Summary
親和性金ナノ粒子は、多くの生物学的用途で使用することができる。リガンドのバイナリ混合物によって被覆された金ナノ粒子を合成するプロトコルと、これらの粒子の詳細な特徴付けが提示される。
Abstract
1-オクタネチオール(OT)と11-メルカプト-1-アンデカンスルホン酸(MUS)の混合物で覆われた金ナノ粒子は、細胞膜、脂質二重層、およびウイルスとの相互作用のために広範囲に研究されている。親水性リガンドは、これらの粒子を水溶液中でコロイド状に安定させ、疎水性リガンドとの組み合わせは、疎水性薬物を搭載し、脂質膜と融合し、非特異的に抵抗することができる両生性粒子を作成しますタンパク質吸着。これらの特性の多くは、ナノ粒子サイズおよびリガンドシェルの組成に依存する。したがって、ナノ粒子特性およびリガンドシェル組成物の決定を可能にする再現性の合成方法および信頼性の高い特性化技術を有することが重要である。ここで、1相化学的還元、続いて5nm未満の直径でこれらのナノ粒子を合成する徹底的な精製が提示される。ナノ粒子の表面上の2つのリガンド間の比率は、合成時に使用されるそれらの修弁量比を介して調整することができる。透過電子顕微鏡(TEM)、核磁気共鳴(NMR)、熱グラビメトリック解析(TGA)、紫外線可視(UV-Vis)分光法など、様々なルーチン技術を総合的に組み合わせる方法を示します。ナノ粒子の物理化学的パラメータを特徴付けする。
Introduction
金ナノ粒子のリガンドシェルは、生物医学1、2、3、4の課題に対処するために適用することができるいくつかの異なる特性を示すために設計することができる。このような汎用性は、ナノ粒子と生体分子5、6、7との間の分子間相互作用の制御を可能にする。疎水性と電荷は、ナノ粒子が生体分子5、8、9と相互作用する方法に影響を与える他の表面パラメータと同様に、決定的な役割を果たす。ナノ粒子の表面特性を調整するために、リガンドシェルを構成するチオレート分子の選択は、求められる特性に応じて無数の可能性を提供します。例えば、疎水性および親水性を有するリガンド分子の混合物(例えば、荷電)末結基は、多くの場合、親水性ナノ粒子10、11を生成するために使用される。
このタイプのナノ粒子の顕著な例は、多くの関連する特性12、13、14を有することが示されているOTおよびMUS(以下、MUS:OTナノ粒子と呼ばれる)の混合物によって保護される。まず、66%MUS(以下、66:34 MUS:OT)のリガンドシェル組成物を使用すると、ナノ粒子のコロイド安定性が高く、脱イオン水中の重量が最大33%に達し、リン酸緩衝生理食液(1x、4mMリン酸塩、150mM NaCl)15に達する。さらに、これらの粒子は比較的低いpH値で沈殿しない:例えば、pH2.3および1M NaCl15の塩濃度で、これらのナノ粒子は数ヶ月間コロイド状に安定したままである。リガンドシェル上の2つの分子間の検体比は、高いイオン強度16を有する溶液中のコロイド安定性を決定するので重要である。
これらの粒子は、エネルギーに依存しない経路1、12を介して、それをポーティングすることなく細胞膜を横断することが示されている。これらの粒子と脂質二層層との間の自発的な融合は、細胞膜17を介したそれらの拡散性の下にある。この相互作用の背後にあるメカニズムは、脂質二層層との融合時の疎水性溶媒アクセス可能な表面積と水分子との接触の最小化である18.全MUSナノ粒子(シェル上にMUSリガンドのみを有するナノ粒子)と比較して、混合MUS:OTナノ粒子(例えば、66:34 MUS:OT組成物)の高い疎水性は、脂質と融合できるコア径のスパンを増加させるバイレイヤー18.リガンドシェルの異なる自己組集合組織は、全MUS粒子19と比較した場合、アルブミンおよびユビキチンなどの様々なタンパク質を持つ66:34 MUS:OTナノ粒子の異なる結合モードに相関する。近年、66:34 MUS:OTナノ粒子は、MUSリガンドの多価静電結合およびOTリガンドの非局所結合によりウイルスを不可逆的に破壊する広範囲の抗ウイルス剤として利用できることが報告されている。タンパク質14.いずれの場合も、疎水性含有量、ならびにナノ粒子のコアサイズが、これらのバイオナノ相互作用がどのように起こるかを決定することがわかった。MUS:OTナノ粒子のこれらの多様な特性は、MUS:OT粒子と脂質二層層20などの様々な生物学的構造との相互作用を支えるメカニズムを明らかにすることを目的とした多くのコンピュータシミュレーション研究を促している。
MUS:OT保護Auナノ粒子の調製は、いくつかの課題を提起します。まず、帯電リガンド(MUS)と疎水性リガンド(OT)は不一致である。したがって、ナノ粒子およびリガンドの溶解性は、合成全体、ならびに特性化中に考慮する必要があります。さらに、MUSリガンド分子の純度、特に出発物質中の無機塩の含有量は、ナノ粒子の品質、再現性、ならびに短期的および長期的なコロイド安定性に影響を与えます。
