Summary
Aquí, presentamos una nueva técnica microquirúrgica para el aislamiento de las células madre neurales de la eminencia gangliónica E13 ratón embrión.
Abstract
Las células madre neurales (NSC) son multipotentes y puede dar lugar a los tres tipos de células importantes del sistema nervioso central (SNC). In vitro cultura y expansión de NSCs proporcionan una fuente adecuada de células de neurocientíficos a estudiar la función de las neuronas y células gliales junto con sus interacciones. Existen varias técnicas divulgadas para el aislamiento de las células madre neurales del cerebro mamífero adulto o embrionario. Durante la operación de microcirugía para aislar NSCs de diferentes regiones del SNC embrionario, es muy importante reducir el daño a las células del cerebro para obtener el cociente más alto de células vivas y ampliables. Una técnica posible para reducir el estrés durante el aislamiento de estas células en el cerebro de embriones de ratón es la reducción del tiempo quirúrgico. Aquí, demostramos una técnica desarrollada para el aislamiento rápido de estas células de la eminencia gangliónica E13 ratón embrión. Los procedimientos quirúrgicos incluyen embriones de ratón de13 E desde el útero, la fontanela frontal de los embriones con una punta de la aguja doblada, extracción del cerebro del cráneo, microdisección del cerebro aislado para cosechar la eminencia gangliónica, de corte disociación de los tejidos cosechados en medio de la NSC para obtener una suspensión unicelular y, finalmente, chapado en células en cultivo de suspensión que generan neuroesferas.
Introduction
Las células madre neurales (NSC) residen en diferentes regiones del cerebro adulto y el embrión y que tienen una tendencia a generar diferentes tipos de neuronas y células gliales1. Las zonas subventricular del cerebro adulto de mamíferos2 y eminencia ganglionar en el cerebro del embrión son de las regiones ricas de NSC3. En el cerebro en desarrollo, la eminencia gangliónica ofrece la mayoría de las interneuronas corticales y particularmente de interneuronas de GABAérgico3. También hay métodos menos invasivos para la generación de células madre neuronales de las células madre embrionarias (ESCs) o uso de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) que reducen la demanda para el animal. A pesar de que la generación de NSCs de CES o iPSCs es posible4,5, tiene algunas ventajas y desventajas en comparación con el aislamiento de las células madre neurales del adulto o embrionario cerebro6,7, 8. Los protocolos para la inducción de la diferenciación del CES y iPSCs hacia fenotipos neuronales son siempre tiempo y coste de consumo y la tasa de éxito (70-80% Nestin las células positivas)5 es inferior comparada con aislamiento directo de NSCs del (cerebro animal más de 99% Nestin las células positivas)9. Por otra parte, las células madre pierden su tendencia genética de la diferenciación y estabilidad después de varios pasajes10,11. Aunque hay otros nuevos informes acerca de la conversión directa de células somáticas en NSCs, estas células son genéticamente modificadas y no son fácilmente accesibles en cada laboratorio12. Por lo tanto, todavía hay una gran demanda para el aislamiento de las células madre neurales del cerebro animal; es posible reducir la cantidad de uso animal mediante la mejora de las técnicas quirúrgicas. Reduciendo el tiempo quirúrgico y mejora de las técnicas, es posible mantener células lejos del daño y obtener la mayor tasa de NSCs de cada animal.
Aquí, presentamos una técnica simple y reproducible para el aislamiento de las células madre neurales del cerebro de embriones de ratón E13 .
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Protocol
Todas las cirugías y procedimientos en animales fueron aprobados por el Comité de ética animal del Instituto Royan, Teherán, Irán.
1. preparación de instrumental quirúrgico, lavado tampón (HEPES-MEM), medios de cultivo celular y placas de cultivo de células
- Esterilice los instrumentos quirúrgicos (tijeras, hoja de mango de bisturí y pinzas) en autoclave que ellos basan en las directrices de esterilización rutinaria.
- Preparar un volumen adecuado de tampón HEPES-MEM (alrededor de 100 mL es suficiente para que cada embarazada ratones). Añadir las altas concentraciones de antibióticos (penicilina/estreptomicina de 10%) al buffer HEPES-MEM. Esta concentración de antibióticos es necesaria para reducir el riesgo de contaminación microbiana.
