Summary
Наночастицы амфифилического золота могут быть использованы во многих биологических применениях. Представлен протокол обобщить золотые наночастицы, покрытые бинарной смесью лигандов, и подробную характеристику этих частиц.
Abstract
Золотые наночастицы, покрытые смесью 1-октанетиола (OT) и 11-меркапто-1-undecane сульфонической кислоты (MUS) были широко изучены из-за их взаимодействия с клеточными мембранами, липидными двуслойиками и вирусами. Гидрофильные лиганды делают эти частицы коллоидно стабильными в входящих растворах, а сочетание с гидрофобными лигандами создает амфифиловую частицу, которая может быть загружена гидрофобными препаратами, предохранителем липидных мембран и противостоять неспецифическим белка адсорбции. Многие из этих свойств зависят от размера наночастиц и состава оболочки лиганда. Поэтому крайне важно иметь воспроизводимый синтетический метод и надежные методы характеристики, которые позволяют определить свойства наночастиц и состав оболочки лиганда. Здесь представлено однофазное химическое сокращение, за которым последует тщательная очистка для синтеза этих наночастиц диаметром менее 5 нм. Соотношение между двумя лигандами на поверхности наночастиц может быть настроено через их стойометрическое соотношение, используемое во время синтеза. Мы демонстрируем, как различные обычные методы, такие как электронная микроскопия передачи (TEM), ядерный магнитный резонанс (NMR), термогравиметрический анализ (TGA) и ультрафиолетовая видимая (УФ-Вис) спектрометрия, объединяются в комплексно характеризуют физико-химические параметры наночастиц.
Introduction
Лиганд оболочки золотых наночастиц могут быть разработаны, чтобы показать несколько различных свойств, которые могут быть применены для решения проблем в биомедицине1,2,3,4. Такая универсальность позволяет контролировать межмолекулярные взаимодействия между наночастицамии биомолекулами 5,6,7. Гидрофобность и заряд играют решающую роль, а также другие параметры поверхности,которые влияют на то, как наночастицы взаимодействуют с биомолекулами 5,8,9. Для настройки поверхностных свойств наночастиц выбор молекул тиолата, которые составляют оболочку лиганда, предлагает множество возможностей, в соответствии с испрашиваемыми характеристиками. Например, смесь молекул лиганд с гидрофобными игидрофильные (например, заряженные) конечные группы часто используются для генерации амфифильных наночастиц10,11.
Один из ярких примеров этого типа наночастиц защищен смесью OT и MUS (в дальнейшем называется MUS:OT наночастиц), которые, как было показано, обладают многими соответствующими свойствами12,13,14. Во-первых, с составом оболочки лиганда 66% MUS (далее 66:34 MUS:OT), коллоидная устойчивость наночастиц высока, достигая до 33% в весе в деионизированной воде, а также в фосфат-буферизированном соленом (1x, 4 мМ фосфат, 150 мМ NaCl)15. Более того, эти частицы не осаждается при относительно низких значениях рН: например, при рН 2,3 и при концентрации соли 1 M NaCl15эти наночастицы остаются коллоидно стабильными в течение нескольких месяцев. Stoichiometric соотношение между двумя молекулами на оболочке лиганда имеет важное значение, поскольку он диктует коллоидной стабильности в решениях с высокой ионной силой16.
Эти частицы были показаны, чтобы пройти клеточной мембраны без porating его, через энергонезависимый путь1,12. Спонтанное слияние между этими частицами и липидными двуслойными слоями лежит в основе их диффузии через клеточные мембраны17. Механизмом этого взаимодействия является минимизация контакта между гидрофобной областью поверхности, доступной для растворителя, и молекулами воды при слиянии с липидными двуслойками18. По сравнению с наночастицами all-MUS (наночастицы, имеющие только ЛИганду MUS на их оболочке), более высокая гидрофобность на смешанных наночастицах MUS:OT (например, при составе 66:34 MUS:OT) увеличивает пролет диаметра ядра, который может слиться с липидом двуслойные18. Различные организации самосборки оболочки лиганда коррелируют с различными режимами связывания 66:34 MUS:OT наночастиц с различными белками, такими как альбумин и убиквитин, по сравнению с частицами all-MUS19. Недавно было сообщено, что 66:34 MUS:OT наночастицы могут быть использованы в качестве широкого спектра спектра противовирусного агента, который необратимо разрушает вирусы из-за многовалентных электростатических связей MUS лигандов и нелокальных соединений OT лигандов для капсида белки14. Во всех этих случаях было установлено, что гидрофобное содержание, а также размер ядра наночастиц, определяет, как эти био-нано взаимодействия происходят. Эти разнообразные свойства MUS:OT наночастицы побудили многих исследований компьютерного моделирования, которые направлены на прояснение механизмов, лежащих в основе взаимодействия между частицами MUS:OT и различных биологических структур, таких как липидные дразнители20.
Подготовка наночастиц MUS:OT-защищенных Au создает несколько проблем. Во-первых, заряженный лиганд (MUS) и гидрофобный лиганд (OT) недопустимы. Таким образом, растворимость наночастиц и лигандов должна быть учтена во время синтеза, а также при характеристике. Кроме того, чистота молекул MUS ligand, в частности, содержание неорганических солей в исходном материале – влияет на качество, воспроизводимость, а также на краткосрочную и долгосрочную коллоидную стабильность наночастиц.
