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Chemistry

Sintesi e caratterizzazione delle nanoparticelle d'oro dell'anfifile

Published: July 2, 2019 doi: 10.3791/58872
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Institute of Materials, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, 2School of Materials, University of Manchester, 3Interfaculty Institute of Bioengineering, École Polytechnique Fédérale de Lausanne
* These authors contributed equally

Summary

Le nanoparticelle d'oro anfifilico possono essere utilizzate in molte applicazioni biologiche. Viene presentato un protocollo per sintetizzare nanoparticelle d'oro rivestite da una miscela binaria di ligandi e una caratterizzazione dettagliata di queste particelle.

Abstract

Le nanoparticelle d'oro ricoperte da una miscela di 1-ottanethiol (OT) e 11-mercapto-1-undecane sulfonic acid (MUS) sono state ampiamente studiate a causa delle loro interazioni con le membrane cellulari, i bistrati lipidici e i virus. I ligandi idrofili rendono queste particelle colloidalmente stabili in soluzioni acquose e la combinazione con ligando idrofobico crea una particella anfofica che può essere caricata con farmaci idrofobici, si fonde con le membrane lipidiche e resiste non specifica adsorbire le proteine. Molte di queste proprietà dipendono dalle dimensioni delle nanoparticelle e dalla composizione del guscio del ligando. È quindi fondamentale avere un metodo sintetico riproducibile e tecniche di caratterizzazione affidabili che consentano la determinazione delle proprietà delle nanoparticelle e la composizione della conchiglia. Qui, viene presentata una riduzione chimica di una fase, seguita da una purificazione approfondita per sintetizzare queste nanoparticelle con diametri inferiori a 5 nm. Il rapporto tra i due ligandi sulla superficie della nanoparticella può essere sintonizzato attraverso il loro rapporto stoichiometrico utilizzato durante la sintesi. Dimostriamo come varie tecniche di routine, come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la risonanza magnetica nucleare (NMR), l'analisi termogravimetrica (TGA) e la spettrometria ultravioletta-visibile (UV-Vis), sono combinate in modo completo caratterizzano i parametri fisici delle nanoparticelle.

Introduction

Il guscio di ligando di nanoparticelle d'oro può essere progettato per esibire diverse proprietà che possono essere applicate per affrontare le sfide in biomedicina1,2,3,4. Tale versatilità consente il controllo delle interazioni intermolecolari tra nanoparticelle e biomolecole5,6,7. L'idrofobicità e la carica svolgono un ruolo decisivo, così come altri parametri di superficie che influenzano il modo in cui le nanoparticelle interagiscono con le biomolecole5,8,9. Per ottimizzare le proprietà superficiali delle nanoparticelle, la scelta delle molecole tiolate che compongono il guscio del ligando offre una miriade di possibilità, secondo le caratteristiche ricercate. Ad esempio, una miscela di molecole di ligandocon gruppi finali idrofobici e idrofili (ad esempio, caricata) viene spesso utilizzata per generare nanoparticelle anfifili 10,11.

Un esempio prominente di questo tipo di nanoparticelle è protetto da una miscela di nanoparticelle OT e MUS (qui chiamata NANOparticelle MUS:OT) che ha dimostrato di possedere molte proprietà rilevanti12,13,14. In primo luogo, con una composizione di guscio di ligando del 66% MUS (in seguito 66:34 MUS:OT), la stabilità colloidale delle nanoparticelle è elevata, raggiungendo fino al 33% di peso nell'acqua deionizzata, così come nella salina tampone fosfata (1x, 4 mM fosfato, 150 mM NaCl)15. Inoltre, queste particelle non precipitano a valori di pH relativamente bassi: ad esempio, a pH 2.3 e con concentrazioni di sale di 1 M NaCl15, queste nanoparticelle rimangono colloidalmente stabili per mesi. Il rapporto stoichiometrico tra le due molecole sul guscio del ligando è importante perché detta la stabilità colloidale nelle soluzioni con un'elevata resistenza ionica16.

Queste particelle hanno dimostrato di attraversare la membrana cellulare senza porating esso, attraverso un percorso indipendente dall'energia1,12. La fusione spontanea tra queste particelle e bistrati lipidici è alla base della loro diffusività attraverso le membrane cellulari17. Il meccanismo alla base di questa interazione è la minimizzazione del contatto tra una superficie idrofobica accessibile dal solvente e molecole d'acqua dopo la fusione con bistrati lipidi18 . Rispetto alle nanoparticelle all-MUS (nanoparticelle che hanno solo il ligando MUS sul guscio), la maggiore idrofobicità sulle nanoparticelle miste MUS:OT (ad esempio, a una composizione MUS:OT 66:34) aumenta l'intervallo del diametro del nucleo che può fondersi con i lipidi bistrati18. Diverse organizzazioni di auto-assemblaggio del guscio di ligando sono correlate a modalità di legame distinte di nanoparticelle 66:34 MUS:OT con varie proteine, come albumina e ubiquitina, rispetto alle particelle all-MUS19. Recentemente, è stato riferito che le nanoparticelle 66:34 MUS:OT possono essere utilizzate come un agente antivirale ad ampio spettro che distrugge irreversibilmente i virus a causa di attacchi elettrostatici multivalenti di leganti MUS e accoppiamenti non locali di leganti OT al capside proteine14. In tutti questi casi, è stato scoperto che il contenuto idrofobico, così come la dimensione del nucleo delle nanoparticelle, determina come avvengono queste interazioni bio-nano. Queste diverse proprietà delle nanoparticelle MUS:OT hanno spinto molti studi di simulazione al computer che miravano a chiarire i meccanismi alla base delle interazioni tra particelle MUS:OT e varie strutture biologiche come i bistrati lipidici20.

La preparazione delle nanoparticelle Au protette da MUS:OT pone alcune sfide. In primo luogo, il ligando caricato (MUS) e il ligando idrofobico (OT) sono immiscibili. Pertanto, la solubilità delle nanoparticelle e dei ligandi deve essere presa in considerazione in tutta la sintesi, così come durante la caratterizzazione. Inoltre, la purezza delle molecole di ligando MUS, in particolare il contenuto di sali inorganici nel materiale di partenza, influenza la qualità, la riproducibilità, nonché la stabilità colloidale a breve e lungo termine delle nanoparticelle.