- Para preparar el tampón HEPES-MEM, añadir a 100 mL de MEM (medio esencial mínimo) 0,5958 g de polvo HEPES y mezclar bien. Ajustar el pH a 7.3-7.4 y filtrar el medio utilizando un filtro 0,22 de μm.
- Hacer NSC medio que contiene medio de neurobasal (NB), suplementado con EGF, 10 ng/mL bFGF, de 20 ng/mL suplemento suplemento de x N2 100 de 1% o 1% B27 (sin vitamina A), 1 U/mL heparina, 1% glutamina, 1% de aminoácido no esenciales (AANE), 1% penicilina/estreptomicina, y 0,1 mM β-mercaptoetanol.
2. animal cirugía y Micro disección
- Anestesiar un ratón embarazadoel día 13 de gestación (aquí uso cepa BALB/c de 4 meses) por inyección intraperitoneal de ketamina-xilacina, 100 mg/kg y 10 mg/kg de peso corporal respectivamente.
- Confirmar la anestesia profunda por ejercer un estímulo doloroso (por ejemplo, sujetador con unas pinzas) en pie del animal y cuando no hay ningún reflejo de dolor, sacrificar los animales por dislocación cervical.
- Desinfectante y limpia la piel del abdomen por aspersión etanol al 70%.
- Control de la piel sobre el abdomen y luego corte la piel y la fascia subyacente con tijeras para descubrir la cavidad abdominal y cuernos uterinos.
- Quitar los cuernos uterinos con tijeras los embriones y transferirlos a un tubo cónico de 50 mL conteniendo 25 mL de tampón HEPES-MEM frío.
- Coloque el tubo cónico debajo de la campana de flujo laminar y abra la tapa bajo el capó. Sacar los cuernos uterinos del tubo y el enjuague 3 veces con suficiente volumen de eliminar desechos y sangre el tampón HEPES-MEM frío fresco.
- Transferir el tejido uterino a una placa de Petri que contiene 7-10 mL de tampón HEPES-MEM fría de 10 cm. Abrir los cuernos uterinos con fino tijeras y transferencia de embriones para un nuevo plato que contiene 7-10 mL de tampón HEPES-MEM frío. Ahora ponga el plato de 10 cm con embriones con el microscopio de disección para la operación de micro disección.
- Doblar la punta de una aguja de jeringa 25-27 G presionando su punta sobre una hoja de mango de bisturí de acero. Doblar la punta de la aguja hasta que la punta se dobla en un ángulo de 70-90°. Compruebe la punta de la aguja con el microscopio de disección para ver la curva en la punta de la aguja.
Nota: Naturalmente, los embriones tienen una posición lateral en el plato. - Sin cambiar su posición, sostenga el cuello y el cuerpo del embrión con pinzas finas y luego inserte la parte doblada de la punta de la aguja en la fontanela frontal de la cabeza del embrión. Habría sangrado pequeño o un coágulo de sangre allí.
- Mueva la punta de la aguja superficialmente. Mientras que la parte doblada está dentro de la protuberancia hacia la frente y luego hacia la parte posterior de la cabeza, asegúrese de cortar a través de la piel y el cráneo y no se dañe el cerebro subyacente.
- Empuje la piel con la punta de la aguja lateralmente a descubrir el cerebro e introducir la aguja desde el lado lateral de la piel en el área por debajo del cerebro. Quitar el cerebro del cráneo empujando para salir del cráneo disecado.
- Mantenga el cerebro usando el fórceps curvado y cortar la corteza de cada hemisferio, utilizando micro-tijeras para exponer la eminencia gangliónica.
- Mantenga el cerebro y colocar la eminencia ganglionar disecada en el tubo de centrífuga de 15 mL que contiene medio de células madre neurales. La eminencia gangliónica se muestra claramente con sus partes medias y laterales.
- Repita este procedimiento hasta que todos los cerebros han sido disecados de micro.
- Corte la eminencia ganglionar disecada colocando la punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo. Pipetear la suspensión hacia arriba y abajo de 4 a 5 veces para romper el tejido para una suspensión unicelular.
- Centrifugar la suspensión a 110 x g durante 5 minutos retirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de tripsina 0,05%-EDTA.