Здесь описан подробный синтез и характеристика этого класса амфифилических золотых наночастиц, защищенных смесью MUS и OT. Сообщается, что протокол синтеза отрицательно заряженного лиганда MUS обеспечивает чистоту и, следовательно, воспроизводимость различных синтезов наночастиц. Затем подробно сообщается о процедуре генерации этих наночастиц, основанной на общем однофазном синтезе с последующим тщательным очищением. Различные необходимые методы характеристики21,такие как TEM, UV-Vis, TGA и NMR, были объединены для получения всех необходимых параметров для любых дальнейших биологических экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез 11-меркапто-1-undecanesulfonate (MUS)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть использован в любом желаемом масштабе. Здесь описана шкала 10 г.
- Натрий недек-10-энсульфонат
- Добавить 11-бромо-1-undecene (25 мл, 111,975 ммоль), сульфит натрия (28,75 г, 227,92 ммоль) и бромид бензилтриэтиламоний (10 мг) к смеси 200 мл метанола (MeOH) и 450 мл деионизированной (DI) воды (4:9 v/v MEOH: HO OO .
- Рефлюкс реакционная смесь на 102 градуса Цельсия для 48 ч. Cap системы с механизмом снятия давления, например, воздушный шар с иглой, или просто игла. Эта реакция не чувствительна к атмосферным газам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Решение становится бесцветным, когда реакция завершена. - Соедините реакционную смесь к роторному испарителю, чтобы испарить MeOH и уменьшить объем примерно до 300 мл.
- Перенесите оставшийся раствор в воронку 1 л.
- Извлеките оставшийся ваквивый раствор 5x с диэтил-эфиром, используя добавочная воронку. Неотреагированный 11-бромо-1-undecene остается в фазе диэтил эфира и сульфонированный продукт в H2O.
ВНИМАНИЕ: Отпустите любое давление накопления часто во время извлечения, и проконсультироваться правильное использование добавок воронки. - Соберите окончательный извлеченный раствор воды в 1 l однообразную круглую нижнюю колбу.
- Соедините флягу реакции к роторному испарителе, поставив немного жира (или тефлоновые полоски кольца или любой другой герметик) между колбу и ловушкой.
- Уменьшите вакуум медленно, чтобы испарять aqueous фазу в роторном испарителе. Поскольку продукт является сурфактантом, вспенивание будет происходить во время испарения. Чтобы обойти эту проблему, следуйте инструкциям на следующем шаге.
- Добавьте этанол в смесь, чтобы ускорить испарение H2O и предотвратить вспенивание. При перезапуске из-за снижения содержания этанола прекратите испарение, удалите колбу из роторного испарителя, добавьте больше этанола (около трети от общего объема) и переоборудите колбу с роторным испарителем. Повторите этот процесс до тех пор, пока раствор смеси значительно не уменьшится и не образует пузырьков.
- Высушите белый порошок непосредственно путем подключения колбы к высокому вакууму. Чем суше порошок, тем меньше неорганических солей будет ползти в последующие шаги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тепло может быть использовано для высыхания продукта, например, удерживая колбу под вакуумом в ванной с 60 градусов цельсия и оставленной на ночь. - Приостановить белый порошок в 400 мл метанола в колбе. Соникат, чтобы растворить максимальное количество продукта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага состоит в том, чтобы растворить продукт, но не неорганические побочные продукты, такие как избыток сульфита натрия и бромистого натрия, которые имеют ограниченную растворимость в метаноле. Используйте метанол с самым низким содержанием воды возможно, потому что вода в метаноле увеличит растворимость неорганических побочных продуктов в растворителе. - Чтобы увеличить растворимость продукта, метанол можно аккуратно нагревать близко к точке кипения (64 градусов по Цельсию).
ВНИМАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы работать под дымом капот во время нагрева колбы. Пары испаряемого метанола опасны. - Фильтр раствор, чтобы удалить метанол нерастворимые неорганические побочные продукты. Используйте фильтрующую колбу, соединенную с вакуумным насосом, и фильтрующую воронку с количественной фильтровальной бумагой или боросиликатный фильтр. Как продукт, так и неорганические соли являются белыми порошками при сухом: продукт растворяется в метаноле, в то время как соли нет.
- Перенесите отфильтрованное решение из фильтрующей колбы в колбу с круглым дном 1 л.
- Соедините колбу с роторным испарителем и испарите метаноликовый раствор при 45 градусах Цельсия, растворите белый порошок в метаноле и процедите раствор (протокольные шаги 1.1.7, 1.1.8 и 1.1.9). Повторите этот процесс по крайней мере 2x, чтобы уменьшить количество неорганической соли.
- Соберите белый, метанол растворимый порошок (примерно 30 г, в таком масштабе).
- Растворите примерно 10 мг продукта в 500 Л л D2O и перенесите раствор в трубку ЯМР.
- Выполните 1HMR спектрометрии на продукт в D2O на 400 МГц с 32 сканирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пиковые задания для 1H NMR (D2O) 5,97 (м, 1H), 5,09 (м, 2H), 2,95 (т, 2H), 2,10 (м, 2H), 1,77 (кв, 2H), 1,44 (br s, 12H).