ここでは、MUSとOTの混合物によって保護されたこのクラスの両生球性金ナノ粒子の詳細な合成および特徴付けについて概説する。負に帯電したMUSリガンドの合成のためのプロトコルは、純度を確保し、したがって、異なるナノ粒子合成の再現性を確保するために報告される。次いで、これらのナノ粒子を生成する手順を、一般的な1相合成に基づいて、続いて徹底的な精製を行い、詳細に報告される。TEM、UV-Vis、TGA、およびNMRなどの種々の必要な特性解析技術21は、さらなる生物学的実験に必要なすべてのパラメータを得るために組み合わされている。
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Protocol
1. 11-メルカプト-1-アンデカンスルホン酸塩(MUS)の合成
注: このプロトコルは、任意のスケールで使用できます。ここでは、10gのスケールの製品について説明する。
- ナトリウム undec-10-エネスルホン酸塩
- 11-ブロモ-1-アンデセン(25 mL、 111.975 mmol)、亜硫酸ナトリウム(28.75g、227.92 mmol)、およびベンジルトリエチランモニウム臭化物(10mg)をメタノール(MeOH)の200mLと450mLの脱イオン化(DI)水(4:9 v/v MeOH:H2)の混合物に対するL-1の一周比.
- 102 °Cで48時間の反応混合物を逆流する圧力軽減機構(例えば、針付きバルーン、または単に針)でシステムをキャップします。この反応は大気ガスに敏感ではない。
注:反応が完了すると、溶液は無色になります。 - 反応混合物をロータリーエバポレータに接続してMeOHを蒸発させ、体積を約300mLに減らします。
- 残りの溶液を1L添加漏斗に移します。
- 残りの水溶液5xをジエチルエーテルで抽出し、添加漏斗を用いた。未反応の11-ブロモ-1-非デセンは、ジエチルエーテル相およびH2Oにおける硫化物産物にとどまる。
注意:抽出中に圧力蓄積を頻繁に放出し、追加ファネルの正しい使用法を参照してください。 - 最終的に抽出された水溶液を1Lのシングルネックラウンドボトムフラスコに集めます。
- フラスコとトラップの間に少しのグリース(またはテフロンリングストリップまたはその他のシーラント)を入れて、反応フラスコをロータリーエバポレータに接続します。
- 真空をゆっくりと減らし、ロータリーエバポレータ内の水相を蒸発させる。製品は界面活性剤であるため、蒸発中に発泡が起こります。この問題を回避するには、次の手順の指示に従います。
- 混合物にエタノールを加えてH2Oの蒸発を加速し、発泡を防ぎます。エタノール含有量の減少により発泡が再開した場合は、蒸発を停止し、回転式エバポレータからフラスコを取り出し、エタノール(総体積の約3分の1)を追加し、フラスコをロータリーエバポレータに再接続します。溶液混合物が大幅に減少し、気泡を形成しないまで、このプロセスを繰り返します。
- フラスコを高真空に接続して白色粉末を直接乾燥させます。粉末を乾燥させるほど、無機塩は後続の工程に忍び込む。
注:熱は、例えば、60°Cの浴槽でフラスコを真空下に保ち、一晩放置することによって、製品を乾燥させるために使用することができます。 - フラスコに400mLのメタノールで白い粉末を吊り下げます。製品の最大量を溶解するために超音波。
注:このステップの目標は、製品を溶解することですが、過剰な亜硫酸ナトリウムや臭化ナトリウムなどの無機副産物は、メタノールの溶解度が限られています。メタノール中の水は溶媒中の無機副産物の溶解度を高めるので、可能な限り最も低い水分含有量でメタノールを使用してください。 - 製品の溶解度を高めるために、メタノールは、その沸点(〜64°C)の近くで穏やかに加熱することができる。
注意:フラスコの加熱中に煙フードの下で作業することを確認してください。蒸発したメタノールの煙は危険です。 - 溶液を濾過して、不溶性無機副産物を除去する。真空ポンプに接続されたフィルタリングフラスコと定量フィルターペーパー付きのろ過漏斗、またはホウケイ酸塩フィルターを使用します。製品と無機塩の両方が乾燥時に白い粉末である:製品はメタノールに可溶性であるが、塩はそうではありません。
- 濾過された溶液を濾過フラスコから1Lの丸底フラスコに移します。
- フラスコをロータリーエバポレータに接続し、メタノール溶液を45°Cで蒸発させ、メタノールで白色粉末を再溶解し、溶液を濾過します(プロトコルステップ1.1.7、1.1.8、および1.1.9)。このプロセスを少なくとも2倍繰り返し、無機塩の量を減らす。
- 白色のメタノール可溶性粉末(約30g、このスケールで)を収集します。
- D2 Oの500 μLで約10mgの製品を溶解し、溶液をNMRチューブに移します。
- D2O の製品に対して、32 回のスキャンで 400 MHz で1H NMR 分光法を実行します。
注: 1H NMR (D2O) のピーク割り当ては、5.97 (m, 1H)、5.09 (m, 2H)、2.95 (t, 2H)、2.10 (m, 2H)、1.77 (q, 2H)、1.44 (br s, 12H) です。
- ナトリウム11-アセチルチオ-デカンスルホン酸ナトリウム