Qui, una sintesi dettagliata e la caratterizzazione di questa classe di nanoparticelle d'oro anfihiphilico protette da una miscela di MUS e OT sono delineate. Un protocollo per la sintesi del ligando MUS caricato negativamente è segnalato per garantire la purezza e, quindi, la riproducibilità di diverse sintesi di nanoparticelle. Quindi, la procedura per generare queste nanoparticelle, sulla base di una sintesi comune di una fase, seguita da una purificazione approfondita, è riportata in dettaglio. Varie tecniche di caratterizzazione necessarie21, come TEM, UV-Vis, TGA e NMR, sono state combinate per ottenere tutti i parametri necessari per qualsiasi ulteriore esperimento biologico.

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Protocol

1. Sintesi di 11-mercapto-1-undecanesulfonate (MUS)

NOTA: questo protocollo può essere utilizzato su qualsiasi scala desiderata. Qui viene descritta una scala di 10 g di prodotto.

  1. Sodio undec-10-enesulfonato
    1. Aggiungere 11 bromo-1-undecene (25 mL, 111.975 mmol), solfato di sodio (28,75 g, 227,92 mmol) e bromuro di benzyltriethylammo (10 mg) a una miscela di 200 mL di metanolo (MeOH) e 450 mL di acqua deionizzata (DI) (4:9 v/v MeOH:H2O ratio) in un rapporto di 1 lask .
    2. Reflusso della miscela di reazione a 102 gradi centigradi per 48 h. Cap il sistema con un meccanismo di sollievo della pressione, ad esempio un palloncino con un ago, o semplicemente un ago. Questa reazione non è sensibile ai gas atmosferici.
      NOTA: la soluzione diventa incolore quando la reazione è completa.
    3. Collegare la miscela di reazione a un evaporatore rotante per far evaporare MeOH e ridurre il volume a circa 300 mL.
    4. Trasferire la soluzione rimanente in un imbuto di aggiunta 1 L.
    5. Estrarre la soluzione acquosa rimanente 5x con etere dietil, utilizzando l'imbuto di addizione. Non reagito 11-bromo-1-undecene rimane nella fase etere dietilee e il prodotto solforato in H2O.
      AVVISO: Rilasciare frequentemente qualsiasi accumulo di pressione durante l'estrazione e consultare il corretto utilizzo delle imbuti di addizione.
    6. Raccogliere l'ultima soluzione di acqua estratta in un flacone rotondo collo singolo da 1 L.
    7. Collegare il pallone di reazione a un evaporatore rotante mettendo un po 'di grasso (o strisce ad anello di Teflon o qualsiasi altro sigillante) tra il pallone e la trappola.
    8. Diminuire lentamente il vuoto per far evaporare la fase aqueous in un evaporatore rotante. Poiché il prodotto è un surfactant, la schiuma si verificherà durante l'evaporazione. Per aggirare questo problema, seguire le istruzioni nel passaggio successivo.
      1. Aggiungere etanolo alla miscela per accelerare l'evaporazione di H2O e prevenire la schiuma. Quando la schiuma si riavvia a causa della diminuzione del contenuto di etanolo, interrompere l'evaporazione, rimuovere il pallone dall'evaporatore rotante, aggiungere più etanolo (circa un terzo del volume totale) e ricollegare il pallone all'evaporatore rotante. Ripetere questo processo fino a quando la miscela di soluzione diminuisce in modo significativo e non forma bolle.
    9. Asciugare la polvere bianca direttamente collegando il pallone ad un vuoto elevato. Più secca è la polvere, i sali meno inorganici si insinuano nei passaggi successivi.
      NOTA: Il calore può essere utilizzato per asciugare il prodotto, ad esempio mantenendo il pallone sotto vuoto in un bagno di 60 gradi centigradi e lasciato durante la notte.
    10. Sospendere la polvere bianca in 400 mL di metanolo in una fiaschetta. Sonicare per sciogliere la quantità massima di prodotto.
      NOTA: L'obiettivo di questa fase è quello di sciogliere il prodotto ma non i sottoprodotti inorganici, come l'eccesso di solfato di sodio e il bromuro di sodio, che hanno una limitata solubilità nel metanolo. Utilizzare metanolo con il più basso contenuto di acqua possibile, perché l'acqua nel metanolo aumenterà la solubilità dei sottoprodotti inorganici nel solvente.
    11. Per aumentare la solubilità del prodotto, il metanolo può essere riscaldato delicatamente vicino al suo punto di ebollizione.
      AVVISO: Assicurarsi di lavorare sotto un cofano di fume durante il riscaldamento del pallone. I fumi del metanolo evaporato sono pericolosi.
    12. Filtrare la soluzione per rimuovere il metanolo insolubile sottoprodotti inorganici inorganici. Utilizzare un flacone filtrante collegato a una pompa a vuoto e un imbuto filtrante con carta filtrante quantitativa o un filtro borosilicate. Sia il prodotto che i sali inorganici sono polveri bianche quando sono asciutti: il prodotto è solubile nel metanolo, mentre i sali non lo sono.
    13. Trasferire la soluzione filtrata dal flacone filtrante a un pallone rotondo-inferiore da 1 L L.
    14. Collegare il pallone a un evaporatore rotante ed far evaporare la soluzione metanolica a 45 gradi centigradi, risciogliendo la polvere bianca nel metanolo e filtrare la soluzione (passaggi di protocollo 1.1.7, 1.1.8 e 1.1.9). Ripetere questo processo almeno 2x, per diminuire la quantità di sale inorganico.
    15. Raccogliere la polvere bianca e solubile a metanolo (circa 30 g, a questa scala).
    16. Sciogliere circa 10 mg di prodotto in 500 -L di D2O e trasferire la soluzione in un tubo NMR.
    17. Eseguire la spettrometria NMR 1H sul prodotto in D2O a 400 MHz con 32 scansioni.
      NOTA: le assegnazioni di picco per 1H NMR (D2O) sono 5,97 (m, 1H), 5,09 (m, 2H), 2,95 (t, 2H), 2,10 (m, 2H), 1,77 (q, 2H), 1,44 (br s, 12H).
  2. Sodio 11-acetilthio-undecanesulfonate
