+ T 세포 (E) 이펙터/대상 4:1 비율에. MDSC와 맘 E effector 세포 미리 incubated M MDSCs와 MAMs 각각 나타냅니다. 복합 이미지 (를 포함 하 여 단계 대조, 빨간색과 녹색 채널에서 이미지)이 표시 됩니다. 화살촉은 다른 필드와 시간 포인트를 통해 동일한 셀 추적 하 고 있다. 노란색 화살표: 이펙터와 연결 하 고 apoptosis, 흰색 화살표를 겪 습 대상: 이펙터 연결 하지만 apoptosis를 받아야 되지 않습니다 대상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: apoptotic 세포의 탐지. 대표적인 필드 이미징 후 18 h에서 시간 경과 영화에서 추출. 복합 이미지 (왼쪽; 단계 대비, 빨간색과 녹색 채널) 및 빨강에서 이미지 (가운데) 없이 채널 또는 레드/그린 (오른쪽) 중복 마스크 (노란색) 표시 됩니다. 오른쪽 열에 노란색 점 apoptotic 세포를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: CD8+ T 세포 이용한 암 세포 apoptosis. (A) 수 이펙터 C8와 교양된 apoptotic 세포의+ T 세포 대상 비율 (E:T) 다른 이펙터에. 타깃 셀의 (B) Apoptotic 분수. 데이터는 의미 ± sd. 평균 영역 (AUC) 곡선 아래 표시 됩니다. T홀-웰 치의 교정 시험 AUC 분석 하는 데 사용 되었다. * P < E:T에 비해 0.0001 = 0:1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 효과 종양 침투 골수성 세포의 CD8 세포 독성에+ T 세포. Apoptotic 세포의 (A) 수 (대상: T) C8와 교양+ T 세포 (effector: E) E:T 비율의 4: 1에. CD8+ T 세포 미리 부재 (검은 원) 또는 monocytic-골수성 파생 억제기 세포의 존재에 교양 있었다 (MDSC e: 블루 원) 또는 전이 관련 된 대 식 세포 (맘-e: 빨간색 동그라미). 데이터는 타깃 셀의 ± sd (B). Apoptotic 분수. 데이터는 의미 ± sd. 의미 AUC도 표시 됩니다. T홀-웰 치의 교정 시험 AUC 분석 하는 데 사용 되었다. * P < 0.0001 T에 비해, #P < E + 토니에 비해 0.0001 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1입니다. 전이성 폐암에서 억압 셀을 제어 전략. (A) 대표 점 monocytic 파생 골수성 억압 셀 (M MDSCs) 및 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs) 분리 플롯. Ly6C 레벨 MAMs (Ly6C낮은)와 M-MDSCs (Ly6C높은) 구별을 임계값은 주민 치경 대 식 세포 (RMAC)의 기반으로 합니다. 정렬 된 M-MDSCs의 (B) 순도 (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6C높은)와 MAMs (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6C낮은). 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2입니다. Mitotic 대상 셀의 대표 이미지입니다. E0771 LG_NLR 대상 셀 모노 문화의 대표적인 시간 경과 영화에서 스틸. 상위: 복합 이미지 단계 대비, 빨간색과 녹색 채널에서 이미지를 포함 한. 하단: 복합 이미지 (빨강과 녹색 채널) 빨강/녹색 중복 마스크. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 3입니다. CD8의 확산에 골수성 세포 종양 침투의 효과+ T 셀. (A) 대표 히스토그램에 CD8 CFSE와 형광 라벨의 희석을 보여주는+ T 세포. 순진한 비장 CD8+ T 세포 격리 프로토콜-3에 설명 된 대로 되었고 CFSE의 15 분 동안 37 ° C에서 5 µ M으로 표시. 레이블이 T 세포의 존재에 일리노이-2 교양 및 안티-CD3/CD28 프로토콜 4에 설명 된 대로 또는 골수성 세포 없이 항 체를 활성화 했다. 4 일 후, T 세포에서 녹색 형광 교류 cytometer에서 검색 되었습니다. (B) CD8의 분할 인덱스+ T 세포는 앞에서 설명한17로 계산. 데이터는 의미 ± SEM. * P < 0.01 제어, #P에 비해 < αCD3/CD28 Ab.에 비해 0.05 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 1입니다. 그림 3과 4;의 영화 E + T. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 2입니다. 그림 3과 4;의 영화 이펙터 (E)입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 3입니다. 그림 3과 4;의 영화 대상 (T)입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 4입니다. 그림 3과 4;의 영화 MDSC E + T. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 5입니다. 그림 3과 4;의 영화 엄만 E + T. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 6입니다. 그림 3과 4;의 영화 엄만 E + T (확산). 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 메서드는 두 별도 공동 문화 단계에 따라: 잠재적인 억압 셀+ T 세포 CD8 공동 경작 하 고 대상 종양 세포 (그림 1)+ T 세포 '사전 조건된' CD8 공동 경작. 첫 번째 공동 문화 단계는 매우 비슷합니다 CD8에 대 한+ T 세포 확산 분석 실험 일반적으로 CD8에 억압 셀의 효과 결정 하는 데 사용+ T 세포 기능. 그러나, T 세포 확산 그들의 세포 독성와 항상 연결 되지 않습니다. 예를 들어 우리 M-MDSCs 또는 MAMs 공동 문화 발견 CD8의 감소 확산 보다 증가 반면 이러한 사전 CD8 단련 CD3/CD28 항 체 (보충 그림 3), 활성화의+ T 세포+ T 세포 증명 대상 암 세포 (그림 4, 그림 5, 그림 6)에 대 한 세포 독성을 감소. 대상 암 세포 apoptosis,이 CD8에 의해 제공에 의해 입증 기능 활동의 평가의 중요성을 강조 하는이 결과+ T 세포 세포 독성 분석 실험.