- 約30gのナトリウムundec-10-エネスルホン酸ナトリウム(セクション1.1の反応積)を1L丸底フラスコ内の500mLのメタノールに溶解させます。溶液にチオ酢酸の2.6倍を加え、一晩(〜12時間)UVランプ(250W)の前でかき混ぜます。UVランプが利用できない場合、反応はアゾビシソブチリトリル(AIBN)などのラジカルイニシエーターを用いて還流することによって行うことができる。ただし、UV ランプの使用を強くお勧めします。
注意:常にヒュームフードの下で動作するようにしてください。フラスコをUVランプがある別のスペースに輸送する必要がある場合は、チオ酢酸の強い臭いが広がらないようにフラスコをシールします。UVランプを操作する際のエクササイズケア:ランプが配置されているスペースを完全にブロックし、UVランプの操作方法に関する機関の安全ガイドラインを参照してください。 - 反応から約2mLのアリコートを取って反応を監視し、溶媒を蒸発させ、重化した水を加えて1H NMRで確認する。二重結合に対応するピークが消えたら、反応を停止します。
注:通常、UVランプの前で12時間後に、反応が完了します。反応混合物が濁った場合は、より多くのMeOHを追加し、6時間のUV光への露出を続けます。 - 固体残渣がオレンジ色の赤になるまで、ロータリーエバポレータでMeOHのすべてを蒸発させる。十分に長く放置すると、製品は茶色から黒色になります。
注意:チオ酢酸からの強い臭いのために注意してください。任意のチオレート流出の強い臭いは、漂白剤(次亜塩素酸ナトリウム)の水溶液を使用して中和することができます。 - 濾過フラスコを使用して、余分なチオ酢酸を除去するためにジエチルエーテルで製品を洗浄し、これ以上着色された(オレンジイエロー)物質がジエチルエーテル上清に現れないまで。高真空下で固体を乾燥させ、その後、メタノールに溶解し、黄色からオレンジ色の溶液を得る。
注:製品を溶解するのに十分なメタノールを追加します。
注: この手順では、色が異なる場合があります。 - 溶液に3gのカーボンブラックを加え、激しく混ぜ、濾過媒体(材料の表を参照)を通して混合物を濾過し、フルートフィルターペーパーの3分の2を覆います。
注:カーボンブラックの多孔質構造は、着色された副産物材料(および製品の一部)をキャプチャします。フィルター処理されたソリューションは明確にする必要があります。フィルタ処理されたソリューションがまだ色付き (黄色) の場合は、この手順を繰り返します。 - ロータリーエバポレーターで溶媒を完全に蒸発させ、約35gの白色粉末を回収します。
- D2Oの約500μLで製品を〜10mg溶解し、溶液をNMRチューブに移す。
- D2O の製品で、32 MHz の 400 MHz で1H NMR を実行します。
注: H NMR (D2O) のピーク割り当ては、2.93 (t, 4H)、2.40 (s, 3H)、1.77 (m, 2H)、1.62 (m, 2H)、1.45 (br s, 14H) です。
- 約30gのナトリウムundec-10-エネスルホン酸ナトリウム(セクション1.1の反応積)を1L丸底フラスコ内の500mLのメタノールに溶解させます。溶液にチオ酢酸の2.6倍を加え、一晩(〜12時間)UVランプ(250W)の前でかき混ぜます。UVランプが利用できない場合、反応はアゾビシソブチリトリル(AIBN)などのラジカルイニシエーターを用いて還流することによって行うことができる。ただし、UV ランプの使用を強くお勧めします。
- 11-メルカプト-1-ウンデカンスルホン酸塩(MUS)
- 還流ナトリウム11−アセチルチオ-アンデカンスルホン酸102°Cで102°Cで1M HClの400mLで12時間チオ酢酸基を切断し、チオールを得る。
- 製品を 1.5 L または 2 L の丸い底のフラスコに移します。最終溶液に1M NaOHの200 mLを追加し、1 Lの最終容積を持つためにDI水の400 mLでそれを上に。これは、溶液を酸性に保ち、副産物として無機塩の結晶化を防ぎます。
注:pH7に対する溶液の完全な中和は、メタノールに不溶性の製品の結晶化をもたらす。 - 透明な溶液を4°Cに保ち、一晩結晶化します。製品は、濡れたときに粘性のある微細な結晶として結晶化します。
注: 結晶化を加速するには、事前合成 MUS をソリューションに追加します (可能な場合)。 - 透明な上清と遠心分離機を50mLの遠心管で5分間4,000 x gで下ろします。
- 上清を別のフラスコにデカントし、高真空下で白いペレットを乾燥させる - 利用可能な遠心分離機に応じて、これは2 - 16チューブ以上することができます。
注:フィルタリングは、製品の界面活性剤の性質上、お勧めしません。過度の発泡が発生し、製品のほとんどが失われます。 - この精製工程から約12g(約30%収率)のメタノール溶解MUSを回収する。
注:粉末は細かく静電性であり、スパチュラや容器の表面に固執する傾向があります。また、遠心分離工程の上清から、体積を(元の値の約3分の1)に減らし、4°Cに保つことで、より多くの材料を抽出することができます。音量をさらに減らす(75%)このステップで収量を増やすために。 - D2Oの約500μLで製品を〜10mg溶解し、溶液をNMRチューブに移す。
