Biz burada pre-harekete geçirmek CD8 sitotoksisite araştırmak için bir protokol tarif+ T hücreleri kanser hücrelerine karşı apoptotik kanser hücreleri aracılığıyla gerçek zamanlı mikroskobu tespit ederek. Bu protokol mekanizmaları myeloid hücre kaynaklı T hücre bastırma arkasında araştırmak ve T hücreleri ile abluka bağışıklık baskılayıcı myeloid hücre yenileyici amaçlı bileşikler değerlendirmek.
CD8 tümör-öldürme yeteneğini kullanılmasının muhtemelen+ T hücre tümörleri, onların verimli tümör infiltrasyonu ile birlikte başarılı immunotherapies temel unsur olduğunu. Çeşitli çalışmalarda tümör infiltre myeloid hücrelerin (örneğin, elde edilen miyeloid bastırıcı hücreleri (MDSCs) ve tümör ilişkili makrofajlar (TAMs)) CD8 sitotoksisite bastırmak belirttiler+ T hücreleri tümör microenvironment ve bu hedefleme Bu düzenleyici myeloid hücrelerin immunotherapies artırabilirsiniz. Burada, bir tüp bebek tahlil sistem bağışıklık baskılayıcı etkileri Monositik MDSCs ve TAMs CD8 tümör-öldürme yeteneğini değerlendirmek için mevcut+ T hücreleri. Bu amaçla, ilk saf kültürlü dalak CD8+ T hücreleri ile anti-CD3/CD28 aktive antikorlar bastırıcı hücreleri içinde ve hedef kanser hücrelerinin bir fluorogenic huzurunda pre-harekete geçirmek T hücrelerle birlikte kültürlü caspase-3 alt katman. Floresans kanser hücrelerinin içinde belgili tanımlık substrate üzerinden gerçek zamanlı floresans mikroskobu tarafından indüklenen T hücreli tümör hücre apoptosis bir göstergesi olarak algılandı. Bu tahlil başarıyla tümör hücre apoptosis CD8 tarafından artış algılayabilir+ T hücreleri ve onun bastırma TAMs veya MDSCs öncesi kültür tarafından. Bu işlev tahlil CD8 soruşturma için yararlıdır+ T hücre bastırma mekanizmaları düzenleyici myeloid hücrelerin ve yüksek işlem hacmi tarama yolu ile üstesinden gelmek için tanımlayıcı druggable hedefler.
Bu bilinen bu CD8+ T hücreleri ne zaman onlar onların tam sitotoksisite sarfetmek tümör hücreleri ortadan kaldırabilirsiniz. T hücre reseptör (TCR), CD8 aktivasyonu sonra+ T hücreleri çoğalırlar ve sitotoksik efektör hücrelere ayırt etmek. Genişletilmiş ve aktif CD8+ T hücre sitotoksik tanecikler, perforin ve granzymes, hedef hücrelere aktarılır ve caspase-3 apoptosis1aracılı gibi çeşitli litik yollar başlatmak da dahil olmak üzere salgılar. CD8+ T hücreleri da teşvik tümör hücre apoptosis reseptörleri tümör nekrozis faktör-α (TNF-α), için gibi hedef hücrenin üzerinde reseptörleri aktive ederek ligand (FasL) veya apoptosis indükleyici ligand (iz) TNF ile ilgili ilk apoptosis sinyal. Ayrıca, aktif CD8+ T hücreleri salgılar interferon-γ (IFN-γ) tümör hücre çoğalması bastırmak ve tümör hücreleri CD8 için duyarlılığını artırmak+ T hücreleri ile up-regülasyon FasL reseptör1. Potansiyel CD8 için verilen+ T tümör öldürme yeteneği, onların sitotoksisite (örneğin, denetim noktası inhibitörleri, kanser aşısı ve T hücreleri ifade chimeric antijen reseptör (araba) evlat edinen transferi) artırmak için çeşitli stratejiler kurulan ve kanser2belirli türleri üzerinde gösterilen önemli terapötik etkileri. Ancak, kanıt biriken tümör infiltre bağışıklık hücreleri düzenleyici T hücreleri gibi miyeloid kaynaklı bastırıcı (MDSCs) hücreleri ve makrofajlar (TAMs) tümör ilişkili CD8 bastırmak öneriyor+ T hücre fonksiyonları ve etkinliğini sınırlamak in immunotherapies3,4,5. Böyle immunotherapies geliştirmek için nasıl bağışıklık baskılayıcı hücreleri sınırı CD8 anlaşılması önemlidir+ T hücre sitotoksisite. CD8 tanımlaması+ T hücre bastırma mekanizmaları yanı sıra, üstesinden gelmek için druggable hedefleri geliştirme ve tüp bebek deneyleri kullanımını gerektirir.
