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Chemistry

Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro anfifílicas

Published: July 2, 2019 doi: 10.3791/58872
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Institute of Materials, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, 2School of Materials, University of Manchester, 3Interfaculty Institute of Bioengineering, École Polytechnique Fédérale de Lausanne
* These authors contributed equally

Summary

Las nanopartículas de oro anfifílico se pueden utilizar en muchas aplicaciones biológicas. Se presenta un protocolo para sintetizar nanopartículas de oro recubiertas por una mezcla binaria de ligandos y una caracterización detallada de estas partículas.

Abstract

Las nanopartículas de oro cubiertas con una mezcla de ácido sulfónico (MUS) de 1-octanethiol (OT) y 11-mercapto-1-undecano (MUS) han sido ampliamente estudiadas debido a sus interacciones con membranas celulares, bicapas lipídicas y virus. Los ligandos hidrófilos hacen que estas partículas sean coloidalmente estables en soluciones acuosas y la combinación con ligandos hidrófobos crea una partícula anfifílica que se puede cargar con fármacos hidrófobos, se fusionan con las membranas lipídicas y resisten adsorción de proteínas. Muchas de estas propiedades dependen del tamaño de las nanopartículas y de la composición de la cáscara de ligando. Por lo tanto, es crucial contar con un método sintético reproducible y técnicas de caracterización fiables que permitan la determinación de las propiedades de las nanopartículas y la composición de la cáscara de ligando. Aquí, se presenta una reducción química de una fase, seguida de una purificación a fondo para sintetizar estas nanopartículas con diámetros inferiores a 5 nm. La relación entre los dos ligandos en la superficie de la nanopartícula se puede ajustar a través de su relación estequiométrica utilizada durante la síntesis. Demostramos cómo se combinan varias técnicas rutinarias, como la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la resonancia magnética nuclear (RMN), el análisis termogravimétrico (TGA) y la espectrometría ultravioleta visible (UV-Vis), con caracterizar los parámetros fisicoquímicos de las nanopartículas.

Introduction

La cáscara de ligando de nanopartículas de oro se puede diseñar para exhibir varias propiedades diferentes que se pueden aplicar para abordar los desafíos en la biomedicina1,2,3,4. Esta versatilidad permite el control de las interacciones intermolecularesentre nanopartículas y biomoléculas 5,6,7. La hidrofobicidad y la carga juegan un papel decisivo, así como otros parámetros superficiales que afectan a la forma en que las nanopartículas interactúan conlasbiomoléculas5,8,9. Para ajustar las propiedades superficiales de las nanopartículas, la elección de moléculas tioladas que componen la cáscara de ligando ofrece un sinfín de posibilidades, de acuerdo con las características buscadas. Por ejemplo, una mezcla de moléculas de ligandocon grupos extremos hidrófobos e hidrófilos (por ejemplo, cargados) se utilizan a menudo para generar nanopartículas anfifílicas10,11.

Un ejemplo destacado de este tipo de nanopartículas está protegido por una mezcla de OT y MUS (en adelante llamadas nanopartículas MUS:OT) que se ha demostrado que poseen muchas propiedades relevantes12,13,14. En primer lugar, con una composición de cáscara de ligando de 66% MUS (en adelante 66:34 MUS:OT), la estabilidad coloidal de las nanopartículas es alta, alcanzando hasta 33% de peso en agua desionizada, así como en solución salina tamponada de fosfato (1x, 4 mM fosfato, 150 mM NaCl)15. Además, estas partículas no se precipitan a valores de pH relativamente bajos: por ejemplo, a pH 2.3 y con concentraciones de sal de 1 M NaCl15,estas nanopartículas permanecen coloidialmente estables durante meses. La relación estequiométrica entre las dos moléculas en la cáscara de ligando es importante porque dicta la estabilidad coloidal en soluciones con una alta resistencia iónica16.

Se ha demostrado que estas partículas atraviesan la membrana celular sin portarla, a través de una vía independiente de la energía1,12. La fusión espontánea entre estas partículas y bicapas lipídicas subyace su difusividad a través de las membranas celulares17. El mecanismo detrás de esta interacción es la minimización del contacto entre una superficie hidrofóbica accesible al disolvente y moléculas de agua tras la fusión con bicapas de lípidos18. En comparación con las nanopartículas de MUS (nanopartículas que tienen sólo el ligando MUS en su caparazón), la mayor hidrofobicidad en nanopartículas mixtas MUS:OT (por ejemplo, en una composición de 66:34 MUS:OT) aumenta el intervalo del diámetro del núcleo que puede fusionarse con lípidos bicapas18. Diferentes organizaciones de autoensamblaje de la cáscara de ligando se correlacionan con distintos modos de unión de nanopartículas MUS:OT 66:34 con diversas proteínas, como la albúmina y la ubiquitina, en comparación con las partículas de TODO MUS19. Recientemente, se ha informado que las nanopartículas 66:34 MUS:OT se pueden utilizar como un agente antiviral de amplio espectro que destruye irreversiblemente los virus debido a las fijaciones electrostáticas multivalentes de ligandos MUS y acoplamientos no locales de ligandos OT a cápside proteínas14. En todos estos casos, se ha encontrado que el contenido hidrofóbico, así como el tamaño del núcleo de las nanopartículas, determina cómo se llevan a cabo estas interacciones bionanométricas. Estas diversas propiedades de las nanopartículas MUS:OT han provocado muchos estudios de simulación por ordenador que tenían como objetivo aclarar los mecanismos que sustentan las interacciones entre las partículas MUS:OT y diversas estructuras biológicas como las bicapas de lípidos20.