- D2O の製品で、32 MHz の 400 MHz で1H NMR を実行します。
注:H NMR(D2 O)のピーク割り当ては2.93(t,4H)、2.59(t,3H)、1.78(m,2H)、1.65(m,2H)、1.44(br s、14H)です。製品の計算されたモル質量(ナトリウム対イオンを含む)は290.42 g/molです。
2. ナノ粒子合成:試薬の調製
- すべてのガラス製品(1つの250 mLと1つの500 mLのシングルネックラウンドボトムフラスコ、100 mLの追加漏斗、および小さな漏斗)を新鮮なアクアレジア(3部塩酸を1部の硝酸に3部)で洗浄します。ガスフードの中に余分な量の水でガラス製品をすすいで、すべての煙を取り除きます。その後、エタノールでガラス製品をすすいで、実験室のガラス製品オーブンで乾燥させます(40-60 °Cが推奨されます)。
- 小さなガラスバイアル(10または20 mLのクリーンガラスバイアル、または計量紙)で金(III)塩化物三水和物(HAuCl 4=3H2O)の重量を量る。
- 20 mLのガラスバイアルで87 mg(0.3 mmol)MUSの重量を量る。
- 10mLのメタノールを加えてMUSを溶解し、固体材料が見えなくなるまで超音波浴槽でソニトを行い、完全な溶解を確保します。
注:または、ヒートガンまたは温浴(〜60°C)を使用して、溶液を穏やかに加熱します。加熱したら、フラスコの外側を冷たい水で流し、室温に戻します。 - メタノール溶液にOTの26 μL(0.15 mmol)を加え、リガンドを混合するために攪拌します。
- ボロヒドリドナトリウム(NaBH 4)の500mg(13ミリモル)の重量を量り、250 mLのラウンドボトムフラスコにエタノールの100 mLに加えます。磁気撹拌(600~800rpm)を用いて激しく撹拌する。(NaBH4は、グレードに応じて10~20分かかり、エタノール中に明確な溶液を形成する。
3. 金ナノ粒子の合成
- 500 mLのラウンドボトムフラスコに100mLのエタノールに金塩を溶解し、攪拌プレート上の磁気バーで800rpmで撹拌を開始します。金塩が完全に溶け込むことを確認してください。
- 丸底フラスコの上に100mLの追加漏斗を置きます。定量的な用紙フィルターを内側に付加する漏斗の上にじょうごを置きます。NaBH4がエタノールに溶解すると、漏斗内のフィルターペーパーを通して溶液を加漏斗に濾過し始める。
- リガンド溶液を反応混合物に添加する。金チオレート複合体の形成のために15分待ちます。半透明の黄色から濁った黄色への反応混合物の色変化は、金チオレート複合体の形成を示す。
- フィルタリングされたNaBH4溶液を、ファネルをドロップして追加して追加します。NaBH4の添加に約1時間かかるように、ドロップの間隔時間を調整します。
- NaBH4を完全に追加した後、漏斗を取り除く。もう1時間反応をかき混ぜ続けます。反応の終わりに、フラスコの外側に置かれた磁石を使用して磁気攪拌バーを取り除く。
- 中隔を使用してフラスコを閉じ、中隔に針を突き刺して、反応後に進化するH2ガスを放出します。
- 実験室の冷蔵庫(4°C)内の反応混合物を一晩沈殿させるために保ちます。
4. 合成のワークアップ
- 上清エタノールをデカントして体積を減らします。
- 残りの沈殿物を 50 mL 遠心分離管と遠心分離機に 4,000 x gで 3 分間転送します。
- 上清をデカントし、渦によってエタノールで再びナノ粒子を分散させ、再び遠心分離する。この洗浄プロセスを4倍繰り返します。
- 真空下のナノ粒子を乾燥し、残留エタノールを除去する。
- 遊離親水性リガンド/分子からナノ粒子を洗浄するには、DI水の15mLで沈殿物を溶解し、30 kDaカットオフ分子量の濾過膜で遠心管に移します。透析もこの手順に適しています。
- これらのチューブを4,000xgで5分間遠心分離し、ナノ粒子溶液を濃縮する。
- この溶液に15mLのDI水を加え、遠心分離機を再び濃縮します。このクリーニングプロセスを少なくとも10倍繰り返します。
注:水溶性不純物が除去されたことを示す1つの徴候は、水性廃棄物を攪拌する際に発泡が存在しないことです。結局のところ、不純物のほとんどは、それ自体またはOTを持つMUSのディスルフィドです(これは、材料を収集し、1 H NMRを実行することによって決定することができます)。 - 遠心分離後、濃縮ナノ粒子を15mL遠心管に移す。ナノ粒子を管理可能な粉末に変えるには、アセトンなどの溶媒に沈殿させるか、残りの水溶液を凍結乾燥させる。凍結乾燥すると、ナノ粒子は表面に付着する緩い粉末を形成する傾向があり、操作が困難な場合があります。
5. ナノ粒子の特性
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純度
- ナノ粒子が非結合リガンドから含まれなかどうかを確認するために、D2Oの600μLで5mgの乾燥ナノ粒子を溶解し、粒子の1H NMR測定を行う。 リガンドの鋭いピークがない場合、それはナノ粒子が小さな有機分子から含まれがないことを意味します。
-
リガンド比