- Натрий 11-ацетилтио-undecanesulfonate
- Растворите приблизительно 30 г натрия undec-10-enesulfonate (реакционный продукт раздела 1.1) в 500 мл метанола внутри 1 круглого дна колбу. Добавьте в раствор избыток тиоацетической кислоты в 2,6-кратной избыточной тиоацетической кислоты и перемешайте его перед ультрафиолетовой лампой (250 Вт) за одну ночь (12 ч). В случае, если УФ-лампа не доступна, реакция может быть выполнена путем рефлюксирования с помощью радикального инициатора, таких как azobisisisobutyronitrile (AIBN); однако настоятельно рекомендуется использовать ультрафиолетовую лампу.
ВНИМАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы работать под капотом дыма во все времена. Если колбу необходимо транспортировать в другое пространство, где находится уф-лампа, запечатайте колбу, чтобы избежать распространения сильного запаха тиоацетической кислоты. Упражнение уход при эксплуатации УФ-лампы: полностью блокировать пространство, где лампа находится и проконсультироваться с руководством учреждения безопасности о том, как работать УФ лампы. - Мониторинг реакции, принимая аликвоты в размере 2 мл от реакции, испаряйте растворитель и добавляйте деютированную воду, чтобы проверить с 1HMr. Как только пики, соответствующие двойной связи исчезают, остановить реакцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, после 12 ч перед ультрафиолетовой лампой, реакция завершена. Если реакция смесь становится мутной, добавить больше MeOH и продолжить воздействие уф-излучения в течение шести дополнительных часов. - Испарите все MeOH в роторном испарителе до тех пор, пока твердый остаток не станет оранжево-красным. Если оставить достаточно долго, продукт становится коричневым до черного цвета.
ВНИМАНИЕ: Работайте осознанно из-за сильных запахов от тиоацетической кислоты. Сильные запахи любых разливов тиолата могут быть нейтрализованы с помощью водного раствора отбеливателя (гипохлорит натрия). - Используя фильтрующую колбу, промойте продукт диэтил-эфиром, чтобы удалить излишки тиоацетической кислоты, пока в супернатанте диэтил-эфира не появятся более цветные (оранжево-желтые) вещества. Высушите твердый под высоким вакуумом, а затем растворите его в метаноле, уступив желто-оранжевый раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить достаточно метанола, чтобы растворить продукт.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет может меняться на этом этапе. - Добавьте в раствор 3 г углеродного черного цвета, энергично перемешайте и процедите смесь через фильтрационную среду (см. Таблица Материалов), охватывающую две трети рифленой фильтровальной бумаги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пористая структура углеродного черного захватывает цветной побочный продукт материала (и некоторые из продукта). Отфильтрованное решение должно быть четким. Если отфильтрованное решение еще окрашено (желтый), повторите этот процесс. - Выпарить растворитель полностью в роторный испаритель и собрать около 35 г белого порошка.
- Растворите 10 мг продукта в 500 л от D2O и перенесите раствор на ЯМР-трубки.
- Выполните 1HMr на продукте в D2O на 400 МГц с 32 сканирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пиковые задания для HMR (D2O) 2,93 (т, 4H), 2,40 (ы, 3H), 1,77 (м, 2H), 1,62 (м, 2H), 1,45 (br s, 14H).
- Растворите приблизительно 30 г натрия undec-10-enesulfonate (реакционный продукт раздела 1.1) в 500 мл метанола внутри 1 круглого дна колбу. Добавьте в раствор избыток тиоацетической кислоты в 2,6-кратной избыточной тиоацетической кислоты и перемешайте его перед ультрафиолетовой лампой (250 Вт) за одну ночь (12 ч). В случае, если УФ-лампа не доступна, реакция может быть выполнена путем рефлюксирования с помощью радикального инициатора, таких как azobisisisobutyronitrile (AIBN); однако настоятельно рекомендуется использовать ультрафиолетовую лампу.
- 11-меркапто-1-undecanesulfonate (MUS)
- Рефлюкс натрия 11-ацетилтио-undecanesulfonate при 102 кв С в 400 мл 1 М HCl на 12 ч, чтобы расщеплять thioacetate группы и получить тиол.
- Перенесите продукт в колбу 1,5 л или 2 л с круглого дна. Добавьте 200 мл 1 М НаОГ к окончательному решению и подогнайте его 400 мл воды DI, чтобы иметь окончательный объем 1 л. Это позволит сохранить раствор кислым и предотвратить кристаллизацию неорганических солей в качестве побочного продукта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная нейтрализация раствора рН 7 приведет к кристаллизации продукта, нерастворимого в метаноле. - Держите четкое решение при 4 градусах Цельсия, и он кристаллизуется в одночасье. Продукт кристаллизуется как тонкие кристаллы, которые вязкие, когда мокрые.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ускорить кристаллизацию, добавьте presynthesized MUS к решению, если таковой имеется. - Декант ясно супернатант и центрифуга вниз вязкий белый продукт в 50 мл центрифуговых труб в течение 5 мин на 4000 х г.
- Декант супернатант в другую колбу и высушить белые гранулы под высоким вакуумом - в зависимости от центрифуги доступны, это может быть 2 - 16 труб или более.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрация не рекомендуется из-за сурфактантного характера продукта; чрезмерное пенообразующее произойдет, и большая часть продукта будет потеряна. - Соберите примерно 12 г (около 30% урожайности) метаноловорастворимого МУС с этого шага очистки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что порошок штраф и электростатического-он, как правило, придерживаться шпателей и поверхностей контейнеров. Кроме того, больше материала можно извлечь из супернатанта шага центрифугации, сократив объем (примерно до трети от его первоначального значения) и удерживая его на уровне 4 градусов по Цельсию. Снижение объема еще больше (на 75%) увеличить урожайность на этом этапе. - Растворите 10 мг продукта в 500 л от D2O и перенесите раствор на ЯМР-трубки.