La preparación de nanopartículas Au protegidas por MUS:OT plantea algunos desafíos. En primer lugar, el ligando cargado (MUS) y el ligando hidrófobo (OT) son inmiscibles. Por lo tanto, la solubilidad de las nanopartículas y de los ligandos debe tenerse en cuenta a lo largo de la síntesis, así como durante la caracterización. Además, la pureza de las moléculas de ligando MUS —específicamente, el contenido de sales inorgánicas en el material de partida— influye en la calidad, reproducibilidad, así como en la estabilidad coloidal a corto y largo plazo de las nanopartículas.

Aquí, se describe una síntesis detallada y caracterización de esta clase de nanopartículas de oro anfifílico protegidas por una mezcla de MUS y OT. Se informa de un protocolo para la síntesis del ligando MUS cargado negativamente para garantizar la pureza y, por lo tanto, la reproducibilidad de diferentes sintetizadores de nanopartículas. A continuación, se informa en detalle del procedimiento para generar estas nanopartículas, basado en una síntesis monofásica común, seguida de una purificación exhaustiva. Se han combinadovarias técnicas de caracterización 21 necesarias, como TEM, UV-Vis, TGA y NMR, para obtener todos los parámetros necesarios para cualquier otro experimento biológico.

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Protocol

1. Síntesis de 11-mercapto-1-undecanesulfonato (MUS)

NOTA: Este protocolo se puede utilizar a cualquier escala deseada. Aquí, se describe una escala de producto de 10 g.