- ヨウ素の20mg/mLメタノール-d4溶液を調製する。この溶液の600μLをガラスバイアル中のナノ粒子の〜5mgに添加し、ナノ粒子をエッチングする。
- バイアルのキャップをパラフィンフィルムで包み、超音波浴で20分間超音波浴で超音波処理し、溶液をNMRチューブに移し、32回のスキャンで1H NMR(400 MHz)スペクトルを取得します。
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リガンド密度
- ナノ粒子2~8mgをTGAるつぼに移す。30 °C から 900 °C までの温度範囲と、N2ガスの下で毎分 5 °C の速度を選択します。
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サイズ分布
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Tem
- DI水中に0.1mg/mLナノ粒子溶液を調製します。400メッシュのカーボン支持銅グリッドに、調製された溶液の5 μLをドロップします。乾くまで待て
- TEMホルダーにグリッドを移し、顕微鏡に挿入します。200 kVで動作する、少なくとも64,000Xの倍率で5~10枚の画像を取得します。
注:コントラストを高めるために、20 nmの客観的な絞りを挿入することができます。
-
UV-Vis スペクトル
- DI水中に0.2mg/mLナノ粒子溶液を調製します。
- この溶液の必要量をクォーツキュヴェットに入れ、200nmから700nmまでスキャンします。
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Tem
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Representative Results
MUSを合成するための反応ステップを図1に示す。各工程の積の1H NMRスペクトルを図2に示す。バイナリMUS:OTの両生類性金ナノ粒子の合成ワークフローを図3に記載する。合成に続いて、ナノ粒子のワークアップは、エタノールおよびDI水で粒子を数回洗浄して構成された。ナノ粒子の任意の特徴付けに先立ち、非結合自由リガンドからのナノ粒子の清浄度は、図4に示すように、D2 Oにおける1H NMRによって監視された。 ナノ粒子の大きさ分布は、TEM(図5a,b)によって特徴付けられた。局所的な表面プラズモン共鳴吸収は、UV-Visスペクトル(図5c)を取得して測定した。
2つのリガンドの比率は、ヨウ素を用いて金コアをエッチングし、1H NMRを獲得し、統合値を用いて各リガンドの相対量を算出することによって決定した。 図6は、代表的なスペクトル、ならびにNMRピーク割り当ての手順を示す。MUSとOTの間のリガンド比を見つけるために、0.8- 1 (I 1)、1.12 - 1.55 (I2)、1.6- 1.9 (I3)、および 2.6 - 3 (I4)ppm の間のピークの積分を計算しました。I1ピークには、3つのOT水素からのシグナル、14MUS水素と10個のOT水素の組み合わせによるI2ピーク、4つのMUS水素と2つのOT水素(各ピーク)からのI3およびI4ピークが含まれています。 したがって、OTパーセンテージを見つけるには、I1から3を正規化し、以下の式を適用する必要があります。
I2の場合、
I3と I4の場合、
これらの計算は、システム内に OT の任意の単位が 1 つあると仮定して、MUS に対する OT の比率を示します。図 6Bの場合、3 つの積分は OTパーセンテージに対して同様の値を与えました (それぞれ、15.3、15.9、および I 2、I3、および I4から 15.9)。
ナノ粒子の表面カバレッジは、図7に示すようにTGAによって調べられる。TGA、NMR、およびTEMデータ(図3)を組み合わせて、表面積の単位上のリガンドの数であるリガンド密度を計算し、粒子を球に近似する。(この計算では、Naが NaHSO3として沸騰することを前提としています。TEMデータは、ナノ粒子の平均直径が2.4nmであることを示し、表面積(Aパー)の約18.08 nm 2(Apar= 4pr2)と7.23 nm3(Vパー=4pr)を指しています。パーティクルあたりの体積の3/3(Vパー)。金の密度は19.9 g/cm3で、1つの粒子の質量は1.3969 x 10-16 mgです(質量粒子= Vパーx金の密度= 7.23 nm3 x 19.9 g/cm3 x 10-18mm3/nm 3)。800°C付近の残りの質量は金のコアに相当し、N par=(質量金/質量)を用いて推定される約3.7 x 1016粒子(Nパー)があります。粒子)= 5.17 mg / 1.3969 x 10-16 mg.パーティクルの総表面積 (Atot)は 6.69 x 1017 nm2 (Atot = Nparx Apar=3.69 x 1016 x 18.08 nm 2) です。ヨウ素エッチングナノ粒子のNMRは、MUS:OT比が85:15であり、TGAの有機含有量が0.00146gであることを示した。したがって、Nリガンド=((ROT x M wOT)+(R MUS)の式に続いて3.26 x 1018リガンド(Nリガンド)があります。 x MwMUS)/ (RMUS + ROT)] x Nアボガドロ= [0.00146 g / ((15 x 146 g/mol) + (85 x 267.42 g/mol)) / (85 + 15) x (6.02 x 1023)= 3.26 x 1018.最後に、リガンド密度は4.8リガンド/nm2であり、NリガンドをAトットで割って計算した(4.8 = 3.26 x 1018/6.69 x 1017 nm2)。様々な合成から生じるOTのNMR比に対する検体比を図8で比較する。