    1. Sciogliere circa 30 g di sodio undec-10-enesulfonato (il prodotto di reazione della sezione 1.1) in 500 mL di metanolo all'interno di una fiaschetta rotonda 1 L. Aggiungere un eccesso di 2,6 x di acido tioacetico alla soluzione e mescolare davanti a una lampada UV (250 W) durante la notte (12 h). Nel caso in cui una lampada UV non sia disponibile, la reazione può essere eseguita refluxing utilizzando un initiator radicale, come azobisisobutyronitrile (AIBN); tuttavia, l'uso di una lampada UV è fortemente raccomandato.
      AVVISO: Assicurarsi di lavorare sempre sotto il cofano del fume. Se il pallone deve essere trasportato in un altro spazio in cui si trova la lampada UV, sigillare il pallone per evitare di diffondere il forte odore di acido tioacetico. Prestare attenzione all'esercizio fisico quando si utilizza una lampada UV: bloccare completamente lo spazio in cui si trova la lampada e consultare le linee guida di sicurezza dell'istituto su come utilizzare una lampada UV.
    2. Monitorare la reazione prendendo 2 mL dalla reazione, evaporare solvente, e aggiungere acqua deuterata per controllare con 1H NMR. Una volta che i picchi corrispondenti al doppio legame scompaiono, fermare la reazione.
      NOTA: Di solito, dopo 12 h davanti alla lampada UV, la reazione è completa. Se la miscela di reazione diventa torbida, aggiungere più MeOH e continuare l'esposizione alla luce UV per sei ore aggiuntive.
    3. Evaporare tutto MeOH in un evaporatore rotante fino a quando il residuo solido diventa rosso-arancio. Se lasciato abbastanza a lungo, il prodotto diventa marrone a nero.
      AVVISO: Lavorare consapevolmente a causa dei forti odori dell'acido tioacetico. I forti odori di qualsiasi fuoriuscita di tiolate possono essere neutralizzati utilizzando una soluzione acquosa di candeggina (ipocloreto di sodio).
    4. Utilizzando un flacone filtrante, lavare il prodotto con etere dietileico per rimuovere qualsiasi acido tioacetico in eccesso, fino a quando non compaiono sostanze più colorate (giallo-arancio) nel supernatante etere etere. Asciugare il solido sotto vuoto elevato e, quindi, scioglierlo in metanolo, producendo una soluzione da giallo a arancione.
      NOTA: Aggiungere abbastanza metanolo per sciogliere il prodotto.
      NOTA: il colore può variare in questo passaggio.
    5. Aggiungere 3 g di nero fumo alla soluzione, mescolare vigorosamente e filtrare la miscela attraverso un mezzo di filtrazione (vedi Tabella deimateriali) coprendo i due terzi di una carta da filtro scanalata.
      NOTA: La struttura porosa del nero fumo cattura il materiale colorato del prodotto collaterale (e parte del prodotto). La soluzione filtrata deve essere chiara. Se la soluzione filtrata è ancora colorata (giallo), ripetere questo processo.
    6. Evaporare completamente il solvente in un evaporatore rotante e raccogliere circa 35 g di polvere bianca.
    7. Sciogliere 10 mg del prodotto in 500 dollari l'L di D2O e trasferire la soluzione ai tubi NMR.
    8. Eseguire 1H NMR sul prodotto in D2O a 400 MHz con 32 scansioni.
      NOTA: le assegnazioni di picco per H NMR (D2O) sono 2,93 (t, 4H), 2,40 (s, 3H), 1,77 (m, 2H), 1,62 (m, 2H), 1,45 (br s, 14H).
  3. 11-mercapto-1-undecanesulfonate(MUS)
    1. Reflusso sodio 11-acetylthio-undecanesulfonate a 102 gradi centigradi in 400 mL di 1 M HCl per 12 h per fendere il gruppo tioacetato e ottenere un thiol.
    2. Trasferire il prodotto in un pallone rotondo da 1,5 L o 2 L. Aggiungere 200 mL di 1 M NaOH alla soluzione finale e riempirla con 400 mL di acqua DI per avere un volume finale di 1 L. Questo manterrà la soluzione acida e impedirà la cristallizzazione dei sali inorganici come sottoprodotto.
      NOTA: Una completa neutralizzazione della soluzione al pH 7 comporterà la cristallizzazione di un prodotto insolubile nel metanolo.
    3. Mantenere la soluzione chiara a 4 gradi centigradi e si cristallizzerà durante la notte. Il prodotto cristallizza come cristalli fini che sono viscosi quando sono bagnati.
      NOTA: per accelerare la cristallizzazione, aggiungere MUS presintedimensionato alla soluzione, se disponibile.
    4. Decant il supernatante chiaro e centrifugare lungo il prodotto bianco viscoso in tubi centrifuga 50 mL per 5 min a 4.000 x g.
    5. Decant il supernatante in un altro pallone e asciugare i pellet bianchi sotto vuoto elevato, a seconda della centrifuga disponibile, questo può essere 2 - 16 tubi o più.
      NOTA: il filtraggio non è consigliato a causa della natura surfactant del prodotto; si verificherà un'eccessiva schiuma e la maggior parte del prodotto andrà persa.
    6. Raccogliere circa 12 g (circa il 30% di rendimento) di MUS solubile a metanolo da questa fase di purificazione.
      NOTA: Tenere presente che la polvere è fine ed elettrostatica: tende ad attaccarsi alle spatole e alle superfici dei contenitori. Inoltre, più materiale può essere estratto dal supernatore della fase di centrifugazione riducendo il volume (a circa un terzo del suo valore originale) e mantenendolo a 4 gradi centigradi. Diminuire ancora di più il volume (del 75%) per aumentare la resa in questa fase.
    7. Sciogliere 10 mg del prodotto in 500 dollari l'L di D2O e trasferire la soluzione ai tubi NMR.
    8. Eseguire 1H NMR sul prodotto in D2O a 400 MHz con 32 scansioni.
      NOTA: le assegnazioni di picco di H NMR (D2O) sono 2,93 (t, 4H), 2,59 (t, 3H), 1,78 (m, 2H), 1,65 (m, 2H), 1,44 (br s, 14H). La massa molare calcolata (compresa la controzione al sodio) del prodotto è di 290,42 g/mol.