  1. Sodio undec-10-enesulfonato
    1. Añadir 11-bromo-1-undeceno (25 mL, 111.975 mmol), sulfito sódico (28,75 g, 227,92 mmol) y bromuro de beniltrietilamilo (10 mg) a una mezcla de 200 ml de metanol (MeOH) y 450 ml de agua desionizada (DI) (4:9 v/v MeOH:H 2 O relación) en una proporción de 1 L redondo-flask (4:9 v/v MeOH:H2O) en una relación de 1 L .
    2. Reflujo de la mezcla de reacción a 102 oC durante 48 h. Tapar el sistema con un mecanismo de alivio de presión, por ejemplo, un globo con una aguja, o simplemente una aguja. Esta reacción no es sensible a los gases atmosféricos.
      NOTA: La solución se vuelve incolora cuando se completa la reacción.
    3. Conecte la mezcla de reacción a un evaporador rotatorio para evaporar MeOH y reducir el volumen a aproximadamente 300 ml.
    4. Transfiera la solución restante a un embudo de adición de 1 L.
    5. Extraiga la solución acuosa restante 5x con éter dietílico, utilizando el embudo de adición. 11-bromo-1-undeceno sin reaccionar permanece en la fase de éter dietílico y el producto sulfonado en H2O.
      ADVERTENCIA: Suelte cualquier acumulación de presión con frecuencia durante la extracción y consulte el uso correcto de embudos de adición.
    6. Recoja la solución de agua extraída final en un matraz de fondo redondo de un solo cuello de 1 L.
    7. Conecte el matraz de reacción a un evaporador rotatorio colocando un poco de grasa (o tiras de anillo de teflón o cualquier otro sellador) entre el matraz y la trampa.
    8. Disminuya el vacío lentamente para evaporar la fase acuosa en un evaporador rotatorio. Debido a que el producto es un surfactante, la formación de espuma se producirá durante la evaporación. Para evitar este problema, siga las instrucciones del siguiente paso.
      1. Añadir etanol a la mezcla para acelerar la evaporación de H2O y evitar la formación de espuma. Cuando se reinicie la formación de espuma debido a la disminución del contenido de etanol, detenga la evaporación, retire el matraz del evaporador rotatorio, agregue más etanol (alrededor de un tercio del volumen total) y vuelva a conectar el matraz al evaporador rotatorio. Repita este proceso hasta que la mezcla de la solución disminuya significativamente y no forme burbujas.
    9. Seque el polvo blanco directamente conectando el matraz a un alto vacío. Cuanto más seco sea el polvo, menos sales inorgánicas se arrastrarán hacia los pasos posteriores.
      NOTA: El calor se puede utilizar para secar el producto, por ejemplo, manteniendo el matraz al vacío en un baño de 60 oC y dejenlo durante la noche.
    10. Suspenda el polvo blanco en 400 ml de metanol en un matraz. Sonicar para disolver la cantidad máxima de producto.
      NOTA: El objetivo de este paso es disolver el producto, pero no los subproductos inorgánicos, como el exceso de sulfito de sodio y bromuro de sodio, que tienen solubilidad limitada en metanol. Utilizar metanol con el menor contenido de agua posible, ya que el agua en el metanol aumentará la solubilidad de los subproductos inorgánicos en el disolvente.
    11. Para aumentar la solubilidad del producto, el metanol se puede calentar suavemente cerca de su punto de ebullición (64 oC).
      ADVERTENCIA: Asegúrese de trabajar bajo una campana de humos durante el calentamiento del matraz. Los humos del metanol evaporado son peligrosos.
    12. Filtrar la solución para eliminar los subproductos inorgánicos insolubles de metanol. Utilice un matraz de filtrado conectado a una bomba de vacío y un embudo de filtrado con papel de filtro cuantitativo o un filtro de borosilicato. Tanto el producto como las sales inorgánicas son polvos blancos cuando se secan: el producto es soluble en metanol, mientras que las sales no lo son.
    13. Transfiera la solución filtrada del matraz filtrante a un matraz de fondo redondo de 1 L.
    14. Conecte el matraz a un evaporador rotatorio y evapore la solución metanólica a 45 oC, vuelva a disolver el polvo blanco en metanol y filtre la solución (pasos de protocolo 1.1.7, 1.1.8 y 1.1.9). Repita este proceso al menos 2veces, para disminuir la cantidad de sal inorgánica.
    15. Recoger el polvo blanco soluble en metanol (aproximadamente 30 g, a esta escala).
    16. Disolver aproximadamente 10 mg de producto en 500 ml de D2O y transferir la solución a un tubo de RMN.
    17. Realice espectrometría de RMN 1H en el producto en D2O a 400 MHz con 32 escaneos.
      NOTA: Las asignaciones máximas para 1H NMR (D2O) son 5.97 (m, 1H), 5.09 (m, 2H), 2.95 (t, 2H), 2.10 (m, 2H), 1.77 (q, 2H), 1.44 (br s, 12H).
  2. Sodio 11-acetiltio-undecanesulfonato
    1. Disolver los 30 g aproximados de sodio undec-10-enesulfonato (el producto de reacción de la sección 1.1) en 500 ml de metanol dentro de un matraz de fondo redondo de 1 L. Añadir un exceso de ácido tioacético 2,6x a la solución y agitarlo delante de una lámpara UV (250 W) durante la noche (12 h). En caso de que una lámpara UV no esté disponible, la reacción se puede realizar mediante reflujo utilizando un iniciador radical, como azobisisobutyronitrile (AIBN); sin embargo, se recomienda encarecidamente el uso de una lámpara UV.
      ADVERTENCIA: Asegúrese de trabajar bajo la campana de humos en todo momento. Si el matraz necesita ser transportado a otro espacio donde se encuentra la lámpara UV, selle el matraz para evitar la propagación del fuerte olor del ácido tioacético. Tenga cuidado al utilizar una lámpara UV: bloquee completamente el espacio donde se encuentra la lámpara y consulte las pautas de seguridad de la institución sobre cómo operar una lámpara UV.
    2. Supervise la reacción tomando alícuotas de 2 ml de la reacción, evapore el disolvente y añada agua desenuteada para comprobarla con 1H de RMN. Una vez que los picos correspondientes a la doble unión desaparezcan, detenga la reacción.
      NOTA: Por lo general, después de 12 h delante de la lámpara UV, la reacción es completa. Si la mezcla de reacción se vuelve turbia, agregue más MeOH y continúe la exposición a la luz UV durante seis horas adicionales.
    3. Evaporar todo MeOH en un evaporador rotatorio hasta que el residuo sólido se vuelva rojo anaranjado. Si se deja lo suficiente, el producto se vuelve marrón a negro.
      ADVERTENCIA: Trabaje conscientemente debido a los fuertes olores del ácido tioacético. Los fuertes olores de cualquier derrame de tiolato se pueden neutralizar utilizando una solución acuosa de lejía (hipoclorito de sodio).
    4. Con un matraz filtrante, lave el producto con éter dietílico para eliminar cualquier exceso de ácido tioacético, hasta que no aparezcan más sustancias de color (naranja-amarillo) en el sobrenadante de éter dietílico. Secar el sólido bajo alto vacío y, luego, disolverlo en metanol, produciendo una solución de color amarillo a naranja.
      NOTA: Agregue suficiente metanol para disolver el producto.
      NOTA: El color puede variar en este paso.
    5. Añadir 3 g de negro de carbono a la solución, mezclar vigorosamente, y filtrar la mezcla a través del medio de filtración (ver Tabla de Materiales) que cubre dos tercios de un papel de filtro acanalado.
      NOTA: La estructura porosa del negro de carbono captura el material de producto lateral de color (y parte del producto). La solución filtrada debe estar clara. Si la solución filtrada sigue coloreada (amarillo), repita este proceso.
    6. Evaporar el disolvente completamente en un evaporador rotatorio y recoger aproximadamente 35 g de polvo blanco.
    7. Disolver 10 mg del producto en 500 ml de D2O y transferir la solución a tubos de RMN.
    8. Realice 1H NMR en el producto en D2O a 400 MHz con 32 escaneos.
      NOTA: Las asignaciones máximas para la RMN H (D2O) son 2.93 (t, 4H), 2.40 (s, 3H), 1.77 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.45 (br s, 14H).
  3. 11-mercapto-1-undecanesulfonato (MUS)
    1. Reflujo de sodio 11-acetiltio-undecanesulfonato a 102 oC en 400 ml de 1 M HCl durante 12 h para cleave el grupo de tioacetato y obtener un tiol.
    2. Transfiera el producto a un matraz de fondo redondo de 1,5 L o 2 L. Añadir 200 mL de 1 M NaOH a la solución final y rematar con 400 mL de agua DI para tener un volumen final de 1 L. Esto mantendrá la solución ácida y evitará la cristalización de sales inorgánicas como subproducto.
      NOTA: Una neutralización completa de la solución a pH 7 dará lugar a la cristalización de un producto insoluble en metanol.
    3. Mantener la solución transparente a 4oC y cristalizará durante la noche. El producto cristaliza como cristales finos que son viscosos cuando están mojados.
      NOTA: Para acelerar la cristalización, añada MUS presintetizado a la solución, si está disponible.
    4. Decantar el sobrenadante transparente y centrifugar por el producto blanco viscoso en tubos centrífugos de 50 ml durante 5 min a 4.000 x g.
    5. Decantar el sobrenadante en otro matraz y secar los pellets blancos bajo alto vacío, dependiendo de la centrífuga disponible, esto puede ser de 2 - 16 tubos o más.
      NOTA: No se recomienda filtrar debido a la naturaleza tensioactivo del producto; espuma excesiva se producirá y la mayor parte del producto se perderá.
    6. Recoger aproximadamente 12 g (aproximadamente 30% de rendimiento) de MUS soluble en metanol de este paso de purificación.
      NOTA: Tenga en cuenta que el polvo es fino y electrostático: tiende a adherirse a las espátulas y las superficies de los recipientes. Además, se puede extraer más material del sobrenadante del paso de centrifugación reduciendo el volumen (a aproximadamente un tercio de su valor original) y manteniéndolo a 4oC. Disminuir el volumen aún más (en un 75%) para aumentar el rendimiento en este paso.
    7. Disolver 10 mg del producto en 500 ml de D2O y transferir la solución a tubos de RMN.
    8. Realice 1H NMR en el producto en D2O a 400 MHz con 32 escaneos.
      NOTA: Las asignaciones máximas de Rmn (D2O) son 2,93 (t, 4H), 2,59 (t, 3H), 1,78 (m, 2H), 1,65 (m, 2H), 1,44 (br s, 14H). La masa molar calculada (incluida la contraión de sodio) del producto es de 290,42 g/mol.