- Выполните 1HMr на продукте в D2O на 400 МГц с 32 сканирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пиковые задания H Mr (D2O) 2,93 (т, 4H), 2,59 (т, 3H), 1,78 (м, 2H), 1,65 (м, 2H), 1,44 (br s, 14H). Расчетная моляровая масса (включая счетчик натрия) продукта составляет 290,42 г/мол.
2. Синтез наночастиц: Подготовка реагентов
- Очистите всю стеклянную посуду (один 250 мл и один 500 мл однолевой кругло-нижней колбы, воронку 100 мл и небольшую воронку) со свежими водными региями (три части соляной кислоты на одну часть азотной кислоты). Промыть стеклянную посуду с избыточным количеством воды внутри дыма капот и удалить все пары. Затем промыть стеклянную посуду этанолом и высушить в лабораторной стеклянной духовке (рекомендуется 40 - 60 градусов по Цельсию).
- Взвешивание 177,2 мг (0,45 ммоль) золота (III) тригидрат хлорида (HAuCl4Х3H2O) в небольшой стеклянный флакон (10 или 20 мл чистых стеклянных флаконов, или на бумаге для взвешивания).
- Вес 87 мг (0,3 ммоль) MUS в стеклянной флакон20 мл.
- Добавьте 10 мл метанола, чтобы растворить MUS. Соните его в ультразвуковой ванне, пока не будет видно твердого материала, чтобы обеспечить полное растворение.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, используя тепловую пушку или теплую ванну (60 градусов по Цельсию), нагреть раствор осторожно. При нагревании, запустить холодную воду через внешнюю часть колбы, чтобы вернуть его к комнатной температуре. - Добавьте 26 кЛ (0,15 ммоль) ОТ в раствор метанола и агитировать его, чтобы смешать лиганды.
- Взвесить 500 мг (13 ммоль)борогидрида натрия (NaBH 4) и добавить его в 100 мл этанола в 250 мл круглого дна колбу. Энергично перемешайте с помощью магнитного перемешивания (600 - 800 об/мин). (NaBH4 занимает от 10 до 20 минут, в зависимости от сорта, чтобы сформировать четкое решение в этанол.)
3. Синтез золотых наночастиц
- Растворите золотую соль в 100 мл этанола в колбе круглого дна 500 мл и начните помешивать при 800 об/мин с помощью магнитной панели на перемешивающейся пластине. Убедитесь, что золотая соль полностью растворяется.
- Поместите воронку 100 мл над кругло-нижней колбе. Положите воронку на верхней части воронки добавления с количественным бумажным фильтром внутри. Когда NaBH4 растворится в этаноле, начните фильтровать раствор в добавочной воронке через фильтровальную бумагу в воронке.
- Добавьте раствор лиганда в реакционную смесь. Подождите 15 минут для формирования золото-тиолатного комплекса. Изменение цвета реакционной смеси с полупрозрачного желтого на мутный желтый указывает на формирование золотистого тиолата комплекса.
- Начните добавлять отфильтрованное решение NaBH4 из воронки добавленной воронки dropwise. Отрегулируйте интервал времени капель так, чтобы добавление NaBH4 занимает около 1 ч.
- После полного добавления NaBH4,удалить воронку. Держите перемешивания реакции еще на час. В конце реакции, удалить магнитные перемешивания бар с помощью магнита, размещенного на внешней стороне колбы.
- Используйте перегородку, чтобы закрыть колбу и проколоть иглу в перегородку, чтобы освободить H2 газа, который будет развиваться после реакции.
- Держите реакционную смесь в лабораторном холодильнике (4 кВ), чтобы осаждать наночастицы на ночь.
4. Работа синтеза
- Декант супернатант этанола, чтобы уменьшить объем.
- Перенесите оставшийся осадок на 50 мл центрифуговых труб окни и центрифугу на 3 мин при 4000 х г.
- Декант супернатант, разогнать наночастицы снова с этанолом путем вихря, и центрифуги их снова. Повторите этот процесс стирки 4x.
- Высушите наночастицы под вакуумом, чтобы удалить остаточный этанол.
- Чтобы очистить наночастицы от свободных гидрофильных лигандов/молекул, растворить осадки в 15 мл воды DI и перенести их в центрифугные трубки с фильтрационной мембраной молекулярного веса 30 кДА. Диализ также поддается для этой процедуры.
- Centrifuge эти трубы в течение 5 мин на 4000 х г, чтобы сконцентрировать раствор наночастиц.
- Добавьте 15 мл воды DI к этому раствору и центрифугу, чтобы снова сконцентрироваться. Повторите этот процесс очистки по крайней мере 10x.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одним из признаков того, что водорастворимые примеси были удалены, является отсутствие пены при агитации водных отходов; в конце концов, большинство примесей дисульфиды MUS с самим собой или с OT (это может быть определено путем сбора материала и выполнения 1H NMR). - После центрифугации перенесите концентрированные наночастицы в центрифугу мощностью 15 мл. Чтобы превратить наночастицы в управляемый порошок, либо осаждает их в растворителе, таком как ацетон, либо замораживают сухой оставшийся ваквочный раствор. Когда лиофилизированные, наночастицы, как правило, образуют свободный порошок, который прилипает к поверхности и может быть трудно манипулировать.
