Summary
在这里, 我们介绍了一种新的显微外科技术, 从 e13小鼠胚胎神经节隆起分离神经干细胞。
Abstract
神经干细胞是多能的, 可以产生中枢神经系统 (cns) 的三种主要细胞类型。nsc 的体外培养和扩开发为神经科学家研究神经元和胶质细胞的功能及其相互作用提供了合适的细胞来源。有几种技术被报道用于从成人或胚胎哺乳动物大脑中分离神经干细胞。在从胚胎中枢神经系统不同区域分离 nsc 的显微外科手术中, 减少对脑细胞的损害, 以获得最高比例的活干细胞和可膨胀干细胞是非常重要的。在从小鼠胚胎大脑中分离这些细胞时, 一种可能的减压技术是缩短手术时间。在这里, 我们展示了一种技术, 快速分离这些细胞从 e13小鼠胚胎神经节隆起。手术程序包括从子宫中取出 e13 小鼠胚胎, 用弯曲的针尖切割胚胎的额叶, 从头骨中取出大脑, 对分离的大脑进行显微解剖, 以获得神经节隆起,在 nsc 培养基中分离收获的组织以获得单个细胞悬浮液, 最后在悬浮培养中电镀细胞以产生神经球。
Introduction
神经干细胞 (nsc) 位于成人和胚胎大脑的不同区域, 它们有产生不同类型神经元和胶质细胞1的倾向。成年哺乳动物大脑2的下心室区和胚胎脑的神经节隆起是 nsc 丰富的区域3。在发育中的大脑中, 神经节隆起提供了大部分的皮质间质, 特别是 gabaep 的间质 3。还有一些从胚胎干细胞 (esc) 或诱导多能干细胞 (ipsc) 生成神经干细胞的侵入性较小的方法, 可以减少对动物使用的需求。尽管从 esc 或 ipsc 生成 nsc 是可能的4,5, 它有一些优点和缺点相比, 从成人或胚胎大脑 6,7的神经干细胞分离, 8。诱导 esc 和 ipsc 向神经元表型分化的方案总是耗时和成本消耗的, 成功率 (70-80% nestin 阳性细胞)5低于直接从动物大脑中分离出的 nsc (99% 以上的 nestin 阳性细胞)9。此外, 干细胞在几个通道10,11后失去其遗传稳定性和分化倾向。尽管还有其他关于将体细胞直接转化为 nsc 的新报告, 但这些细胞是基因工程的, 在每个实验室12中都不易获得。因此, 从动物大脑中分离神经干细胞的需求仍然很大;通过改进手术技术, 可以减少动物的使用量。通过缩短手术时间和改进技术, 可以使细胞远离损伤, 并从每只动物身上获得最高的 nsc 率。
在这里, 我们介绍了一种简化和可重复的技术, 从小鼠 e13胚胎大脑中分离神经干细胞。
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Protocol
所有关于动物的手术和程序都得到了伊朗德黑兰罗扬研究所动物伦理委员会的批准。
1. 手术器械、洗涤缓冲器 (hpes-mem)、细胞培养培养基和细胞培养板的制备
- 根据常规灭菌指南, 通过高压灭菌, 对手术工具 (剪刀、手术刀刀片手柄和钳子) 进行消毒。
- 准备足够数量的 hepes-mem 缓冲液 (约100毫升对于每个怀孕的小鼠来说就足够了)。在 hpees-mem 缓冲液中加入高浓度的抗生素 (10% 青霉素/链霉素)。这种抗生素的浓度对于降低微生物污染的风险是必要的。
- 制备 hepes-mem 缓冲液, 将 0.59 58 克 hepes 粉体加入100毫升 (最低必要介质), 搅拌均匀。将 ph 值调整到 7.3-7.4, 并使用0.22μm 过滤器对介质进行过滤。
- 制造含有神经基部培养基 (nb) 的 nsc 培养基, 辅以 20 ngml egf, 10 ngml bfgf, 1% 100x n2 补充剂或 1% b27 补充剂 (不含维生素 a), 1 u/ml 肝素, 1% l-谷氨酰胺, 1% 非必要氨基酸 (neaa), 1% 青霉素/链霉素, 以及0.1 mm β-硫醇。