2. Síntesis de nanopartículas: Preparación de los reactivos

  1. Limpie toda la cristalería (un matraz de fondo redondo de un solo cuello de 500 ml, un embudo de adición de 100 ml y un pequeño embudo) con agua regia fresca (tres partes de ácido clorhídrico a una parte de ácido nítrico). Enjuague la cristalería con una cantidad excesiva de agua dentro de una campana de humos y retire todos los humos. A continuación, enjuague la cristalería con etanol y séquela en un horno de cristalería de laboratorio (se recomienda 40 - 60 oC).
  2. Pesar 177,2 mg (0,45 mmol) de cloruro de oro (III) trihidrato (HAuCl4x 3H2O) en un vial de vidrio pequeño (10 o 20 ml de viales de vidrio limpio, o en papel de pesaje).
  3. Pesar 87 mg (0,3 mmol) MUS en un vial de vidrio de 20 ml.
  4. Añadir 10 ml de metanol para disolver el MUS. Sonicarlo en un baño ultrasónico hasta que no haya material sólido visible, para asegurar la disolución completa.
    NOTA: Alternativamente, con una pistola de calor o un baño caliente (60 oC), caliente la solución suavemente. Cuando se caliente, pase agua fría por el exterior del matraz para devolverla a temperatura ambiente.
  5. Añadir 26 l (0,15 mmol) de OT a la solución de metanol y agitarlo para mezclar los ligandos.
  6. Pesar 500 mg (13 mmol) de borohidruro de sodio (NaBH4) y añadirlo a 100 ml de etanol en el matraz de fondo redondo de 250 ml. Revuelva vigorosamente con agitación magnética (600 - 800 rpm). (El NaBH4 tarda de 10 a 20 minutos, dependiendo del grado, para formar una solución clara en etanol.)

3. Síntesis de nanopartículas de oro

  1. Disolver la sal dorada en 100 ml de etanol en el matraz de fondo redondo de 500 ml y empezar a agitar a 800 rpm con una barra magnética en una placa de agitación. Asegúrese de que la sal dorada se disuelva por completo.
  2. Coloque un embudo de adición de 100 ml por encima del matraz de fondo redondo. Coloque un embudo en la parte superior del embudo de adición con un filtro de papel cuantitativo en el interior. Cuando el NaBH4 se disuelva en etanol, comience a filtrar la solución en el embudo de adición a través del papel de filtro en el embudo.
  3. Agregue la solución de ligando a la mezcla de reacción. Espere 15 minutos para la formación de complejo de oro-tiolado. El cambio de color de la mezcla de reacción de amarillo translúcido a amarillo turbón indica la formación de complejo oro-tiolado.
  4. Comience a agregar la solución NaBH4 filtrada desde el embudo de adición en sentido contrario. Ajuste el tiempo de intervalo de las gotas para que la adición de NaBH4 tome aproximadamente 1 h.
  5. Después de la adición completa de NaBH4,retire el embudo. Sigue agitando la reacción durante otra hora. Al final de la reacción, retire la barra de agitación magnética utilizando un imán colocado en el exterior del matraz.
  6. Use un tabique para cerrar el matraz y perforar una aguja en el tabique para liberar el gas H2 que evolucionará después de la reacción.
  7. Mantenga la mezcla de reacción dentro de un refrigerador de laboratorio (4 oC) para precipitar las nanopartículas durante la noche.