이 분석 결과에서 그 CD8 확인 했습니다+ T 세포 E0771-LG 마우스 유 방 종양 세포 (그림 5)의 최대 apoptosis를 유도 하기 위하여 공동 문화의 약 15 h 필요. 이 지연 caspase 3 (보충 영화 1의 활성화에 의해 측정 대상에 apoptotic 신호를 유도 하는 데 필요한 시간 뿐만 아니라 목표와 함께 면역 시 냅 스 형성, 효과 기 세포의 초기 접촉 사이 지연 때문일 수도 있습니다. ). 우리는 또한 apoptotic 종양 세포의 수는 T 세포에 의해 대상의 제거 및 죽은 세포에서 형광 신호의 손실 때문에 아마 이다 24 h 후 고원에 도달을 발견. 피크 apoptosis의 시간을 식별 하기 위해이 기능은 최적의 시간 포인트의 결정에 중요 하므로 다른 조건 사이 적절 한 비교가 분석이 결과의 주요 장점 중 하나입니다. 우리의 경우 예를 들어+ T 제어 CD8 세포 독성에 차이가 세포와 CD8 MDSC/맘 교육+ T 세포에서 15-18 h 72 h (그림 5)에 비해 훨씬 더 큰 되었고 따라서 끝점 72 h 잠복기를 사용 하 여 실험 잘못 된 결과 얻을 것 이다.
이 메서드는 또한 CD8의 제한 된 세포 독성을 기본 메커니즘에 대 한 더 큰 통찰력을 제공 하는 실시간 이펙터 목표 셀 상호 작용의 시각화를 통해+ T 세포 중 억제기 세포 incubated. 예를 들어 우리가 관찰 CD8+ T 세포 중 M-MDSCs 또는 MAMs incubated 발생 및 대상 종양 세포와 상호 작용 하지만 항상 apoptosis (보충 영화 4, 보충 영화 5, 보충 영화 6) 유도 하지 않았다. 비록 우리가이 이벤트를 계량 하지 않았다, 그것은 가능 하 고 계량 하 여 남과 apoptosis 유도 상관 관계에서 그들의 상호 작용 시간의 비율을 비교 흥미로운 것입니다. 또 다른 주요 장점은이 방법은 적은 수의 셀 (예: 1 x 103 대상)과 4 x 103 잘 당 효과 기 세포의 요구. 사실,이 프로토콜 수 수 더 소형화 384-잘 플레이트 형식에 대 한 원하는 경우. 따라서,이 분석 결과 어디 셀 숫자는 제한 또는 vivo 샘플 ex vivo에서에서 파생 된 생체 외에서 귀중 한 셀을 사용 하 여 테스트와 같은 높은 처리량 검열 그리고 실험에 적합 합니다.
다른 한편으로, 현재 분석 결과의 제한 일부 조건에서 죽은 효과 기 세포의 중요 한 숫자의 존재 이다. 대상 암 세포의 apoptosis effector CD8의 구별에 정확도 증가 하기 위하여+ T 세포, 셀 표시 대상의 핵과 핵 크기 제한 (그 이펙터 셀 제외)이 데이터 분석에 대 한 적용 분석 결과 (그림 2)입니다. 그러나, 오버레이 (녹색) apoptotic CD8의 집계의+ T 결과 혼동 수 있습니다 비-apoptotic 대상 암 세포에 세포 경우가 있습니다. 이 제한 effector 세포 전에 공동 대상 종양 세포, 효과 기 세포의 충분 한 숫자를 사용할 수 있습니다 가정 문화에서 죽은 세포 제거 열 사용 하 여 완화 될 수 있습니다. 더 복잡 한 현미경 시스템, 또한 수 있습니다 라벨 effector CD8 거짓 긍정적인 신호를 줄이기 위해 대상 셀 핵 및 fluorogenic caspase 3 기판에서 fluorophore와+ T 세포.