5. Характеристика наночастиц
-
Чистоты
- Чтобы проверить, свободны ли наночастицы от неограниченных лигандов, растворите 5 мг сухих наночастиц в 600 Л Л d2O и выполните 1HMR измерение частиц. Если нет резких пиков лигандов, это означает, что наночастицы свободны от мелких органических молекул.
-
Коэффициент лиганда
- Приготовьте 20 мг/мл метанола-d4 раствора йода. Добавьте 600 л этого раствора в 5 мг наночастиц в стеклянном флаконе, чтобы вытравить наночастицы.
- Оберните крышку флакона парафинаи пленкой и снизите ее в ультразвуковую ванну в течение 20 минут. Перенесите раствор в трубку ЯМР и приобретите спектр 1HMr (400 МГц) с 32 сканами.
-
Плотность лиганда
- Перенесите от 2 до 8 мг наночастиц в тигель TGA. Выбирайте температурный диапазон от 30 градусов по Цельсию до 900 градусов по Цельсию и скорость 5 градусов в минуту под газом N2.
-
Распределение размера
-
Tem
- Приготовьте раствор наночастиц 0,1 мг/мл в воде DI. Капля 5 qL подготовленного раствора на 400-сетчатую медную сетку, поддерживаемую углеродом. Подождите, пока он высохнет.
- Перенесите сетку в держатель TEM и вставьте ее в микроскоп. Приобретите 5 - 10 изображений с увеличением не менее 64 000X, управляемых при 200 кВ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для увеличения контраста можно вставить объективную диафрагму в 20 нм.
-
УФ-Вис спектра
- Приготовьте раствор наночастиц 0,2 мг/мл в воде DI.
- Поместите необходимое количество этого раствора в кварцевый кювет и сканировать от 200 нм до 700 нм.
-
Tem
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Реакционные шаги для синтеза MUS показаны на рисунке 1. Спектры 1H NMR продукта каждого шага представлены на рисунке 2. Процесс синтеза двоичных наночастиц амфифилического золота MUS:OT описан на рисунке 3. После синтеза, работа наночастиц состояла из мытья частиц несколько раз с этанолом и DI воды. До любой характеристики наночастиц чистота наночастиц из несвязанных свободных лигандов отслеживалась 1H NMR в D2O, как показано на рисунке 4. Распределение размеров наночастиц характеризовалось TEM(рисунок 5a, b). Локализованное поверхностное поглощение плазмоном было измерено путем приобретения УФ-Вис спектра(рисунок 5c).
Соотношение двух лигандов было определено путем травления золотого ядра с использованием йода, приобретения 1HMr и расчета относительных количеств каждого лигана с использованием интегрированных значений. На рисунке 6 показаны репрезентативные спектры, а также процедура пиковых назначений ЯМР. Чтобы найти соотношение лигандов между MUS и OT, мы вычислили интегралыпиков между 0,8 - 1 (I 1), 1,12 - 1,55 (I2),1,6 - 1,9 (I3),и 2,6 - 3 (I4) промилле. Пик I1 содержит сигнал от трех водородов OT, пик I2 от комбинации из 14 водородов MUS и 10 OT водородов, и I3 и I4 пики из четырех водородов MUS и двух OT водородов (для каждого пика). Поэтому, чтобы найти процент OT, необходимо нормализовать I1 к 3 и применить следующие выражения.
Для I2,
Для меня3 и я4,
Эти расчеты указывают на соотношение ОТ к МУС, при условии наличия одной произвольной единицы ОТ в системе. Для рисунка 6B, три интеграла дали аналогичные значения для ПРОЦЕНТА OT (т.е. 15,3, 15,9, и 15,9 от I2, Я3, и я4, соответственно).
Поверхностное покрытие наночастиц исследуется TGA, как показано на рисунке 7. TGA, NMR и TEM данные(рисунок 3) объединяются для расчета плотности лиганда, которая представляет собой количество лигандов на единице площади поверхности, приближение частиц к сфере. (Этот расчет предполагает, что Na кипит как NaHSO3.) Данные TEM показывают, что средний диаметр наночастиц составляет 2,4 нм, указывая примерно на 18,08 нм2 (парNo 4pr2) площади поверхности (пар) и 7,23 нм3 (VпарNo 4pr 3/3 объема на частицу (Vpar). Плотность золота составляет 19,9 г/см3, а масса одной частицы 1,3969 х 10-16 мг (Массоваячастица V par x плотность золота - 7,23 нм3 х 19,9 г/см3 х 10-18 мм3/нм3). Оставшаяся масса около 800 градусов Цельсия соответствует золотому ядру, и есть примерно 3,7 х 1016 частиц (Npar),которые оцениваются с помощью Npar (Массовоезолото/Масса частицы) 5,17 мг / 1,3969 х 10-16 мг. Общая площадь поверхности(т/ср) частиц составляет 6,69 х 1017 нм2 (Atot n parx Apar3,69 x 1016 x 18,08 нм2). ЯМР наночастиц йода показал, что соотношение MUS:OT составляет 85:15, а количество органического содержания в TGA составляет 0,00146 г. Таким образом, Есть 3,26 х 1018 лигандов (Nлиганд) по формуле Nлиганд-Массаорганических / (((ROT х MWOT) х MwMUS)) / ( RMUS и ROT) х NАвогадро . Наконец, плотность лигана составляет 4,8 лиганды/нм2, рассчитанные путем деления Nлиганд натоот(4,8 и 3,26 х 1018/6,69 х 1017 нм2). Стойхиометрические соотношения по сравнению с коэффициентами ЯМР OT, полученные в результате различных синтезов, сравниваются на рисунке 8.