4. El retoque de la síntesis

  1. Decantar el etanol sobrenadante para reducir el volumen.
  2. Transfiera el precipitante restante a tubos centrífugos de 50 ml y centrífuga durante 3 min a 4.000 x g.
  3. Decantar el sobrenadante, dispersar las nanopartículas de nuevo con etanol por vórtice, y centrifugar de nuevo. Repita este proceso de lavado 4x.
  4. Seque las nanopartículas al vacío para eliminar el etanol residual.
  5. Para limpiar las nanopartículas de ligandos/moléculas hidrófilas libres, disolver los precipitados en 15 ml de agua DI y transferirlos a los tubos centrífugos con una membrana de filtración de 30 kDa de peso molecular de corte. La diálisis también es susceptible para este procedimiento.
  6. Centrifugar estos tubos durante 5 min a 4.000 x g para concentrar la solución de nanopartículas.
  7. Añadir 15 ml de agua DI a esta solución y centrifugar para volver a concentrar. Repita este proceso de limpieza al menos 10 veces.
    NOTA: Una indicación de que se han eliminado las impurezas solubles en agua es la ausencia de espuma al agitar los residuos acuosos; después de todo, la mayoría de las impurezas son disulfuros de MUS consigo mismo o con OT (esto se puede determinar mediante la recopilación del material y la realización de 1H NMR).
  8. Después de la centrifugación, transfiera las nanopartículas concentradas a un tubo centrífugo de 15 ml. Para convertir las nanopartículas en un polvo manejable, precipitalas en un disolvente como la acetona o liofilíce la solución acuosa restante. Cuando se congelan, las nanopartículas tienden a formar un polvo suelto que se adhiere a las superficies y puede ser difícil de manipular.

5. Caracterización de las nanopartículas

  1. Pureza
    1. Para comprobar si las nanopartículas están libres de ligandos no unidos, disolver 5 mg de nanopartículas secas en 600 oL de D2O y realizar una medición de RMN de 1H de las partículas. Si no hay picos agudos de los ligandos, significa que las nanopartículas están libres de pequeñas moléculas orgánicas.
  2. Relación de ligando
    1. Preparar una solución de 20 mg/mL de metanol-d4 de yodo. Añadir 600 ml de esta solución a los 5 mg de nanopartículas en un vial de vidrio, para grabar las nanopartículas.
    2. Envuelva la tapa del vial con película de parafina y sonicarla en un baño ultrasónico durante 20 minutos. Transfiera la solución a un tubo de RMN y adquiera un espectro de RMN de 1H (400 MHz) con 32 escaneos.
  3. Densidad de ligando
    1. Transfiera de 2 a 8 mg de nanopartículas a un crisol TGA. Elija un rango de temperatura de 30 oC a 900 oC y una velocidad de 5 oC por minuto bajo N2 gas.
  4. Distribución del tamaño
    1. Tem
      1. Preparar 0,1 mg/ml de solución de nanopartículas en agua DI. Suelte 5 ml de la solución preparada en la rejilla de cobre con soporte de carbono de 400 mallas. Espera a que se seque.
      2. Transfiera la rejilla en un soporte TEM e insértela en el microscopio. Adquirir de 5 a 10 imágenes con un aumento de al menos 64.000X, operados a 200 kV.
        NOTA: Para aumentar el contraste, se puede insertar una apertura objetiva de 20 nm.
    2. Espectros UV-Vis
      1. Prepare una solución de nanopartículas de 0,2 mg/ml en agua DI.
      2. Coloque la cantidad requerida de esta solución en la cubeta de cuarzo y escanee de 200 nm a 700 nm.

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Representative Results

Los pasos de reacción para sintetizar MUS se muestran en la Figura1. Los espectros de RMN 1H del producto de cada paso se representan en la Figura2. El flujo de trabajo de síntesis de las nanopartículas binarias de oro anfifílico MUS:OT se describe en la Figura3. Después de la síntesis, el estudio de las nanopartículas consistió en lavar las partículas varias veces con etanol y agua DI. Antes de cualquier caracterización de nanopartículas, la limpieza de las nanopartículas de los ligandos libres no enlazados era monitoreada por 1H NMR en D2O, como se muestra en la Figura4. La distribución del tamaño de las nanopartículas se caracterizó por TEM (Figura 5a,b). La absorción de resonancia de plasmón superficial localizada se midió mediante la adquisición de espectros UV-Vis (Figura5c).

La relación de los dos ligandos se determinó grabando el núcleo de oro usando yodo, adquiriendo la RMN de 1H y calculando las cantidades relativas de cada ligando utilizando los valores integrados. La Figura 6 muestra los espectros representativos, así como el procedimiento de las asignaciones de picos de RMN. Para encontrar la relación de ligando entre MUS y OT, calculamos las integrales de los picos entre 0,8 - 1 (I1), 1,12 - 1,55 (I2), 1,6 - 1,9 (I3) y 2,6 - 3 (I4) ppm. El pico I1 contiene señal de tres hidrógenos OT, el pico I2 de una combinación de 14 hidrógenos MUS y 10 hidrógenos OT, y los picos I3 y I4 de cuatro hidrógenos MUS y dos hidrógenos OT (para cada pico). Por lo tanto, para encontrar el porcentaje de OT, es necesario normalizar I1 a 3 y aplicar las siguientes expresiones.