2. Sintesi di nanoparticelle: preparazione dei reagenti

  1. Pulire tutti i bicchieri (un 250 mL e un pallone rotondo a collo singolo da 500 mL, un imbuto aggiuntivo da 100 mL e un piccolo imbuto) con acqua fresca (tre parti di acido cloridrico ad una parte di acido nitrico). Sciacquare il vetro con una quantità eccessiva di acqua all'interno di un cappuccio e rimuovere tutti i fumi. Quindi, sciacquare la vetreria con l'etanolo e asciugarla in un forno a base di vetro da laboratorio (si consigliano 40 - 60 gradi centigradi).
  2. Pesare 177,2 mg (0,45 mmol) di triidrato di cloruro in oro (III) (HAuCl4x3H2O) in una piccola fiala di vetro (10 o 20 ml di vetro pulito, o su carta di pesatura).
  3. Pesare 87 mg (0,3 mmol) MUS in una fiala di vetro di 20 mL.
  4. Aggiungere 10 mL di metanolo per sciogliere il MUS. Sonicate in un bagno ad ultrasuoni fino a quando nessun materiale solido è visibile, per garantire la completa dissoluzione.
    NOTA: In alternativa, utilizzando una pistola termica o un bagno caldo (60 gradi centigradi), riscaldare delicatamente la soluzione. Quando è riscaldata, eseguire l'acqua fredda attraverso l'esterno del pallone per riportarla a temperatura ambiente.
  5. Aggiungere 26 l (0,15 mmol) di OT alla soluzione di metanolo e agitarlo per mescolare i ligandi.
  6. Pesare 500 mg (13 mmol) di boroidride di sodio (NaBH4) e aggiungerlo a 100 mL di etanolo nella fiaschetta rotonda da 250 mL. Mescolare vigorosamente con agitazione magnetica (600 - 800 giri/min). (Il NaBH4 prende da 10 a 20 min, a seconda del grado, per formare una soluzione chiara in etanolo.)

3. Sintesi di Nanoparticelle d'Oro

  1. Sciogliere il sale dorato in 100 mL di etanolo nel pallone rotondo-fondo da 500 mL e iniziare a mescolare a 800 giri al secondo con una barra magnetica su una piastra di agitazione. Assicurarsi che il sale d'oro si dissolva completamente.
  2. Posizionare un imbuto di aggiunta da 100 mL sopra il pallone rotondo. Metti un imbuto nella parte superiore dell'imbuto di addizione con un filtro carta quantitativo all'interno. Quando il NaBH4 viene disciolto in etanolo, iniziare a filtrare la soluzione nell'imbuto di addizione attraverso la carta filtrante nell'imbuto.
  3. Aggiungere la soluzione di ligando alla miscela di reazione. Attendere 15 min per la formazione di complesso d'oro-thiolate. Il cambiamento di colore della miscela di reazione dal giallo traslucido al giallo torbido indica la formazione di un complesso di thiolate d'oro.
  4. Iniziare ad aggiungere la soluzione NaBH4 filtrata dall'imbuto di addizione dropwise. Regolare l'intervallo di tempo delle gocce in modo che l'aggiunta di NaBH4 richiede circa 1 h.
  5. Dopo l'aggiunta completa di NaBH4, rimuovere l'imbuto. Continuare a mescolare la reazione per un'altra ora. Alla fine della reazione, rimuovere la barra di agitazione magnetica utilizzando un magnete posto all'esterno del pallone.
  6. Utilizzare un setto per chiudere il pallone e forare un ago nel setto per rilasciare il gas H2 che si evolverà dopo la reazione.
  7. Conservare la miscela di reazione all'interno di un frigorifero di laboratorio (4 gradi centigradi) per far precipitare le nanoparticelle durante la notte.

4. Funzionamento della Sintesi

  1. Decant l'etanolo supernatante per ridurre il volume.
  2. Trasferire il precipitazione rimanente a 50 mL di centrifugare tubi e centrifugare per 3 min a 4.000 x g.
  3. Decant il supernatante, disperdere le nanoparticelle di nuovo con etanolo vortice, e centrifugarli di nuovo. Ripetere questo processo di lavaggio 4x.
  4. Asciugare le nanoparticelle sotto vuoto per rimuovere l'etanolo residuo.
  5. Per pulire le nanoparticelle da ligandi/molecole idrofili liberi, sciogliere i precipitati in 15 mL di acqua DI e trasferirli ai tubi centrifugi con una membrana filtrazione di 30 kDa taglio peso molecolare. Anche la dialisi è disponibile per questa procedura.
  6. Centrifugare questi tubi per 5 min a 4.000 x g per concentrare la soluzione nanoparticella.
  7. Aggiungere 15 mL di acqua DI a questa soluzione e centrifugare per concentrarsi di nuovo. Ripetere questo processo di pulizia almeno 10x.
    NOTA: Un'indicazione che le impurità solubili in acqua sono state rimosse è l'assenza di schiuma quando si agitano i rifiuti acquosi; dopo tutto, la maggior parte delle impurità sono disulfide di MUS con se stesso o con OT (questo può essere determinato raccogliendo il materiale ed eseguendo 1H NMR).
  8. Dopo la centrifugazione, trasferire le nanoparticelle concentrate in un tubo di centrifuga di 15 mL. Per trasformare le nanoparticelle in una polvere gestibile, o precipitarle in un solvente come l'acetone o congelare la soluzione acquosa rimanente. Quando liofilizzate, le nanoparticelle tendono a formare una polvere sciolta che si attacca alle superfici e può essere difficile da manipolare.