Рисунок 1: Схема синтеза MUS. Синтез MUS является ключевым моментом для воспроизводимости синтеза амфифилических наночастиц. Если MUS имеет высокое содержание соли, стойхиометрическое соотношение лигандов может отклоняться. X No 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Спектры молекул ЯМР после каждого шага в синтезе MUS (400 МГц). ()Эта панель показывает 1H NMR спектр андена undec-10-enesulfonate в D2O. (B) Эта панель показывает 1H NMR спектр натрия 11-ацетилтио-undecanesulfonate в D2O. (C) Эта панель показывает 1HN-спектр 11-mercapto-1-undecanesulfonate в D2O. Во всех спектрах, q указывает на пики растворителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Схема синтеза амфифильных наночастиц. (A) Эта панель показывает подготовку однофазной реакции химического сокращения с использованием этанола в качестве растворителя. (B) Золотисто-тилатный комплекс допускается к форме до добавления редукционного агента. На этом этапе раствор золотой соли стал мутным. (C) Во время dropwise добавление мотуля агента, золотые наночастицы формируются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Чистота наночастиц от неотреагированных свободных лигандов. (A) Эта панель показывает 1HMr спектр наночастиц сразу после синтеза и вакуумной сушки. D2O используется в качестве растворителя для анализа 1HMr. Острые пики, показанные красными стрелками, указывают на существование свободных несвязанных лиганд. (B) Эта панель показывает 1HMR спектр наночастиц после тщательной очистки(т.е.,мойки и центрифугирования с этанолом и DI воды). Красная стрелка указывает на увеличенную часть спектра, в которой пики широкие, а не острые, как раньше, указывающие на отсутствие свободных лигандов. В обоих спектрах, q указывает на пики растворителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Распределение размеров наночастиц. (A) Эта панель показывает репрезентативное изображение TEM наночастиц MUS:OT. Шкала бар 20 нм. (B) Эта панель показывает гистограмму размера ядра наночастиц на основе нескольких изображений TEM. (C) УФ-Vis спектры наночастиц показали характерный поверхностный плазмон резонансный пик наночастиц на уровне около 520 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Расчет коэффициента лиганда. (A) Эта панель показывает представительный спектр NMR комбинаций дисульфидов (в качестве ссылок на лиганды после офорта ядра) и пиковые назначения для различных протонов в MeOD-d4. (B) Эта панель показывает 1H NMR спектры травленных наночастиц в MeOD-d4. Во всех спектрах, q указывает на пики растворителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: анализ плотности лиганды. Для определения соотношения и плотности органического материала (лиганд) было проведено измерение TGA наночастиц. График измерений построен как процент веса против. температуры. OT desorbs во-первых, между 176 C до 233 C (вертикальные линии). MUS деградирует до более мелких молекул и полностью сжигается при 800 градусах Цельсия. Оставшийся процент веса соответствует золотому ядру наночастиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Сравнение соотношений от стойхиометрических и ЯМР на частицах. Можно настроить амфифилиальность наночастиц, изменив начальное стойихиометрическое соотношение между MUS и OT в реакции. Бары ошибок показывают верхний и нижний предел содержимого OT, приобретенный с помощью указанных стойхиометрических соотношений. Stoichiometric соотношения 10%, 20%, и т.д.,до 90% OT, были синтезированы для наблюдения за пределами содержания OT на поверхностях наночастиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает сначала синтез ЛИганда MUS, а затем синтез и характеристику амфифилических НАночастиц ЗОЛОТА MUS:OT. Синтез MUS с минимальным содержанием соли обеспечивает лучшую надежность стоихиометрического соотношения между лигандами во время синтеза наночастиц, что является ключевым фактором для воспроизводимого синтеза MUS:OT наночастиц с целевым гидрофобным содержание(рисунок 8). Использование метанола в качестве общего растворителя для MUS и OT, наряду с синтезом частиц в этаноле, позволяет надежный синтез наночастиц золота MUS:OT. Представленные здесь методы характеристики составляют минимальный перечень экспериментов, необходимых для получения достаточной информации о наночастицах для проверки результатов их синтеза.
В этом протоколе четыре важных шага: i) синтез MUS с низким содержанием соли наряду с удалением цветных примесей на втором этапе и кристаллизация чистого MUS в конце; ii) настройка и определение стойихиометрического соотношения между МУС и ОТ; iii) работа над наночастицами; и (iv) характеристика наночастиц.