이 프로토콜은 CD8 항 일반적인 활성화 조사 이용 되어 지금까지+ T 세포. 비록 MDSCs 및 종양 microenvironment에서 Tam 항 원 비 관련 메커니즘을 통해 T 세포 기능을 억제, 주변 림프 조직에서 MDSCs 억제 T 세포 응답 항 원 특정 방식으로18. CD8를 사용 하 여 생체 외에서 확산 분석 결과 같은 종류의 세포, 면역 진압 기능 조사 OT-1에서+ T 세포 유전자 변형 쥐를 일반적으로 사용 됩니다. 이 분석 결과에서 OT-1 T 세포 (ovalbumin (OVA) 특정 T 세포 수용 체를 표현 하는) 공동 교양 억압 MDSCs OVA 펩 티 드, 앞으로 우리의 세포 독성 분석 결과에서 첫 번째 문화에 대 한 적용 (즉,., T의 활성화 세포 존재 또는 진압의 부재)입니다. 그것은 또한 OVA, OT-1 T 세포 항 원 특정 암 세포 살해를 일으킬 수 있는 표현 대상 암 세포 조작 가능. 따라서, 분석 결과 또한 항 원 특정 T 세포 활성화의 어머니/MDSC 중재 억제의 조사를 하면 수 있습니다. 그것은 또한 인간의 세포에 대 한 인간의 CD3 CD28 항 체 활성화는 상용, 고 임상 샘플에서 인간의 Tam을 프로토콜 설립된19되었습니다 조사를 분석 결과 적용 하.
공동으로,이 분석 결과 매우 다양 한 이며 다른 면역 세포 유형의 세포 독성 검사를 사용할 수 있습니다. 현재, 우리의 실험실에서 다양 한 조건에서 항 원-종속 셀 세포 독성 검사를 확장 하 고 심사도 높은 처리량에 대 한 개발 되 고 키를 누릅니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), 영국), Wellcome 신뢰와 MRC (미스터/N022556/1 (JWP, TK), 영국)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. NOC와 DDS 인정 국가 Phenotypic 심사 센터 Phenomics 발견 이니셔티브 및 암 연구 영국 (NOC)에서 지원
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| 12-Well Cell Culture Plate | Freiner Bio-One | 665-180 | |
| 1x PBS | Gibco | 14190-094 | |
| 2-mercaptethanol | Sigma | M6250-10ML | |
| 5mL Plystyrene Round-Bottom Tube | FALCON | 352054 | |
| 96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom ) | Costar | 3799 | Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells |
| 96-well plate (Flat bottom) | Nunc | 165305 | Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay |
| AF647 anti-mouse F4/80 Antibody | BIO-RAD | MCA497A647 | Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1x10^6 cells |
| AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody | Biolegend | 100730 | Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102111 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340 |
| anti-mouse CD3e Antibody | Biolegend | 100314 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720 |
| APC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100236 | Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody | Biolegend | 128026 | Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 cells |
| Bovine Serum Albmin | Sigma | A1470-100G | |
| Cell Strainer (100μm Nylon) | FALCON | 352360 | To smash the spleen |
| Cell Strainer (40μm Nylon) | FALCON | 352340 | To filter the lung digestion |
| DAPI | Biolegend | 422801 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium | Gibco | 41966-029 | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell Technologies | 19853 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100406 | Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| Geltrex Ready-to-Use | Gibco | A1596-01 | Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay |
| IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent | Essen BioScience | 4476 | Lenti viral particules encoding mKate2 |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | Detector (fluorescence microscope) | |
| IncuCyte ZOOM 2018A | Essen BioScience | Analysis software | |
| L-Glutamine (100X) | Gibco | A2916801 | |
| Lung Dissociation Kit | Miltenyi | 130-095-927 | Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| Non-essential amino acid (100X) | Gibco | 11140-035 | |
| NucView488 | Biotium | 10403 | Fluoregenic caspase-3 substrate |
| PE anti-mouse Ly6G Antibody | Biolegend | 127607 | Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody | Biolegend | 101216 | Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | Penicillin Streptomycin for primary culture of cells |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103132 | Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 cells |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268 | |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Recombinant murine IL-2 | Peprotech | 212-12 | Activation of isolated CD8+ T cells |
| Sodium pyruvate (100X) | Gibco | 11360-070 | |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 101320 | |
| : Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm) : Green channel excitation: 440 - 480 nm : Green channel emission: 504 - 544 nm : Red channel excitation: 565-605 nm : Red channel emission: 625 - 705 nm |
|||
References
- Barry, M., Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).
- Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9. , 14 (2018).
- Tanaka, A., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in cancer immunotherapy. Cell Research. 27, 109-118 (2017).
- Fleming, V., et al. Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression. Frontiers in Immunology. 9, 398 (2018).
- Cassetta, L., Kitamura, T. Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy. Immunology. 155, 285-293 (2018).
- Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates. Methods. 31, 120-126 (2003).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).
- Azimi, M., et al. Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells. Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).
- Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions. Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).
- Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4, e6562 (2009).
- Kitamura, T., et al. Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer. Frontiers in Immunology. 8, 2004 (2018).
- Bronte, V., et al. Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards. Nature Communications. 7, 12150 (2016).
- Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).
- Choppa, P. C., et al. Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome. Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , Appendix 3:Appendix 3B (2001).
- Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).
- Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).
- Cassetta, L., et al. Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages. Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).