Para I2,
Equation 1

Para I3 y I4,
Equation 2

Estos cálculos indican la relación de OT a MUS, suponiendo que haya una unidad arbitraria de OT en el sistema. Para la Figura 6B, las tres integrales dieron valores similares para el porcentaje de OT (esdecir,15.3, 15.9 y 15.9 de I2, I3, y I4, respectivamente).

TGA examina la cobertura superficial de las nanopartículas, tal como se muestra en la Figura7. Los datos TGA, NMRy TEM (Figura 3) se combinan para calcular la densidad de ligandos, que es el número de ligandos en una unidad de superficie, aproximando las partículas a una esfera. (Este cálculo supone que Na hierve como NaHSO3.) Los datos de TEM muestran que el diámetro medio de las nanopartículas es de 2,4 nm, apuntando a aproximadamente 18,08 nm2 (Apara 4pr2) de superficie (Apar) y 7,23 nm3 (Par Va 4pr 3/3) de volumen por partícula (ParEn V). La densidad del oro es de 19,9 g/cm3 y la masa de una partícula es de 1,3969 x 10-16 mg (Partícula demasa a Vpar x la densidad de oro de 7,23 nm3 x 19,9 g/cm3 x 10-18 mm3/nm3). La masa restante alrededor de 800 oC corresponde al núcleo de oro, y hay aproximadamente 3,7 x 1016 partículas (Npar) que se estiman utilizando Npar (Oromasivo/Masa partícula) 5,17 mg / 1,3969 x 10-16 mg. La superficie total (Atot) de las partículas es de 6,69 x 1017 nm2 (Atot á Nparx Apará 3,69 x 1016 x 18,08 nm2). La RMN de las nanopartículas grabadas con yodo mostró que la relación MUS:OT es de 85:15 y la cantidad de contenido orgánico en TGA es de 0,00146 g. Por lo tanto, hay 3,26 x 1018 ligandos (Nligando) siguiendo la fórmula de Nligando[Masaorgánica / ((ROT x MwOT) + (R MUSMUS x MwMUS)) / ( RMUS + ROT)] x NAvogadroa [0,00146 g / ((15 x 146 g/mol) + (85 x 267,42 g/mol)) / (85 + 15] x (6,02 x 1023) . Por último, la densidad de ligando esde 4,8 ligandos/nm 2, calculada dividiendo elligando N por Untot(4,8 x 3,26 x 1018/6,69 x 1017 nm2). Las relaciones estequiométricas frente a las relaciones de RMN de la OT, resultantes de varias síntesis, se comparan en la Figura8.

Figure 1
Figura 1: Esquema de síntesis de MUS. La síntesis de MUS es el punto clave para la reproducibilidad de la síntesis de nanopartículas anfifílicas. Si el MUS tiene un alto contenido de sal, la relación estequiométrica de los ligandos puede desviarse. X x 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Espectros de RMN de las moléculas después de cada paso en la síntesis de MUS (400 MHz). (A) Este panel muestra el espectro de 1H rmnes de undec-10-enesulfonato en D2O. (B) Este panel muestra el espectro de 1 H RmN de sodio 11-acetiltio-undecanesulfonato en D 2 O. ( C ) Este panel muestra el espectro de RMN 1 H de sodio 11-acetiltio-undecanesulfonato en D 2 O. ( C ) Este panel muestra el espectro de 1 H rmnes de sodio 11-acetiltio-undecanesulfonato en D 2 O. ( C ) Este panel muestra el espectro de 1 H de RMN de sodio 11-acetiltio-undecanesulfonato en D 2 O. ( C ) Este panel muestra el espectro de 1H de RMN de sodio 11-acetiltio-undecanesulfonato en D2O. (C) Este panel muestra el espectro muestra el espectro de RMN 1H de 11-mercapto-1-undecanesulfonato en D2O. En todos los espectros, * indica los picos de disolvente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Esquema de la síntesis de nanopartículas anfifílicas. (A) Este panel muestra la preparación de la reacción de reducción química de una fase utilizando etanol como disolvente. (B) El complejo de oro-tiolado se permite formar antes de la adición de un agente reductor. En esta etapa, la solución de sal de oro se convirtió en turbia. (C) Durante la adición por gotas del agente reductor, se forman nanopartículas de oro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Limpieza de las nanopartículas de ligandos libres no reaccionados. (A) Este panel muestra el espectro de RMN de 1H de las nanopartículas justo después de la síntesis y el secado al vacío. D2O se utiliza como disolvente para el análisis de 1H NMR. Los picos afilados mostrados por flechas rojas indican la existencia de ligandos libres sin enlazar. (B) Este panel muestra el espectro de RMN de 1H de las nanopartículas después de una purificación a fondo (esdecir,lavados y centrifugación con etanol y agua DI). La flecha roja apunta a la parte magnificada del espectro, en la que los picos son anchos, no afilados como antes indica la ausencia de ligandos libres. En ambos espectros, * indica los picos de disolvente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Distribución del tamaño de las nanopartículas. (A) Este panel muestra una imagen TEM representativa de las nanopartículas MUS:OT. La barra de escala es de 20 nm. (B) Este panel muestra un histograma del tamaño del núcleo de las nanopartículas basado en varias imágenes TEM. (C) los espectros UV-Vis de las nanopartículas mostraron el pico característico de resonancia de plasmón superficial de las nanopartículas a alrededor de 520 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Cálculo de la relación de ligando. (A) Este panel muestra espectros representativos de RMN de combinaciones de disulfuros (como referencias para ligandos después del grabado de núcleo) y asignaciones máximas para diferentes protones en MeOD-d4. (B) Este panel muestra 1espectro de RMN H de nanopartículas grabadas en MeOD-d4. En todos los espectros, * indica los picos de disolvente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Análisis de densidad de ligando. Se realizó una medición TGA de las nanopartículas para determinar la relación y la densidad del material orgánico (ligands). El gráfico de las mediciones se traza como el porcentaje de peso frente a. la temperatura. OT desorbs primero, entre 176 oC a 233 oC (líneas verticales). MUS se degrada a moléculas más pequeñas y se quema totalmente a alrededor de 800 oC. El porcentaje de peso restante corresponde al núcleo de oro de las nanopartículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Comparación de las relaciones estequiométricas y de RMN de OT en las partículas. Es posible ajustar la anfiflicidad de las nanopartículas cambiando la relación estequiométrica inicial entre MUS y OT en la reacción. Las barras de error muestran el límite superior e inferior del contenido de OT adquirido utilizando las relaciones estequiométricas indicadas. Las proporciones estequiométricas del 10%, 20%, etc.,hasta el 90% de OT, se sintetizaron para observar los límites del contenido de OT en las superficies de nanopartículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe primero la síntesis del ligando MUS y, a continuación, la síntesis y caracterización de nanopartículas de oro MUS:OT anfifílicas. Sintetizar MUS con un contenido mínimo de sal permite una mejor fiabilidad de la relación estequiométrica entre los ligandos durante la síntesis de nanopartículas, que es un factor clave para la síntesis reproducible de nanopartículas MUS:OT con un hidrofóbico objetivo contenido (Figura 8). El uso de metanol como disolvente común para MUS y OT, junto con la síntesis de las partículas en etanol, permite una síntesis fiable de nanopartículas de oro MUS:OT. Los métodos de caracterización presentados aquí conforman una lista mínima de experimentos necesarios para adquirir información suficiente sobre las nanopartículas para verificar el resultado de su síntesis.