Во время образования наночастиц MUS преимущественно связывается с поверхностями наночастиц, что может быть связано с растворимостью полученных наночастиц. Например, соотношение 2:1 между MUS и OT приводит к 15% OT на поверхности при расчете на основе данных 1HMr травленных золотых наночастиц. Таким образом, более высокое содержание OT должно быть использовано во время синтеза частиц(рисунок8) для получения наночастиц с более низким соотношением MUS к OT; другими словами, более гидрофобные частицы. Для того, чтобы оценить стойхиометрическое соотношение между лигандами на поверхности наночастиц, необходимо убедиться, что в растворе нет несвязанных лигандов. Наличие несвязанных лиганд влияет на определение соотношения лиганда на наночастиц и плотность, а также на последующие испытания и эксперименты, которые могут привести к неправильной интерпретации. Повторяющиеся циклы очистки с различными растворителями (например, этанол и DI воды) необходимы для устранения всех несвязанных лигандов и других примесей (побочные продукты борогидрида натрия, ионы золота и т.д.). 1 H NMR важно подтвердить чистоту наночастиц. Линия-расширяющий эффект лигандов благодаря сложной химической среде на наночастиц расширить пики, соответствующие лигандов, в то время как любой резкий сигнал исходит от несвязанных молекул22. Кроме того, из-за ограниченной подвижности пики ЯМР, соответствующие метилену, примыкающей к тиоловым группам, не могут быть обнаружены, что является еще одной сигнатурой наночастиц при проверке с использованием 1H NMR. После того, как наночастицы чисты, то металлическое ядро травления с йодом. Офорт йода является устоявшимся методом количественной оценки соотношения лиганда на наночастицах. Например, два десятилетия назад Murray et al. сообщили о определении монослойного состава на золотых наночастицах после офорта йода, при котором йод разлагает золотое ядро и высвобождает тиолатные лиганды как дисульфиды23. Надежность метода офорта йода была установлена с использованием других методов; например, Harkness et al. сообщили, что коэффициент лиганда, полученный из ЯМР, находится в пределах 1% отклонения от измерений масс-спектроскопии24.
TGA является простым методом для расчета органического содержания на наночастицах. Оценка плотности поверхностного лиганда предполагает, что все тиолатные лиганды связываются с поверхностными атомами золота и все свободные лиганды были удалены во время очистки. Для определения плотности лигана делается несколько предположений, главным образом, что частицы являются сферическими, которые используются для расчета площади поверхности, а также плотности упаковки золотого ядра. TEM обеспечивает распределение размеров ядер золота наночастиц, которые могут быть использованы для расчета приблизительной площади поверхности наночастицы. Описанный здесь синтез наночастиц производит полидисперсийную популяцию частиц со средним диаметром 2 - 3 нм и отклонением размера до 30%. Кроме того, средний радиус, используемый для расчета среднего объема одной частицы (приближение частиц к сферам), в сочетании с плотностью золота, позволяет рассчитывать массу одной наночастицы. Затем масса, измеренная TGA свыше 800 градусов по Цельсию, позволяет считать количество частиц, которые первоначально присутствуют. Используя это значение и средний размер ядра, можно оценить общую площадь поверхности золотых наночастиц. Коэффициент лиганда, рассчитанный на основе данных, полученных с помощью 1-й спектроскопии НМР, позволяет считать количество родинок лигандов на поверхности наночастиц. Соотношение моляров между лигандами над площадью поверхности золотых наночастиц обеспечивает плотность лиганда(рисунок7). Чистые наночастицы имеют примерно 4 лигандна на нм2. Данные TGA также могут быть использованы для оценки соотношения лиганда, если температурный интервал, в котором они desorb от поверхности золота известен для каждого лиганда, и desorption происходит на отдельных диапазонах температур.
Таким образом, этот протокол обеспечивает простой способ синтезировать ЛИганду MUS с низким содержанием соли и наночастицами амфифилового золота MUS:OT. Одним из ключевых факторов воспроизводимости этих наночастиц является низкое содержание неорганической соли в используемой МУС. Эти наночастицы стабильны как ввиде порошка, так и в растворе (например,H2O и физиологически значимых), что должно быть подчеркнуто необходимым условием для многих применений. Тщательная характеристика размера и поверхностных свойств амфифильных наночастиц имеет важное значение для будущих применений, в которых степень амфифилиции может играть ключевую роль.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
З.П.Г. и F.S. благодарят Швейцарский национальный научный фонд и, в частности, NCCR «Молекулярное инженерия систем». З.Л. и Ф.С. благодарят грант Швейцарского национального научного фонда No2. Все авторы благодарят Куи Онга за плодотворные дискуссии и за коррективы рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11-bromo-1-undecene | Sigma Aldrich | 467642-25 ml | |
| Sodium Sulfite | Sigma Aldrich | S0505-250 g | |
| Benzyltriethyl-ammonium bromide | Sigma Aldrich | 147125-25 g | |
| Methanol | VWR | BDH1135-2.5 LP | |
| DI water | Millipore | ZRXQ003WW | Deionized water |
| 1 L round bottom flask | DURAN | 24 170 56 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 1.00930 EMD Millipore | |
| Stirring bar | Sigma Aldrich | Z329207, | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | Sigma Aldrich | Z273554 ALDRICH | |
| Filtering flask | DURAN | 20 201 63 | |
| Filtering Buchner Funnel | FisherSci | 11707335 | |
| Ethanol >99.8%, ACS, Reagent | VWR | 2081.321DP | |
| Deuterium dioxide | Sigma Aldrich | 151882 ALDRICH | |
| Thioacetic acid 96% | Sigma Aldrich | T30805 ALDRICH | |
| Carbon black | Sigma Aldrich | 05105-1KG | |
| Celite | Sigma Aldrich | D3877 SIGMA-ALDRICH | Filtration medium |
| Condenser | Sigma Aldrich | Z531154 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent 37% | Sigma Aldrich | 320331 SIGMA-ALDRICH | |
| Sodium Hydroxide, BioXtra, pellets (anhydrous) | Sigma Aldrich | S8045 SIGMA-ALDRICH | |
| Centrifuge tubes | VWR | 525-0155P | |
| 250 mL round bottom flask | DURAN | 24 170 37 | |
| 500 mL round bottom flask | DURAN | 24 170 46 | |
| Nitric acid, fACS reagent 70% | Sigma Aldrich | 438073 SIGMA-ALDRICH | |
| Gold(III) chloride trihydrate >99.9% trace metal basis | Sigma Aldrich | 520918 ALDRICH | |
| 1-octanethiol >98.5% | Sigma Aldrich | 471836 ALDRICH | |
| Sodium Borohydride purum p.a.>96% | Sigma Aldrich | 71320 ALDRICH | |
| addition funnel | SIgma Aldrich | Z330655 SIGMA | |
| Funnel | DURAN | 21 351 46 | |
| 2V folded filtering papers | Whatman | 1202-150 | |
| Amicon filters | Merck | UFC903024 | |
| Iodine, ACS reagent, >99.8%, solid | Sigma Aldrich | 207772 SIGMA-ALDRICH | |
| 5 mm NMR-Tubes, Type 5HP (high precision) | Armar | 32210.503 | Length 178 mm |
| Methanol-d4 99.8 atom%D | Armar | 16400.2035 | |
| TGA crucible | Thepro | 9095-9270.45 | |
| 400 mesh carbon supported copper grid | Electron Microscopy Science | CF400-Cu | |
| quartz cuvette | Hellma Analytics | 100-1-40 |
References
- Verma, A., et al. Effect of surface properties on nanoparticle-cell interactions. Small. 6 (1), 12-21 (2010).