2. 动物手术和显微解剖
- 在怀孕第13天 (此处, 使用4个月前的 balbbe 菌株), 由腹腔注射氯胺-木糖、100 mg kg 和 10 mg/kg 分别由体重麻醉。
- 通过在动物的脚上施加疼痛刺激 (例如用钳子捏) 确认深度麻醉, 当没有疼痛反射时, 通过颈椎脱位来牺牲动物。
- 喷洒70% 乙醇, 清洁和消毒腹部皮肤。
- 控制腹部的皮肤, 然后用剪刀切割皮肤和底层筋膜, 揭开腹腔和子宫角。
- 用剪刀取出含有胚胎的子宫角, 并将其转移到含有25毫升冷 hpees-mem 缓冲液的50毫升锥形管中。
- 将锥形管放置在层流罩下, 并打开引擎盖下的盖。将子宫角从试管中取出, 用足够数量的新鲜冷 hpees-mem 缓冲液冲洗 3次, 以消除碎屑和血液。
- 将子宫组织转移到含有7-10 毫升冷 hepes-mem 缓冲液的10厘米培养皿中。使用精细的剪刀打开子宫角, 并将胚胎转移到含有7-10 毫升冷的 heses-mem 缓冲液的新盘子中。现在把10厘米的盘子和胚胎放在解剖显微镜下进行显微解剖操作。
- 将25-27g 注射器针头的尖端推到钢制手术刀刀片手柄上, 使其尖端弯曲。弯曲针头, 直到尖端以70-90°的角度弯曲。在解剖显微镜下检查针尖, 以查看针尖处的弯曲情况。
注: 自然, 胚胎在盘子中具有侧向位置。 - 在不改变其位置的情况下, 用细钳将胚胎的颈部和身体固定在一起, 然后将针尖的弯曲部分插入胚胎头的额叶。那里会有小出血或血块。
- 表面移动针尖。当弯曲的部分是在隆起向额头, 然后向后脑勺, 一定要划破皮肤和头骨, 不要损坏下脑。
- 侧向推带针头的皮肤, 以揭开大脑, 并将针头从皮肤的侧侧插入到大脑下方的区域。将大脑从头骨上取出, 将其从解剖的头骨中取出。
- 用弯曲的钳子保持大脑稳定, 用微型剪刀切割每个半球的皮层, 以暴露神经节的显赫。
- 抓住大脑, 将解剖的神经节隆起放入含有神经干细胞的15毫升离心管中。神经节隆起的中间和侧面部分清楚地表明了这一点。
- 重复这个过程, 直到所有的大脑都被微解剖。
- 将移液器尖端放在管的底部, 切割解剖的神经节隆起。将悬浮液上下4至 5次, 以分解组织进行单个细胞悬浮液。
- 以 110 x g 离心悬浮液 5分钟, 取出上清液, 将细胞重新悬浮在1毫升的0.05% 的色氨酸 edta 中。
- 将细胞悬浮液在37°c 中培养 10分钟, 然后加入相当体积的大豆胰蛋白酶抑制剂 (25μg/ml), 以阻止胰蛋白酶活性。移液器细胞向上和向下悬浮, 以确保胰蛋白酶已完全灭活。
- 以 110 x g 离心细胞悬浮液 5分钟, 取出上清液, 在完整的 nsc 介质1毫升中重新悬浮细胞, 并计算细胞数量。
- 将 nsc 培养基中的细胞 (2x105 cellss/ml) 放入合适尺寸的组织培养瓶中。将5毫升传输到 t25, 将 20 ml 传输到 t75, 将 40 ml 传输到 t175 烧瓶。
注: 在37°c 的加湿孵化器中, 神经球体会出现在37°c 的加湿孵化器中 3天后。6-7 后, 球体的直径应在15-200μm 之间测量, 并可为亚培养做好准备。通过在七天后培育100万个初级 nsc, 细胞数量将增加到3-4亿个。
3. 神经球的胰蛋白酶化和通过
- 要对神经球进行亚培养, 将悬浮神经球的培养基转移到离心管, 离心机在 110 x g 下 5分钟, 然后丢弃上清液。加入1毫升0.05% 的胰蛋白酶 edta, 在37°C 孵育10分钟。
- 使用大豆胰蛋白酶抑制剂和移液器激活胰蛋白酶轻轻上下的神经球体, 使它们成为单细胞。