図1:MUS合成の概略図。MUS合成は、親和性ナノ粒子合成の再現性の鍵となる点である。MUSが塩分含有量が高い場合、リガンドのストイチオメトリック比が逸脱する可能性があります。X = 9。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:MUS合成における各工程後の分子のNMRスペクトル(400MHz)。(A) このパネルは、D2 O. (B) このパネルは、D2 O. (C)このパネルのナトリウム11-アセチルチオ-アンデカンスルホネートの1H NMRスペクトルを示すD2 Oにおける11-メルカプト-1-非デカンスルホネートの1H NMRスペクトルを示す。全スペクトルにおいて、*は溶媒ピークを示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:親和性ナノ粒子合成の概略図。(A) 本パネルは、エタノールを溶媒として用いた1相化学還元反応の調製を示す。(B)金チオレート錯体は、還元剤を添加する前に形成することを許される。この段階では、金塩の溶液が濁りました。(C)還元剤の滴下添加の際に、金ナノ粒子が形成される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:未反応のフリーリガンドからのナノ粒子の清浄度。(A) このパネルは、合成および真空乾燥の直後にナノ粒子の1H NMRスペクトルを示す。 D2Oは、1HNMR分析用の溶媒として用いられる。赤い矢印で示される鋭いピークは、自由な非連結リガンドの存在を示します。(B)このパネルは、徹底的な精製後のナノ粒子の1H NMRスペクトル(すなわち、エタノールおよびDI水での洗い流しおよび遠心分離)を示す。 赤い矢印はスペクトルの拡大された部分を指し、ピークは広く、フリーリガンドの不在を示す前と同様に鋭くはありません。いずれのスペクトルでも、*は溶媒ピークを示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ナノ粒子の大きさ分布。(A) このパネルは、MUS:OTナノ粒子の代表的なTEM画像を示す。スケールバーは20nmです。(B) このパネルは、いくつかのTEM画像に基づいてナノ粒子のコアサイズのヒストグラムを示す。(C)ナノ粒子のUV-Visスペクトルは、約520nmでナノ粒子の特徴的な表面プラズモン共鳴ピークを示した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:リガンド比計算。(A) このパネルは、ジスルフィド(コアエッチング後のリガンドの参照として)の組み合わせの代表的なNMRスペクトルと、MeOD-d4における異なる陽子のピーク割り当てを示す。(B) このパネルは、MeOD-d4におけるエッチングナノ粒子の1H NMRスペクトルを示す。 全スペクトルにおいて、*は溶媒ピークを示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:リガンド密度解析。ナノ粒子のTGA測定を行い、有機材料(リガンド)の比と密度を決定した。測定値のグラフは、重量のパーセンテージ対としてプロットされます。温度。OTデソブは、最初に、176 °Cから233 °C(垂直線)の間。MUSは、より小さな分子に分解し、約800°Cで完全に燃焼されます。残りの重量パーセンテージは、ナノ粒子の金コアに相当する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:粒子上のOTの検体とNMR比の比較。反応中のMUSとOTとの間の開始体分法比を変化させ、ナノ粒子の両生類を調整することができる。誤差バーは、示された検体比を使用して取得されたOT含有量の上限と下限を示します。10%、20%等の修称率は、最大90%OT、ナノ粒子表面上のOT含有量の限界を観察するために合成した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、まずMUSリガンドの合成を記述し、次に、親和性MUS:OT金ナノ粒子の合成および特性を説明する。塩分含有量を最小限に抑えてMUSを合成することで、ナノ粒子合成時のリガンド間のストイチオメーション比の信頼性が向上し、これは標的疎水性を有するMUS:OTナノ粒子の再現性合成の重要な要素である。内容 (図8)MUSおよびOTの一般的な溶媒としてのメタノールの使用は、エタノール中の粒子の合成と共に、MUS:OT金ナノ粒子の信頼性の高い合成を可能にする。ここで提示される特徴付けの方法は、その合成の結果を検証するためにナノ粒子に関する十分な情報を得るために必要な実験の最小限のリストを構成する。