5. Caratterizzazione delle Nanoparticelle

  1. purezza
    1. Per verificare se le nanoparticelle sono libere da leganti non legati, sciogliere 5 mg di nanoparticelle secche in 600 - L di D2O ed eseguire una misurazione NMR 1HH delle particelle. Se non ci sono picchi taglienti dei ligandi, significa che le nanoparticelle sono prive di piccole molecole organiche.
  2. Rapporto ligando
    1. Preparare una soluzione di 20 mg/mL di metanolo-d4 di iodio. Aggiungete 600 l di questa soluzione ai 5 mg di nanoparticelle in una fiala di vetro, per incidere le nanoparticelle.
    2. Avvolgere il tappo della fiala con pellicola di paraffina e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni per 20 min. Trasferire la soluzione a un tubo NMR e acquisire uno spettro 1H NMR (400 MHz) con 32 scansioni.
  3. Densità di ligando
    1. Trasferire da 2 a 8 mg di nanoparticelle in un crogiolo TGA. Scegli un intervallo di temperatura compreso tra 30 e 900 gradi centigradi e una velocità di 5 gradi al minuto sotto il gas N 2.
  4. Distribuzione delle dimensioni
    1. Tem
      1. Preparare la soluzione di nanoparticelle da 0,1 mg/mL in acqua DI. Eliminare 5 l l della soluzione preparata sulla griglia di rame a 400 maglie di rame in carbonio. Aspetta che si asciughi.
      2. Trasferire la griglia in un supporto TEM e inserirla nel microscopio. Acquisire 5 - 10 immagini con un ingrandimento di almeno 64.000X, operato a 200 kV.
        NOTA: per aumentare il contrasto, è possibile inserire un'apertura obiettiva di 20 nm.
    2. Spettri UV-Vis
      1. Preparare una soluzione di nanoparticelle da 0,2 mg/mL in acqua DI.
      2. Inserire la quantità necessaria di questa soluzione nella cuvette di quarzo e eseguire la scansione da 200 nm a 700 nm.

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Representative Results

I passaggi di reazione per sintetizzare MUS sono mostrati figura 1. Gli spettri NMR 1H del prodotto di ogni passo sono rappresentati nella Figura 2. Il flusso di lavoro di sintesi delle nanoparticelle binarie in oro MUS:OT anfifiancico è descritto nella Figura 3. Dopo la sintesi, l'esotto delle nanoparticelle consisteva nel lavare le particelle più volte con etanolo e acqua DI. Prima di qualsiasi caratterizzazione delle nanoparticelle, la pulizia delle nanoparticelle da leganti liberi non legati era monitorata da 1H NMR in D2O, come mostrato nella Figura 4. La distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle è stata caratterizzata da TEM (Figura 5a,b). L'assorbimento localizzato della risonanza del plasmon superficiale è stato misurato mediante l'acquisizione di spettri UV-Vis (Figura 5c).

Il rapporto tra i due ligando è stato determinato incidendo il nucleo d'oro usando lo iodio, acquisendo il NMR 1H e calcolando gli importi relativi di ciascun legamento utilizzando i valori integrati. La figura 6 mostra gli spettri rappresentativi, nonché la procedura delle assegnazioni di picco NMR. Per trovare il rapporto ligando tra MUS e OT, abbiamo calcolato gli integrali dei picchi tra 0,8 - 1 (I1),1,12 - 1,55 (I2),1,6 - 1,9 (I3) e 2,6 - 3 (I4) ppm. Il picco I1 contiene il segnale di tre idrogeno OT, il picco I2 da una combinazione di 14 idrogeno MUS e 10 oT, e i picchi I3 e I4 da quattro idrogeno MUS e due idrogeno OT (per ogni picco). Pertanto, per trovare la percentuale OT, è necessario normalizzare I1 a 3 e applicare le seguenti espressioni.

Per I2,
Equation 1

Per I3 e I4 ,
Equation 2

Questi calcoli indicano il rapporto tra OT e MUS, supponendo che vi sia un'unità arbitraria di OT nel sistema. Per la figura 6B, i tre integrali hanno fornito valori simili per la percentuale OT ( vale adire, 15.3, 15.9 e 15.9 da I2, I3e I4, rispettivamente).

La copertura superficiale delle nanoparticelle è esaminata dalla TGA come mostrato nella Figura 7. I dati TGA, NMR e TEM (Figura 3) sono combinati per calcolare la densità del ligando, che è il numero di ligandi su un'unità di superficie, approssimando le particelle a una sfera. (Questo calcolo presuppone che Na ribolle come NaHSO3.) I dati TEM mostrano che il diametro medio delle nanoparticelle è di 2,4 nm, che punta a circa 18,08 nm2 (Unpar- 4pr2) della superficie (Apar) e 7.23 nm3 (Vpar- 4pr 3/3) di volume per particella (Vpar). La densità dell'oro è di 19,9 g/cm3 e la massa di una particella è 1,3969 x 10 -16 mg(Particella di massa - Vpar x la densità dell'oro - 7,23 nm 3 x 19,9 g/cm3 x 10-18 mm3/nm3). La massa residua di circa 800 gradi centigradi corrisponde al nucleo d'oro, e ci sono circa 3,7 x 1016 particelle (Npar) che sono stimate utilizzando Npar (Orodi massa /Massa particella) 5,17 mg / 1,3969 x 10-16 mg. L'area di superficie totale (Atot) delle particelle è 6,69 x 1017 nm2 (Atot , Nparx Apar, 3,69 x 1016 x 18,08 nm2). L'NMR delle nanoparticelle incise sullo iodio ha mostrato che il rapporto MUS:OT è 85:15 e la quantità di contenuto organico in TGA è di 0,00146 g. Pertanto, ci sono 3.26 x 1018 ligandi (Nligand) seguendo la formula di Nligando- [Massaorganica / ( (ROT x MwOT) - (RMUS x MwMUS)) / ( (RMUS , R OT)] x NAvogadro[ 0,00146 g / ((15 x 146 g/mol) - (85 x 267,42 g/mol)) / (85 x 15] x (6,02 x 1023) . Infine, la densità di ligando è 4,8 ligands/nm2, calcolata dividendo illigando N per Atot(4,8 x 3,26 x 1018/6,69 x 1017 nm2). I rapporti stoicometrici rispetto ai rapporti NMR dell'OT, risultanti da varie sintesi, sono confrontati nella Figura 8.