CD8 ölçme altın standart yöntem+ T hücre sitotoksisite olduğunu krom yayın tahlil hangi hedef radyoaktif sonda (51Cr), sürümünden bu hücreleri CD8 tarafından lysed+ T hücreleri, kararlı6‘ dır. Ancak, bu tahlil nispeten düşük duyarlılık, yüksek arka plan, erken apoptotik olaylar, tehlikeli atık sorunları ve otomatik sıvı işleme ve desteklemek için algılama ile sınırlı uyumluluk algılamak için yetersizlik de dahil olmak üzere çeşitli sakıncaları vardır daha yüksek üretilen iş uygulamaları. Başka bir ortak akış sitometrik analizleri apoptosis hedef tümör hücrelerinin V7bağlama annexin tarafından tespit yöntemidir. Bu tahlil propidium iyodür (PI) veya 7-aminoactinomycin D (7-AAD) ve ek olarak7 hedef hücrelerde apoptosis CD107a veya CD69 ifade tarafından belirtilen efektör Hücre aktivasyonu kullanarak hedef hücre ölümü gibi diğer parametreleri algılamak mümkündür . Ancak, bu tahlil bastırıcı hücreleri krom yayın tahlil için karşılaştırıldığında çok sayıda gerektirir. Ayrıca dekolmanı ve yükünün yapisan hedef hücre gerektirir ve bu sonuçları önyargı. Nitekim, krom yayın tahlil veya akış sitometrik tahlil genellikle T hücre fonksiyonları üzerinde baskılayıcı hücre etkileri araştırmak için kullanılmaz. Bunun yerine, T-hücre çoğalması T hücreleri önceden yüklenmiş seyreltme floresan boya (örneğin, CFSE), tarafından belirtilen ölçü sık CD8 inhibisyonu değerlendirmek için kullanılır+ T hücre işlevi bastırıcı hücreleri tarafından. Algılama kültürlü T hücrelerinden IFN γ üretimin T hücre harekete geçirmek8,9bastırıcı hücreleri etkilerini değerlendirmek için başka bir standart yöntemdir. Ancak, bu deneyleri sonuçları mutlaka CD8 yeteneği öldürme hedef hücre aralarındaki ilişkileri belirlemektir değil+ T hücreleri.
Burada CD8 sitotoksisite bastırıcı hücreleri, özellikle metastatik tümörler, makrofajlar etkilerini değerlendirmek için alternatif bir işlevsel tahlil mevcut+ T hücreleri. Bu yöntem CD8 sitotoksisite belirler+ T hücreleri ile ya da ezelî anti-CD3/CD28 aktive antikorlar, huzurunda bastırıcı hücreler tümör hücre apoptosis, tespit ederek önceden kültürlü, floresan bir fluorogenic caspase-3 belirttiği substrat6’yı kullanan hızlandırılmış mikroskobu (Şekil 1) otomatik. Bu iletişim kuralı diğer yöntemlerine göre birçok avantajı vardır; Bu az sayıda hücre gerektirir, yapisan tümör hücre ölümü tespiti ile yüksek hassasiyet sağlar, gerçek zamanlı efektör hedef etkileşim olabilir görüntü ve yüksek işlem hacmi tarama için mükellef.
Bu protokol için metastaz ilişkili makrofajlar (analar) ve onların yaratıcı Monositik-farelerde metastatik tümörler izole MDSCs (M-MDSCs) bastırıcı hücreler kullanılır. Metastatik meme kanseri fare modellerinde makrofajlar farklı nüfusu ile karakterize F4/80yüksekLy6G–CD11byüksekLy6Cdüşük metastatik tümörler içeren akciğer biriken. Bu makrofaj nüfusun seyrek olarak normal akciğer bulmuş ve böylece metastaz ilişkili makrofajlar (analar)10aramış. Bu fare modellerinde, başka myeloid hücre tanımlanan nüfus, F4/80yüksekLy6G–CD11byüksekLy6Cyüksek, ayrıca biriken ağırlıklı olarak artış nerede verir analar11‘ e metastatik akciğer. Onların özelliklerine göre M-MDSCs12CD11byüksekLy6Cyüksek MAM progenitör hücre temsil edebilir.