このプロトコルには4つの重要なステップがあります:(i)第2段階で着色不純物を除去し、最終的に純粋なMUSの結晶化と共に、低塩含有量を有するMUSの合成。(ii) MUSとOTの間の検体比のチューニングと決定;(iii) ナノ粒子のワークアップ;(iv)ナノ粒子の特性化。
ナノ粒子の形成中に、MUSは優先的にナノ粒子表面に結合し、これは得られるナノ粒子の溶解度に関連する可能性がある。例えば、MUSとOTの間の2:1の修一性供給比は、エッチングされた金ナノ粒子の1H NMRからのデータを使用して計算した場合、表面上のOTの15%をもたらす。したがって、より低いMUS対OT比を有するナノ粒子を得るためには、粒子の合成時にOTのより高い含有量を使用する必要があります(図8)。言い換えれば、より疎水性粒子である。ナノ粒子の表面上のリガンド間の検体比を評価するためには、溶液中に結合されていないリガンドがないことを確認する必要がある。非結合リガンドの存在は、ナノ粒子および密度に対するリガンド比の決定に影響を及ぼし、その後の試験および実験と共に、誤った解釈を招く可能性がある。異なる溶媒(エタノールおよびDI水など)を用いた反復洗浄サイクルは、すべての結合されていないリガンドおよびその他の不純物(ボロヒドリドナトリウム、金イオン等の副産物)を排除するために必要とされる。1H NMRは、ナノ粒子の純度を確認するために重要である。ナノ粒子に対する複雑な化学環境に起因するリガンドの線拡大効果は、リガンドに対応するピークを広げ、一方、任意の鋭い信号は非結合分子22から来る。さらに、移動性が制限されているため、チオール基に隣接するメチレンに対応するNMRピークは検出できず、これは1HNMRを用いて検査した場合のナノ粒子の別のシグネチャである。ナノ粒子がきれいになったら、金属コアはヨウ素でエッチングされます。ヨウ素エッチングは、ナノ粒子上のリガンド比を定量する確立された方法である。例えば、20年前、Murrayらはヨウ素エッチング後の金ナノ粒子上の単層組成物の決定を報告し、ヨウ素は金コアを分解し、チオ酸リガンドをジスルフィデス23として放出する。ヨウ素エッチング法の信頼性は、他の方法を用いて確立されている。例えば、Harknessらは、NMRから得られたリガンド比が質量分析測定24からの1%偏差内であることを報告した。
TGAは、ナノ粒子上の有機含有量を計算する簡単な方法です。表面リガンド密度の推定は、すべてのチオレートリガンドが表面金原子に結合し、すべての自由リガンドが精製中に除去されたことを前提としています。リガンド密度を決定するために、主に粒子が球状であり、表面積と梱包密度を計算するために使用される、いくつかの仮定がなされます。TEMは、ナノ粒子のおおよその表面積を計算するために使用することができるナノ粒子金コアのサイズ分布を提供します。ここで説明するナノ粒子合成は、平均直径2~3nmの粒子の多分散集団と最大30%の大きさ偏差を生み出す。また、平均半径は、1つの粒子の平均体積(球に近似)を計算するために使用され、金の密度と組み合わせることで、1つのナノ粒子の質量の計算を可能にする。そして、800°Cを超えるTGAで測定した質量は、最初に存在する粒子の数の計算を可能にする。この値と平均コアサイズを用いることで、金ナノ粒子の総表面積を推定することができる。1HNMR分光法で得られたデータから算出されたリガンド比は、ナノ粒子の表面上のリガンドのモル数の計算を可能にする。金ナノ粒子の表面積に対するリガンド間のモル比は、リガンド密度を提供する(図7)。クリーンなナノ粒子は、nm2当たり約4リガンドを持っています。TGAデータは、リガンド比を推定するためにも使用することができ、それらが金表面から脱着する温度間隔が各リガンドについて知られており、別々の温度範囲で脱着が起こる場合。
要約すると、このプロトコルは、低塩含有量とMUS:OTの両生性金ナノ粒子でMUSリガンドを合成する簡単な方法を提供します。これらのナノ粒子の再現性の重要な要因の一つは、使用されるMUS中の低無機塩含有量である。これらのナノ粒子は、粉末および溶液中(例えば、H2Oおよび生理学的に関連するもの)の両方として安定であり、これは多くの用途の前提条件として強調されるべきである。両生類ナノ粒子の大きさと表面特性の徹底的な特性化は、両生類の程度が重要な役割を果たす可能性のある将来の用途に不可欠である。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
Z.P.G.とF.S.は、スイス国立科学財団、特にNCCRの「分子システム工学」に感謝しています。Z.L.とF.S.は、スイス国立科学財団部門II助成金の支援に感謝します。すべての著者は、実りある議論と原稿の校正のためにQuy Ongに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11-bromo-1-undecene | Sigma Aldrich | 467642-25 ml | |