Hay cuatro pasos críticos en este protocolo: (i) la síntesis de MUS con un bajo contenido de sal junto con la eliminación de impurezas de colores en el segundo paso y una cristalización de MUS puro al final; (ii) ajustar y determinar la relación estequiométrica entre MUS y OT; (iii) el análisis de las nanopartículas; y (iv) la caracterización de las nanopartículas.

Durante la formación de nanopartículas, MUS se une preferentemente a las superficies de nanopartículas, que podrían estar relacionadas con la solubilidad de las nanopartículas resultantes. Por ejemplo, una relación de avance estequiométrica 2:1 entre MUS y OT da como resultado un 15% de OT en la superficie cuando se calcula utilizando los datos de la RMN de 1H de nanopartículas de oro grabado. Por lo tanto, se debe utilizar un mayor contenido de OT durante la síntesis de las partículas (Figura 8) para obtener una nanopartícula con una relación de MUS a OT más baja; en otras palabras, una partícula más hidrófoba. Para evaluar la relación estequiométrica entre los ligandos en la superficie de las nanopartículas, es necesario asegurarse de que no haya ligandos sin ataduras en la solución. La presencia de ligandos no unidos afecta a la determinación de la relación de ligandos en las nanopartículas y la densidad, junto con pruebas y experimentos posteriores que pueden conducir a interpretaciones incorrectas. Se requieren ciclos de limpieza repetitivos con diferentes disolventes (como etanol y agua DI) para eliminar todos los ligandos no unidos y otras impurezas (subproductos de borohidruro de sodio, iones de oro, etc.). 1 La RMN H es importante para confirmar la pureza de las nanopartículas. El efecto de ampliación de la línea de los ligandos debido al complejo entorno químico en las nanopartículas amplía los picos correspondientes a los ligandos, mientras que cualquier señal aguda proviene de moléculas no unidas22. Además, debido a la movilidad restringida, no se pueden detectar los picos de RMN correspondientes al metileno adyacente a los grupos tiol, que es otra firma de la nanopartícula cuando se inspecciona utilizando 1H RmN. Una vez que las nanopartículas están limpias, entonces el núcleo de metal se graba con yodo. El grabado de yodo es un método bien establecido para cuantificar la relación de ligando sin efecto en las nanopartículas. Por ejemplo, hace dos décadas, Murray y otros informaron de la determinación de la composición monocapa en nanopartículas de oro después del grabado de yodo, en la que el yodo descompone el núcleo de oro y libera los ligandos tiolatos como disulfuros23. La fiabilidad del método de grabado de yodo se ha establecido utilizando otros métodos; por ejemplo, Harkness et al. informaron que la relación de ligando obtenido de RMN está dentro del 1% de desviación de las mediciones de espectroscopia de masa24.