Bu yöntem iki ayrı ortak kültür merdivenlerinde dayanmaktadır:+ T potansiyel bastırıcı hücrelerle hücreleri CD8 ortak kültür ve ‘ön şartına’ CD8 ortak kültür+ T hücreleri hedef tümör hücreleri (Şekil 1). İlk ortak kültür adım CD8 için oldukça benzer+ T hücre proliferasyon deneyleri bastırıcı hücreleri CD8 üzerindeki etkisini belirlemek için yaygın olarak kullanılan+ T hücre işlevi. Ancak, T hücre çoğalması her zaman onların sitotoksisite ile ilişkili değil. Örneğin, M-MDSCs veya analar bu ortak kültür bulduk CD8 azaltılmış yayılması yerine artış+ T hücrelerin CD3/CD28 varlığında antikor (ek şekil 3), aktive bunlar önceden CD8 şartına ise+ T hücreleri gösterdi azaltılmış sitotoksisite karşı hedef kanser hücrelerinin (resim 4 resim 5, Şekil 6). Bu sonuçlar fonksiyonel etkinlik, hedef kanser hücre apoptosis, bu CD8 tarafından sunulan kanıtladığı değerlendirilmesi önemini vurgulamak+ T hücre sitotoksisite tahlil.
Bu tahlil, biz o CD8 belirledik+ T hücreleri maksimum apoptosis E0771-LG fare meme tümör hücrelerinin (Şekil 5) teşvik için yaklaşık 15 h ortak kültür gerektirir. Bu gecikme efektör hücreler hedefleri ve eşlik eden bağışıklık synapse oluşumu gibi apoptotik sinyaller caspase-3 (takıma giren film 1 aktivasyonu tarafından ölçülen hedefleri de ikna etmek için gereken süre ile ilk temas arasında gecikme nedeniyle olabilir ). Biz aynı zamanda tespit apoptotik tümör hücrelerinin sayısı 24 h, T hücreleri tarafından hedefleri ortadan kaldırılması ve/veya ölü hücrelerden floresan sinyal kaybı nedeni olabilir sonra bir plato ulaşmıştır. Bir uygun zaman noktası tayini farklı koşullar arasında uygun karşılaştırmalar için önemli olduğundan en yüksek apoptosis zaman tanımlamak için bu yeteneği bu testin bir büyük avantaj sağlıyor. Örneğin, sitotoksisite+ T kontrol CD8 arasındaki farkı bizim durumumuzda hücreleri ve MDSC/MAM-eğitimli CD8+ T hücreleri, 15-18 h 72 h (Şekil 5) göre daha büyük ve böylece bir son nokta deney 72 h kuluçka dönemi’ni kullanarak yanıltıcı sonuçlar.
Bu yöntem ayrıca CD8 sınırlı sitotoksisite altta yatan mekanizma içine ilgili daha ayrıntılı bilgi sağlayan gerçek zamanlı efektör hedef hücre etkileşimin görselleştirme sağlar+ T hücreleri önceden bastırıcı hücreleri ile inkübe. Örneğin, biz bu gözlenen CD8+ T hücre M-MDSCs veya analar ile önceden inkübe karşılaştı ve hedef tümör hücreleri ile etkileşim ama her zaman apoptosis (Tamamlayıcı film 4, takıma giren film 5, takıma giren film 6) teşvik değil. Her ne kadar biz bu olay ölçmek değil, mümkün ve ölçmek ve karşılaştığında ve korelasyon apoptosis indüksiyon ile etkileşim zamanında oranı karşılaştırmak ilginç olurdu. Bu yöntem az sayıda hücreleri (örneğin, 1 x 103 hedef) ve 4 x 103 şey başına efektör hücrelerin gerektirir başka bir büyük avantaj sağlıyor. Aslında, bu iletişim kuralı daha fazla 384-şey plaka biçimini istenirse küçültülmüş. Bu nedenle, bu tahlil vitro test değerli hücreleri kullanarak türetilmiş içinde vivo veya ex vivo örnekleri gibi burada hücre sayıları sınırlı yüksek aktarım tarama ve deneyleri için uygun olmasıdır.
Öte yandan, bir sınırlama geçerli testin ölü efektör hücrelerde bazı koşullar önemli sayıda varlığıdır. Apoptozis hedef kanser hücrelerinin efektör CD8 bundan ayırt etme doğruluğu artırmak için+ T hücreleri, hedef hücreleri etiketlenir çekirdekleri ve (yani efektör hücreleri hariç) boyutu kısıtlamasını bu veri analizi için uygulanan bir çekirdek tahlil (Şekil 2). Ancak, bazı durumlarda nerede sonuçları yıkmak sigara apoptotik hedef kanser hücreleri, bindirme toplamları (yeşil) apoptotik CD8+ T hücreleri vardır. Bu sınırlama tarafından yeterli sayıda efektör hücrelerin hazır olduğunu varsayarsak hedef tümör hücreleri ile birlikte kültür efektör hücreler öncesinde bir ölü hücre kaldırma sütun kullanımı hafifletilmiş. Daha karmaşık mikroskobu sistemleriyle de efektör CD8 etiketleme tarafından yanlış olumlu sinyal azaltmak mümkün olabilir+ T hücreleri hedef hücre çekirdeği ve fluorogenic caspase-3 maddeyi ayrı bir fluorophore ile.