| Sodium Sulfite | Sigma Aldrich | S0505-250 g | |
| Benzyltriethyl-ammonium bromide | Sigma Aldrich | 147125-25 g | |
| Methanol | VWR | BDH1135-2.5 LP | |
| DI water | Millipore | ZRXQ003WW | Deionized water |
| 1 L round bottom flask | DURAN | 24 170 56 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 1.00930 EMD Millipore | |
| Stirring bar | Sigma Aldrich | Z329207, | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | Sigma Aldrich | Z273554 ALDRICH | |
| Filtering flask | DURAN | 20 201 63 | |
| Filtering Buchner Funnel | FisherSci | 11707335 | |
| Ethanol >99.8%, ACS, Reagent | VWR | 2081.321DP | |
| Deuterium dioxide | Sigma Aldrich | 151882 ALDRICH | |
| Thioacetic acid 96% | Sigma Aldrich | T30805 ALDRICH | |
| Carbon black | Sigma Aldrich | 05105-1KG | |
| Celite | Sigma Aldrich | D3877 SIGMA-ALDRICH | Filtration medium |
| Condenser | Sigma Aldrich | Z531154 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent 37% | Sigma Aldrich | 320331 SIGMA-ALDRICH | |
| Sodium Hydroxide, BioXtra, pellets (anhydrous) | Sigma Aldrich | S8045 SIGMA-ALDRICH | |
| Centrifuge tubes | VWR | 525-0155P | |
| 250 mL round bottom flask | DURAN | 24 170 37 | |
| 500 mL round bottom flask | DURAN | 24 170 46 | |
| Nitric acid, fACS reagent 70% | Sigma Aldrich | 438073 SIGMA-ALDRICH | |
| Gold(III) chloride trihydrate >99.9% trace metal basis | Sigma Aldrich | 520918 ALDRICH | |
| 1-octanethiol >98.5% | Sigma Aldrich | 471836 ALDRICH | |
| Sodium Borohydride purum p.a.>96% | Sigma Aldrich | 71320 ALDRICH | |
| addition funnel | SIgma Aldrich | Z330655 SIGMA | |
| Funnel | DURAN | 21 351 46 | |
| 2V folded filtering papers | Whatman | 1202-150 | |
| Amicon filters | Merck | UFC903024 | |
| Iodine, ACS reagent, >99.8%, solid | Sigma Aldrich | 207772 SIGMA-ALDRICH | |
| 5 mm NMR-Tubes, Type 5HP (high precision) | Armar | 32210.503 | Length 178 mm |
| Methanol-d4 99.8 atom%D | Armar | 16400.2035 | |
| TGA crucible | Thepro | 9095-9270.45 | |
| 400 mesh carbon supported copper grid | Electron Microscopy Science | CF400-Cu | |
| quartz cuvette | Hellma Analytics | 100-1-40 |
References
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