TGA es un método sencillo para calcular el contenido orgánico en las nanopartículas. La estimación de la densidad de ligando superficial supone que todos los ligandos tiolatos se unen a los átomos de oro de la superficie y todos los ligandos libres se han eliminado durante la purificación. Para determinar la densidad del ligando, se hacen varias suposiciones, principalmente que las partículas son esféricas, que se utiliza para calcular el área de superficie, así como la densidad de embalaje, del núcleo de oro. TEM proporciona una distribución de tamaño de los núcleos de oro de nanopartículas que se pueden utilizar para calcular la superficie aproximada de una nanopartícula. La síntesis de nanopartículas descrita aquí produce una población polidispersa de partículas con un diámetro promedio de 2 - 3 nm y una desviación de tamaño de hasta 30%. Además, el radio medio, utilizado para calcular el volumen medio de una partícula (aproximando las partículas a las esferas), combinado con la densidad de oro, permite el cálculo de la masa de una nanopartícula. A continuación, la masa medida por TGA a más de 800 oC permite calcular el número de partículas presentes inicialmente. Mediante el uso de este valor y el tamaño medio del núcleo, se puede estimar la superficie total de las nanopartículas de oro. La relación de ligando calculada a partir de los datos adquiridos con espectroscopia de 1H RmN permite calcular el número de lunares de los ligandos en la superficie de las nanopartículas. La relación molar entre los ligandos sobre la superficie de las nanopartículas de oro proporciona la densidad de ligando (Figura7). Las nanopartículas limpias tienen aproximadamente4 ligandos por nm 2. Los datos TGA también se pueden utilizar para estimar la relación de ligandos, si el intervalo de temperatura en el que desorb de la superficie de oro se conoce para cada ligando, y la desorción se produce en rangos de temperatura separados.

En resumen, este protocolo proporciona una manera sencilla de sintetizar el ligando MUS con un bajo contenido de sal y nanopartículas de oro anfifílico MUS:OT. Uno de los factores clave de la reproducibilidad de estas nanopartículas es el bajo contenido de sal inorgánica en el MUS utilizado. Estas nanopartículas son estables tantoen polvo como en solución (por ejemplo,H2O y fisiológicamente relevantes), que deben enfatizarse como un requisito previo para muchas aplicaciones. La caracterización exhaustiva del tamaño y las propiedades superficiales de las nanopartículas anfifílicas es esencial para futuras aplicaciones en las que el grado de anfiflicidad puede desempeñar un papel clave.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Z.P.G. y F.S. agradecen a la Fundación Nacional Suiza en Ciencias y, específicamente, a la "Ingeniería de Sistemas Moleculares" del NCCR. Z.L. y F.S. agradecen el apoyo de la beca de la División II de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia. Todos los autores agradecen a Quy Ong por discusiones fructíferas y por revisar el manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-bromo-1-undecene Sigma Aldrich 467642-25 ml
Sodium Sulfite Sigma Aldrich S0505-250 g
Benzyltriethyl-ammonium bromide Sigma Aldrich 147125-25 g
Methanol VWR BDH1135-2.5 LP
DI water Millipore ZRXQ003WW Deionized water
1 L round bottom flask DURAN 24 170 56
Diethyl ether Sigma Aldrich 1.00930 EMD Millipore
Stirring bar Sigma Aldrich Z329207,
Dow Corning High Vacuum Grease Sigma Aldrich Z273554 ALDRICH
Filtering flask DURAN 20 201 63
Filtering Buchner Funnel FisherSci 11707335
Ethanol >99.8%, ACS, Reagent VWR 2081.321DP
Deuterium dioxide Sigma Aldrich 151882 ALDRICH
Thioacetic acid 96% Sigma Aldrich T30805 ALDRICH
Carbon black Sigma Aldrich 05105-1KG
Celite Sigma Aldrich D3877 SIGMA-ALDRICH Filtration medium
Condenser Sigma Aldrich Z531154
Hydrochloric acid, ACS reagent 37% Sigma Aldrich 320331 SIGMA-ALDRICH
Sodium Hydroxide, BioXtra, pellets (anhydrous) Sigma Aldrich S8045 SIGMA-ALDRICH
Centrifuge tubes VWR 525-0155P
250 mL round bottom flask DURAN 24 170 37
500 mL round bottom flask DURAN 24 170 46
Nitric acid, fACS reagent 70% Sigma Aldrich 438073 SIGMA-ALDRICH
Gold(III) chloride trihydrate >99.9% trace metal basis Sigma Aldrich 520918 ALDRICH
1-octanethiol >98.5% Sigma Aldrich 471836 ALDRICH
Sodium Borohydride purum p.a.>96% Sigma Aldrich 71320 ALDRICH
addition funnel SIgma Aldrich Z330655 SIGMA
Funnel DURAN 21 351 46
2V folded filtering papers Whatman 1202-150
Amicon filters Merck UFC903024
Iodine, ACS reagent, >99.8%, solid Sigma Aldrich 207772 SIGMA-ALDRICH
5 mm NMR-Tubes, Type 5HP (high precision) Armar 32210.503 Length 178 mm
Methanol-d4 99.8 atom%D Armar 16400.2035
TGA crucible Thepro 9095-9270.45
400 mesh carbon supported copper grid Electron Microscopy Science CF400-Cu
quartz cuvette Hellma Analytics 100-1-40

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References

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Química Número 149 nanopartículas de oro anfifílico ligandos sulfonados síntesis caracterización recubrimiento de ligando binario monocapa autoensamblada
Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro anfifílicas
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Guven, Z. P., Silva, P. H. J., Luo,… More

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