- Yeh, Y. -C., et al. Gold nanoparticles: preparation, properties, and applications in bionanotechnology. Nanoscale. 4 (6), 1871-1880 (2012).
- Mirza, A. Z. A novel drug delivery system of gold nanorods with doxorubicin and study of drug release by single molecule spectroscopy. Journal of Drug Targeting. 23 (1), 52-58 (2015).
- Mirza, A. Z., et al. Fabrication and characterization of doxorubicin functionalized PSS coated gold nanorod. Arabian Journal of Chemistry. , In Press (2014).
- Nel, A. E., et al. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8 (7), 543-557 (2009).
- Yeo, E. L. L., et al. Protein Corona around Gold Nanorods as a Drug Carrier for Multimodal Cancer Therapy. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3 (6), 1039-1050 (2017).
- Lin, J., et al. Cell membranes open "doors" for cationic nanoparticles/ biomolecules: Insights into uptake kinetics. ACS Nano. 7 (12), 10799-10808 (2013).
- Saha, K., et al. Regulation of Macrophage Recognition through the Interplay of Nanoparticle Surface Functionality and Protein Corona. ACS Nano. 10 (4), 4421-4430 (2016).
- Moyano, D. F., et al. Fabrication of corona-free nanoparticles with tunable hydrophobicity. ACS Nano. 8 (7), 6748-6755 (2014).
- Pengo, P., et al. Gold nanoparticles with patterned surface monolayers for nanomedicine: current perspectives. European Biophysics Journal. 46 (8), 749-771 (2017).
- Kuna, J. J., et al. The effect of nanometre-scale structure on interfacial energy. Nature Materials. 8 (10), 837-842 (2009).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nature Materials. 7 (7), 588-595 (2008).
- Van Lehn, R. C., et al. Lipid tail protrusions mediate the insertion of nanoparticles into model cell membranes. Nature Communications. 5, 4482-4493 (2014).
- Cagno, V., et al. Broad-spectrum non-toxic antiviral nanoparticles with a virucidal inhibition mechanism. Nature Materials. 17 (2), 195-203 (2018).
- Uzun, O., et al. Water-soluble amphiphilic gold nanoparticles with structured ligand shells. Chemical Communications. 2 (2), 196-198 (2008).
- Huang, R., et al. Colloidal stability of self-assembled monolayer-coated gold nanoparticles: The effects of surface compositional and structural heterogeneity. Langmuir. 29 (37), 11560-11566 (2013).
- Carney, R. P., et al. Electrical method to quantify nanoparticle interaction with lipid bilayers. ACS Nano. 7 (2), 932-942 (2013).
- Van Lehn, R. C., et al. Effect of particle diameter and surface composition on the spontaneous fusion of monolayer-protected gold nanoparticles with lipid bilayers. Nano Letters. 13 (9), 4060-4067 (2013).
- Huang, R., et al. Effects of surface compositional and structural heterogeneity on nanoparticle-protein interactions: Different protein configurations. ACS Nano. 8 (6), 5402-5412 (2014).
- Van Lehn, R. C., et al. Free energy change for insertion of charged, monolayer-protected nanoparticles into lipid bilayers. Soft Matter. 10 (4), 648-658 (2014).
- Ong, Q., et al. Characterization of Ligand Shell for Mixed-Ligand Coated Gold Nanoparticles. Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1911-1919 (2017).
- Marbella, L. E., et al. NMR techniques for noble metal nanoparticles. Chemistry of Materials. 27 (8), 2721-2739 (2015).
- Templeton, A. C., et al. Reactivity of Monolayer-Protected Gold Cluster Molecules Steric Effects. Journal of American Chemical Society. 120 (8), 1906-1911 (1998).
- Harkness, K. M., et al. A structural mass spectrometry strategy for the relative quantitation of ligands on mixed monolayer-protected gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 82 (22), 9268-9274 (2010).