- 以 110 x g 离心细胞悬浮液 5分钟, 丢弃上清液, 并在 nsc 介质的1毫升中重新悬浮细胞。这些细胞已准备好在层压蛋白和聚 l-鸟氨酸涂层表面进行下一次亚培养或培养, 以便进行高级实验。
- 对于下一个亚培养, 将 nsc 转移到新的烧瓶中 (遵循步骤 2.8), 并在 nsc 介质中培养它们。在亚胺和聚 l-鸟氨酸涂层板上没有 bfgf 和 egf 的情况下诱导 nsc 培养基中的神经元分化培养 nsc (图 1b)。
- 在涂布过程中, 在细胞培养板上加入足够数量的稀释的多-l-鸟氨酸溶液 (25μg/ml), 在37°c 孵育 2小时, 使细胞培养表面充分覆盖。
- 吸入多-l-鸟氨酸, 并用 pbs 冲洗 2 x 井。加入足够的5μgl 层压蛋白, 以完全覆盖培养表面积, 并在37°c 孵育 2小时. 在电镀细胞或将板材存放在4°c 之前, 先将层压蛋白吸至 4°c, 直到需要。
4. 流式细胞仪检测
注: 流式细胞仪检测13可检测 nsc、神经元和胶质细胞的特异性标记物的表达。该协议以 menon等人13为基础,略作修改。
- 分离神经球或分离培养的 nsc 从涂层板通过胰蛋白酶化, 使他们成为单细胞。在细胞悬浮液100μl 中加入500μl 固定缓冲液 (pbs 中的 2%, 仅有甲醛 (pfa) (约100万个细胞足以对每个抗体进行染色), 然后在 rt 孵育15分钟。
- 在 110 x g 的管道和离心机中加入1毫升的 pbs 清洗细胞, 5分钟. 丢弃上清液并重新悬浮细胞颗粒, 在管内留下约100μl。
- 通过在细胞悬浮液100μl 中加入500μl 的 tween-20 (pbs 中的 0.7% tween-20) 来渗透细胞。在 rpm 的轨道振动台上培养管道 15分钟 (100 转/分)。
- 重复离心和 pbs 清洗。将上清液从管中完全取出, 只留下颗粒。在稀释缓冲液中加入100μl 稀释的原生抗体 (兔子抗小鼠β-β-iii、gfap 和 nestn 抗体, 浓度为 1:200), 稀释缓冲液中含有1% 的牛血清白蛋白、10% 的血清白蛋白、0.5% 的 tween-20, 并在 pbs 中轻轻三酸混合。在 rt 的轨道振动台上将管道孵化30分钟。
- 用 pbs 清洗细胞一次, 完全从管道中取出上清液, 只留下颗粒。
- 在 pbs 中加入100μl 稀释的二级抗体 (山羊抗兔 fitc 在1:500 浓度下结合) 到细胞颗粒中, 轻轻地三酸加入混合。在黑暗中的振动台上将 rt 的管道加出来30分钟。
- 用 pbs 清洗样品 2倍, 然后用流动缓冲液清洗一次。在大约150μl 的流动缓冲液中离心并重新悬挂细胞, 以便进行流式细胞仪分析。
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Representative Results
微解剖, 细胞分离和神经球培养.在这里, 我们提出了一种快速有效的方法, 为小鼠 e13脑显微手术和神经干细胞的分离。本文表明, 通过额部 fontanelle 的精细破裂, 可以将整个大脑从 e13 小鼠胚胎头骨中取出。有了这种方法, 大脑承受的伤害就会更小, 从大脑不同部位分离出细胞是可能的。在 bfgf 和 egf 存在的情况下, 收获的细胞可以在 nsc 培养基中产生神经球, 培养7天后, 它们的直径为 15-200μm (图 1 a)。在没有 bfgf 的情况下, 用0.05% 的胰蛋白酶/edta 分离神经球, 使其单细胞和培养物在没有 bfgf 的情况下, 在拉米宁----------------------------------------------------------------------------------------------(图 1 b)。