Figure 1
Figura 1: Schema della sintesi MUS. La sintesi MUS è il punto chiave per la riproducibilità della sintesi delle nanoparticelle anfifiche. Se MUS ha un alto contenuto di sale, il rapporto stoichiometrico dei ligandi può deviare. X : 9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Spettri NMR delle molecole dopo ogni fase della sintesi MUS (400 MHz). (A) Questo pannello mostra lo spettro 1H NMR di sodio undec-10-enesulfonato in D2O. (B) Questo pannello mostra lo spettro 1H NMR di sodio 11-acetylthio-undecanesulfonate in D2O. (C) Questo pannello mostra lo spettro 1H NMR di 11-mercapto-1-undecanesulfonato in D2O. In tutti gli spettri, il simbolo : indica i picchi del solvente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Schematico della sintesi delle nanoparticelle anfica. (A) Questo pannello mostra la preparazione della reazione di riduzione chimica in una fase utilizzando l'etanolo come solvente. (B) Il complesso gold-thiolate può formarsi prima dell'aggiunta di un agente degrado. In questa fase, la soluzione del sale d'oro è diventata torbida. (C) Durante l'aggiunta dropwise dell'agente di riduzione, si formano nanoparticelle d'oro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Pulizia delle nanoparticelle da ligandi liberi non reagiti. (A) Questo pannello mostra lo spettro 1H NMR delle nanoparticelle subito dopo la sintesi e l'essiccazione sottovuoto. D2O viene utilizzato come solvente per l'analisi NMR da 1H. Picchi taglienti mostrati da frecce rosse indicano l'esistenza di leganti liberi non legati. (B) Questo pannello mostra lo spettro 1H NMR delle nanoparticelle dopo un'accurata purificazione(cioè, fusi e centrifugazione con etanolo e acqua DI). La freccia rossa indica la parte ingrandita dello spettro, in cui i picchi sono ampi, non taglienti come prima indicando l'assenza di ligandi liberi. In entrambi gli spettri, il simbolo : indica i picchi di solvente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle. (A) Questo pannello mostra un'immagine TEM rappresentativa delle nanoparticelle MUS:OT. La barra della scala è di 20 nm. (B) Questo pannello mostra un istogramma delle dimensioni centrali delle nanoparticelle sulla base di diverse immagini TEM. (C) gli spettri UV-Vis delle nanoparticelle hanno mostrato il caratteristico picco di risonanza del plasmone superficiale delle nanoparticelle a circa 520 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Calcolo del rapporto di ligando. (A) Questo pannello mostra spettri NMR rappresentativi di combinazioni di disulfidi (come riferimenti per i ligandi dopo l'incisione del nucleo) e di incarichi di picco per diversi protoni nel MeOD-d4. (B) Questo pannello mostra 1H spettri NMR di nanoparticelle incise in MeOD-d4. In tutti gli spettri, il simbolo : indica i picchi del solvente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Analisi della densità dei ligandi. Una misurazione TGA delle nanoparticelle è stata eseguita per determinare il rapporto e la densità del materiale organico (ligandi). Il grafico delle misurazioni viene tracciato come percentuale di peso rispetto a. temperatura. OT desorbs prima, tra 176 s C a 233 gradi (linee verticali). Il MUS si degrada in molecole più piccole ed è completamente bruciato a circa 800 gradi centigradi. La percentuale di peso rimanente corrisponde al nucleo d'oro delle nanoparticelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Confronto dei rapporti stoicometrici e NMR di OT sulle particelle. È possibile sintonizzare l'anfifilia delle nanoparticelle modificando il rapporto stoicometrico iniziale tra MUS e OT nella reazione. Le barre di errore indicano il limite superiore e inferiore del contenuto OT acquisito utilizzando i rapporti stoichiometrici indicati. I rapporti stoichiometrici del 10%, del 20%, ecc., fino al 90% di OT, sono stati sintetizzati per osservare i limiti del contenuto oT sulle superfici delle nanoparticelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo descrive prima la sintesi del ligando MUS e, quindi, la sintesi e la caratterizzazione delle nanoparticelle d'oro dell'anfihiphilico MUS:OT. La sintesi del MUS con un contenuto di sale minimo consente una migliore affidabilità del rapporto stoichiometrico tra i ligandi durante la sintesi delle nanoparticelle, che è un fattore chiave per la sintesi riproducibile delle nanoparticelle MUS:OT con un bersaglio idrofobico contenuto (Figura 8). L'uso del metanolo come solvente comune per MUS e OT, insieme alla sintesi delle particelle in etanolo, consente una sintesi affidabile delle nanoparticelle d'oro MUS:OT. I metodi di caratterizzazione qui presentati costituiscono un elenco minimo di esperimenti necessari per acquisire informazioni sufficienti sulle nanoparticelle per verificare il risultato della loro sintesi.

Ci sono quattro fasi critiche in questo protocollo: (i) la sintesi di MUS con un basso contenuto di sale insieme alla rimozione di impurità colorate nel secondo passo e una cristallizzazione di MUS puro alla fine; ii) sintonizzare e determinare il rapporto stoichiometrico tra MUS e OT; (iii) l'emostatura delle nanoparticelle; e (iv) la caratterizzazione delle nanoparticelle.