Şimdiye kadar bu iletişim kuralını CD8 antijen spesifik olmayan aktivasyonu araştırmak için kullanılan+ T hücreleri. Her ne kadar MDSCs ve tümör microenvironment TAMs T hücre fonksiyonları antijen spesifik olmayan mekanizmalar yoluyla bastırmak, periferik lenfoid dokulara MDSCs T hücre antijen belirli şekilde18yanıt-e doğru bastırmak. + T hücreleri OT-1 den böyle hücre tiplerinin bağışıklık baskılayıcı işlevleri CD8 kullanarak bir tüp bebek yayılması tahlil araştırmak için transgenik fareler yaygın olarak kullanılan. Bu tahlil (ovalbumin (OVA) belirli T hücre reseptör ifade) OT-1 T hücreleri ile bastırıcı MDSCs OVA peptidler, huzurunda ilk kültür bizim sitotoksisite tahlil için geçerli olduğu ortak kültürlü (i.e., harekete geçirmek-in T hücreleri varlığı ya da yokluğu bastırıcılarının). Hedef kanser hücrelerinin antijen spesifik kanser hücresi öldürmek OT-1 T hücreleri tarafından teşvik edebilirsiniz OVA ifade etmek için işlemek için uygulanabilirdir. Bu nedenle, tahlil Ayrıca antijen spesifik T Hücre aktivasyonu MAM/MDSC-aracılı bastırılması incelenmesi sağlayacaktır. İnsan hücreleri, insan CD3 ve CD28 karşı harekete geçirmek antikor ticari mevcuttur ve insan TAMs klinik örneklerinden izole etmek için bir protokol kurulan19oldu araştırmak için tahlil uygulamak mümkündür.
Toplu olarak, bu tahlil oldukça çok yönlü ve sitotoksisite diğer bağışıklık hücre tiplerinin incelemek için kullanılabilir. Şu anda, bizim labs, antijen-bağımlı hücre sitotoksisite çeşitli koşullar altında incelemek için genişletilmekte ve aynı zamanda yüksek üretilen iş için geliştirilen eleme.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser hibe Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) ve MRC (Bay N022556 1 / / (JWP, TK), UK) tarafından desteklenmiştir. NOC ve DDS Ulusal fenotipik eleme merkezi Phenomics bulma girişimi ve kanser araştırma İngiltere’de (NOC) destek kabul
0.05% Trypsin EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
12-Well Cell Culture Plate | Freiner Bio-One | 665-180 | |
1x PBS | Gibco | 14190-094 | |
2-mercaptethanol | Sigma | M6250-10ML | |
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube | FALCON | 352054 | |
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom ) | Costar | 3799 | Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells |
96-well plate (Flat bottom) | Nunc | 165305 | Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay |
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody | BIO-RAD | MCA497A647 | Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1×10^6 cells |
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody | Biolegend | 100730 | Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1×10^6 cells |
anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102111 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340 |
anti-mouse CD3e Antibody | Biolegend | 100314 | Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720 |
APC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100236 | Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1×10^6 cells |
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody | Biolegend | 128026 | Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1×10^6 cells |
Bovine Serum Albmin | Sigma | A1470-100G | |
Cell Strainer (100μm Nylon) | FALCON | 352360 | To smash the spleen |
Cell Strainer (40μm Nylon) | FALCON | 352340 | To filter the lung digestion |
DAPI | Biolegend | 422801 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium | Gibco | 41966-029 | |
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell Technologies | 19853 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
FITC anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100406 | Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Geltrex Ready-to-Use | Gibco | A1596-01 | Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay |
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent | Essen BioScience | 4476 | Lenti viral particules encoding mKate2 |
IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | Detector (fluorescence microscope) | |
IncuCyte ZOOM 2018A | Essen BioScience | Analysis software | |
L-Glutamine (100X) | Gibco | A2916801 | |
Lung Dissociation Kit | Miltenyi | 130-095-927 | Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
Non-essential amino acid (100X) | Gibco | 11140-035 | |
NucView488 | Biotium | 10403 | Fluoregenic caspase-3 substrate |
PE anti-mouse Ly6G Antibody | Biolegend | 127607 | Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1×10^6 cells |
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody | Biolegend | 101216 | Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | Penicillin Streptomycin for primary culture of cells |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody | Biolegend | 103132 | Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1×10^6 cells |
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268 | |
Puromycin | Gibco | A11138-03 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
Recombinant murine IL-2 | Peprotech | 212-12 | Activation of isolated CD8+ T cells |
Sodium pyruvate (100X) | Gibco | 11360-070 | |
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 101320 | |
: Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm) : Green channel excitation: 440 – 480 nm : Green channel emission: 504 – 544 nm : Red channel excitation: 565-605 nm : Red channel emission: 625 – 705 nm |