流式细胞仪检测结果.如图 2 a所示, 构成神经球体的细胞中有95±3.16% 是 nestin 阳性, 这是 nsc 的已知标记 (图 2a)。使用β-管材 iii 和 gfap 抗体对单细胞培养的 nsc 进行检测后发现, 通过在涂层表面培养细胞, 大多数 nsc 对神经元的区分最大 (94±2.67%), 而对胶质细胞的区分较少 (5±2.46%)。
图 1: 来自初级 e13的代表性图像小鼠胚胎神经干细胞.a. 7天后培养的神经球。b.在没有 bfgf 和 egf 的情况下, 在 nsc 培养基上, 在 lmininey-l-ornithine 包衣盘上, 将神经干细胞分化为成熟神经元7天。刻度条在 a 中代表 20μm, 在 b 中表示 50μm. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 2: 流式细胞仪检测 nestin (a)、β-tubulin-iii (b) 和 gfap (c) 阳性细胞的种群进行了验证.构建神经球的大多数细胞 (95±3.16%) 呈 nestin 阳性。在没有 egf 和 bfgf 的情况下, 对拉米宁-聚-l-鸟氨酸涂层板上粘接的 nsc 进行检测, 发现94±3.67% 的细胞为β-管蛋白 iii 阳性, 5±2.46% 表达为 gfap。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
使用合适的神经干细胞来源对神经科学家来说非常重要。神经干细胞可以从胚胎大脑的不同区域获得, 它们可以产生特定类型的神经元和胶质细胞。诱导神经干细胞分化的方法有多种, 以诱导它们产生成熟的神经元和胶质细胞。有大量报道表明, 在特定的培养条件和营养因子群中, 它们可以在体外产生神经元14、少突胶质细胞15、16和星形胶质细胞17。根据文献数据, 神经节隆起提供了一个很好的神经干细胞来源, 有可能产生不同类型的抑制和兴奋神经元, 如 gabaegé18和多巴胺能 19种类型.因此, 基于这些 nsc 生成较高的 gabaep 神经元率的自然趋势, 它们为抑制神经元的研究提供了合适的来源。
在本文中, 我们改进了大脑微解剖技术, 从 e13 小鼠胚胎头骨中提取整个大脑, 同时减少对脑组织的损害。为了从动物大脑中获得最高的 nsc 率, 建议缩短手术时间, 并执行环境温度和无菌条件等关键点。
成功执行此过程有一些关键步骤。动物手术和子宫解剖必须尽快在干净的房间里进行。如果有的话, 手术前使用紫外线清洁房间。为降低污染风险, 将子宫角转移到含有25毫升冷 hepes-mem 缓冲液的锥形管, 并关闭盖。不要在此步骤中使用培养皿, 因为它缺少螺帽。该管有助于避免从瓶盖中泄漏, 并有助于将子宫角浸泡在 hepes-mem 缓冲液中。将子宫管置于层流罩下, 在将子宫转移到培养皿之前, 用冷的 hepes-mem 缓冲液冲洗子宫至少3倍。这一步骤有效地降低了微生物污染的风险。
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Disclosures
未申报利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了罗扬研究所的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
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