Durante la formazione delle nanoparticelle, MUS si lega preferibilmente alle superfici delle nanoparticelle, che potrebbero essere correlate alla solubilità delle nanoparticelle risultanti. Ad esempio, un rapporto di alimentazione stoicometrico 2:1 tra MUS e OT produce il 15% di OT sulla superficie se calcolato utilizzando i dati del NMR 1H di nanoparticelle d'oro inciso. Pertanto, un contenuto più elevato di OT deve essere utilizzato durante la sintesi delle particelle (Figura 8) per ottenere una nanoparticella con un rapporto MUS a OT inferiore; in altre parole, una particella più idrofobica. Per valutare il rapporto stoichiometrico tra i ligandi sulla superficie delle nanoparticelle, è necessario assicurarsi che non ci siano leganti non legati nella soluzione. La presenza di ligandi non legati influisce sulla determinazione del rapporto ligando sulle nanoparticelle e sulla densità, insieme a test ed esperimenti successivi che possono portare a interpretazioni errate. Cicli di pulizia ripetitivi con diversi solventi (come l'etanolo e l'acqua DI) sono necessari per eliminare tutti i ligostati non legati e altre impurità (sottoprodotti di boroidride di sodio, ioni d'oro, ecc). 1 : il nome del H NMR è importante confermare la purezza delle nanoparticelle. L'effetto di ampliamento della linea dei leganti a causa del complesso ambiente chimico sulle nanoparticelle amplia i picchi corrispondenti ai ligandi, mentre qualsiasi segnale acustico proviene da molecole non legate22. Inoltre, a causa della mobilità limitata, i picchi NMR corrispondenti al metilene adiacente ai gruppi di tiolo non possono essere rilevati, che è un'altra firma della nanoparticella quando viene ispezionata utilizzando 1H NMR. Una volta che le nanoparticelle sono pulite, il nucleo metallico è inciso con iodio. L'incisione allo iodio è un metodo consolidato per quantificare il rapporto ligando sulle nanoparticelle. Per esempio, due decenni fa, Murray ealtri ha riportato la determinazione della composizione del monostrato sulle nanoparticelle d'oro dopo l'incisione di iodio, in cui lo iodio decompone il nucleo d'oro e rilascia i ligandi tiolati come disulfidi23. L'affidabilità del metodo di incisione allo iodio è stata stabilita utilizzando altri metodi; ad esempio, Harkness e altri hanno riferito che il rapporto di ligando ottenuto da NMR rientra nell'1% della deviazione dalle misurazioni della spettroscopia di massa24.

TGA è un metodo semplice per calcolare il contenuto organico sulle nanoparticelle. La stima della densità dei leganti superficiali presuppone che tutti i ligandi tiolati si legano agli atomi d'oro di superficie e tutti i ligandi liberi siano stati rimossi durante la purificazione. Per determinare la densità del ligando, vengono fatte diverse ipotesi, principalmente che le particelle sono sferiche, che viene utilizzato per calcolare la superficie, così come la densità di imballaggio, del nucleo d'oro. TEM fornisce una distribuzione delle dimensioni dei nuclei d'oro delle nanoparticelle che possono essere utilizzati per calcolare la superficie approssimativa di una nanoparticella. La sintesi delle nanoparticelle qui descritta produce una popolazione polidisperspersa di particelle con un diametro medio di 2 - 3 nm e una deviazione delle dimensioni fino al 30%. Inoltre, il raggio medio, utilizzato per calcolare il volume medio di una particella (approssimando le particelle alle sfere), combinato con la densità dell'oro, consente il calcolo della massa di una nanoparticella. Quindi, la massa misurata da TGA oltre 800 gradi centigradi consente il calcolo del numero di particelle inizialmente presenti. Utilizzando questo valore e la dimensione media del nucleo, è possibile stimare la superficie totale delle nanoparticelle d'oro. Il rapporto di ligando calcolato dai dati acquisiti con 1 spettroscopia NMR H consente il calcolo del numero di talpe dei ligandi sulla superficie delle nanoparticelle. Il rapporto molare tra i ligandi sulla superficie delle nanoparticelle d'oro fornisce la densità del ligando (Figura 7). Le nanoparticelle pulite hanno circa 4 ligando per nm2. I dati TGA possono anche essere utilizzati per stimare il rapporto ligando, se l'intervallo di temperatura in cui desorb dalla superficie d'oro è noto per ogni ligando, e la desortteria avviene a intervalli di temperatura separati.

In sintesi, questo protocollo fornisce un modo semplice per sintetizzare il ligando MUS con un basso contenuto di sale e nanoparticelle d'oro MUS:OT anfibolhili. Uno dei fattori chiave della riproducibilità di queste nanoparticelle è il basso contenuto di sale inorganico nel MUS utilizzato. Queste nanoparticelle sono stabili siacome polvere che in soluzione (ad esempio,H2O e quelle fisiologicamente rilevanti), che dovrebbero essere sottolineate come prerequisito per molte applicazioni. Una caratterizzazione approfondita delle dimensioni e delle proprietà superficiali delle nanoparticelle anfifili è essenziale per applicazioni future in cui il grado di anfifilia può svolgere un ruolo chiave.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziano la Fondazione nazionale svizzera per la scienza e, in particolare, la NCCR "Ingegneria dei sistemi molecolari". Ringraziano il sostegno della Divisione II della Fondazione nazionale svizzera per la scienza. Tutti gli autori ringraziano Quy Ong per le discussioni fruttuose e per la revisione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-bromo-1-undecene Sigma Aldrich 467642-25 ml
Sodium Sulfite Sigma Aldrich S0505-250 g
Benzyltriethyl-ammonium bromide Sigma Aldrich 147125-25 g
Methanol VWR BDH1135-2.5 LP
DI water Millipore ZRXQ003WW Deionized water
1 L round bottom flask DURAN 24 170 56
Diethyl ether Sigma Aldrich 1.00930 EMD Millipore
Stirring bar Sigma Aldrich Z329207,
Dow Corning High Vacuum Grease Sigma Aldrich Z273554 ALDRICH
Filtering flask DURAN 20 201 63
Filtering Buchner Funnel FisherSci 11707335
Ethanol >99.8%, ACS, Reagent VWR 2081.321DP
Deuterium dioxide Sigma Aldrich 151882 ALDRICH
Thioacetic acid 96% Sigma Aldrich T30805 ALDRICH
Carbon black Sigma Aldrich 05105-1KG
Celite Sigma Aldrich D3877 SIGMA-ALDRICH Filtration medium
Condenser Sigma Aldrich Z531154
Hydrochloric acid, ACS reagent 37% Sigma Aldrich 320331 SIGMA-ALDRICH
Sodium Hydroxide, BioXtra, pellets (anhydrous) Sigma Aldrich S8045 SIGMA-ALDRICH
Centrifuge tubes VWR 525-0155P
250 mL round bottom flask DURAN 24 170 37
500 mL round bottom flask DURAN 24 170 46
Nitric acid, fACS reagent 70% Sigma Aldrich 438073 SIGMA-ALDRICH
Gold(III) chloride trihydrate >99.9% trace metal basis Sigma Aldrich 520918 ALDRICH
1-octanethiol >98.5% Sigma Aldrich 471836 ALDRICH
Sodium Borohydride purum p.a.>96% Sigma Aldrich 71320 ALDRICH
addition funnel SIgma Aldrich Z330655 SIGMA
Funnel DURAN 21 351 46
2V folded filtering papers Whatman 1202-150
Amicon filters Merck UFC903024
Iodine, ACS reagent, >99.8%, solid Sigma Aldrich 207772 SIGMA-ALDRICH
5 mm NMR-Tubes, Type 5HP (high precision) Armar 32210.503 Length 178 mm
Methanol-d4 99.8 atom%D Armar 16400.2035
TGA crucible Thepro 9095-9270.45
400 mesh carbon supported copper grid Electron Microscopy Science CF400-Cu
quartz cuvette Hellma Analytics 100-1-40

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References

  1. Verma, A., et al. Effect of surface properties on nanoparticle-cell interactions. Small. 6 (1), 12-21 (2010).
  2. Yeh, Y. -C., et al. Gold nanoparticles: preparation, properties, and applications in bionanotechnology. Nanoscale. 4 (6), 1871-1880 (2012).
  3. Mirza, A. Z. A novel drug delivery system of gold nanorods with doxorubicin and study of drug release by single molecule spectroscopy. Journal of Drug Targeting. 23 (1), 52-58 (2015).
  4. Mirza, A. Z., et al. Fabrication and characterization of doxorubicin functionalized PSS coated gold nanorod. Arabian Journal of Chemistry. , In Press (2014).
  5. Nel, A. E., et al. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8 (7), 543-557 (2009).
  6. Yeo, E. L. L., et al. Protein Corona around Gold Nanorods as a Drug Carrier for Multimodal Cancer Therapy. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3 (6), 1039-1050 (2017).
  7. Lin, J., et al. Cell membranes open "doors" for cationic nanoparticles/ biomolecules: Insights into uptake kinetics. ACS Nano. 7 (12), 10799-10808 (2013).
  8. Saha, K., et al. Regulation of Macrophage Recognition through the Interplay of Nanoparticle Surface Functionality and Protein Corona. ACS Nano. 10 (4), 4421-4430 (2016).
  9. Moyano, D. F., et al. Fabrication of corona-free nanoparticles with tunable hydrophobicity. ACS Nano. 8 (7), 6748-6755 (2014).
  10. Pengo, P., et al. Gold nanoparticles with patterned surface monolayers for nanomedicine: current perspectives. European Biophysics Journal. 46 (8), 749-771 (2017).
  11. Kuna, J. J., et al. The effect of nanometre-scale structure on interfacial energy. Nature Materials. 8 (10), 837-842 (2009).
  12. Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nature Materials. 7 (7), 588-595 (2008).
  13. Van Lehn, R. C., et al. Lipid tail protrusions mediate the insertion of nanoparticles into model cell membranes. Nature Communications. 5, 4482-4493 (2014).
  14. Cagno, V., et al. Broad-spectrum non-toxic antiviral nanoparticles with a virucidal inhibition mechanism. Nature Materials. 17 (2), 195-203 (2018).
  15. Uzun, O., et al. Water-soluble amphiphilic gold nanoparticles with structured ligand shells. Chemical Communications. 2 (2), 196-198 (2008).
  16. Huang, R., et al. Colloidal stability of self-assembled monolayer-coated gold nanoparticles: The effects of surface compositional and structural heterogeneity. Langmuir. 29 (37), 11560-11566 (2013).
  17. Carney, R. P., et al. Electrical method to quantify nanoparticle interaction with lipid bilayers. ACS Nano. 7 (2), 932-942 (2013).
  18. Van Lehn, R. C., et al. Effect of particle diameter and surface composition on the spontaneous fusion of monolayer-protected gold nanoparticles with lipid bilayers. Nano Letters. 13 (9), 4060-4067 (2013).
  19. Huang, R., et al. Effects of surface compositional and structural heterogeneity on nanoparticle-protein interactions: Different protein configurations. ACS Nano. 8 (6), 5402-5412 (2014).
  20. Van Lehn, R. C., et al. Free energy change for insertion of charged, monolayer-protected nanoparticles into lipid bilayers. Soft Matter. 10 (4), 648-658 (2014).
  21. Ong, Q., et al. Characterization of Ligand Shell for Mixed-Ligand Coated Gold Nanoparticles. Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1911-1919 (2017).
  22. Marbella, L. E., et al. NMR techniques for noble metal nanoparticles. Chemistry of Materials. 27 (8), 2721-2739 (2015).
  23. Templeton, A. C., et al. Reactivity of Monolayer-Protected Gold Cluster Molecules Steric Effects. Journal of American Chemical Society. 120 (8), 1906-1911 (1998).
  24. Harkness, K. M., et al. A structural mass spectrometry strategy for the relative quantitation of ligands on mixed monolayer-protected gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 82 (22), 9268-9274 (2010).

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Chimica Numero 149 nanoparticelle d'oro anfibolico ligando solforato sintesi caratterizzazione rivestimento di ligando binario monostrato auto-assemblato
Sintesi e caratterizzazione delle nanoparticelle d'oro dell'anfifile
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Guven, Z. P., Silva, P. H. J., Luo, Z., Cendrowska, U. B., Gasbarri, M., Jones, S. T., Stellacci, F. Synthesis and Characterization of Amphiphilic Gold Nanoparticles. J. Vis. Exp. (149), e58872, doi:10.3791/58872 (2019).

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