- Incubar la suspensión de células en a 37 ° C durante 10 minutos y luego añadir un volumen equivalente de inhibidor de la tripsina de la soja (25 μg/mL) para detener la actividad de la tripsina. Pipetear la suspensión de células hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la tripsina ha sido totalmente inactivado.
- Centrifugue la suspensión de células a 110 x g por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de medio completo de NSC y contar el número de células.
- Placa de las células (2 x 105 células/mL) en medio de la NSC en el frasco de cultivo de tejidos de tamaño adecuado. Transferir 5 mL a T25, 20 mL T75 y 40 mL a T175 frascos.
Nota: Neuroesferas aparecerá después de cultivo de 3 días a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% CO2. Después de 6-7 días, las esferas deben medir entre 150-200 μm de diámetro y estarán listas para efectuar un subcultivo. Mediante el cultivo de NSCs primarias 1 millón después de siete días el número de células aumentará a 3 millones.
3. tripsinización y pases de neuroesferas
- A subcultura las neuroesferas, transferir el medio con neuroesferas suspendida para el tubo de centrífuga centrifugar a 110 x g durante 5 min y entonces descarte el sobrenadante. Añadir 1 mL de tripsina 0,05%-EDTA e incubar a 37° C durante 10 minutos.
- Inactivación de la tripsina con inhibidor de tripsina de soja y pipeta las neuroesferas suavemente hasta y hasta hacen ellos solo células.
- Centrifugue la suspensión de células a 110 x g durante 5 min, descartar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de medio de NSC. Estas células están listas para próximo subcultura o cultura en laminina y revestido de poli-L-ornitina superficies para experimentos avanzados.
- Para el subcultivo siguiente, transferencia de NSC en el matraz nuevo (seguir paso 2.8) y cultura en el medio de NSC. Para la inducción de la cultura de la diferenciación neuronal NSC en el medio del NSC en la ausencia de bFGF y EGF en laminina y Poly-L-ornitina había recubierto de placas (figura 1B).
- Para el procedimiento de recubrimiento, completamente cubrir la superficie de cultivo celular mediante la adición de suficiente volumen de solución diluida de la polivinílico-L-ornitina (25 μg/mL) a la placa de cultivo celular e incubar a 37 ° C durante 2 h.
- Aspire la poly-L-ornitina y enjuague el bien 2 x con PBS. Añadir suficiente volumen de 5 μg/mL laminina completamente cubierta el área superficial de la cultura e incubar a 37 ° C durante 2 h. aspirado la laminina antes las células de la galjanoplastia o almacenar la placa a 4 ° C hasta que se necesite.
4. Análisis de citometría de flujo de
Nota: La expresión de marcadores específicos de NSCs, neuronas y células gliales puede medirse por el flujo cytometry análisis13. El protocolo se basa en Menon et al.,13 con modificaciones menores.
- Disociar neuroesferas o separar cultivos NSCs de placas cubiertas por tripsinización para hacer las células. Añadir 500 μl de tampón de fijación (2% paraformaldehido (PFA) en PBS) a 100 μl de la suspensión de células (alrededor de 1 millón de células bastan para tinción con cada anticuerpo) y luego incubar los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Células de lavado agregando 1 mL de PBS para el tubo y centrifugar a 110 x g por 5 min, deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células, dejando aproximadamente 100 μL en el tubo.
- Permeabilizar las células con Tween-20 (0.7% Tween-20 en PBS) Agregar 500 μl de tampón de Tween-20 a 100 μl de suspensión celular. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 15 min en un agitador orbital (100 rpm).
- Repetir la centrifugación y el lavado de PBS. Retire el sobrenadante de los tubos completamente, dejando únicamente el pellet. Añada 100 μl del diluido anticuerpos primarios (conejo anti ratón βtub-III, GFAP y nestina anticuerpos en concentración de 1: 200) en buffer de dilución contiene seroalbúmina bovina al 1%, 10% de suero (suero de cabra) y 0.5% Tween-20 en PBS y suavemente triture para mezclar. Incubar los tubos a temperatura ambiente por 30 min en un agitador orbital.
- Lavar las células una vez con PBS y retire el sobrenadante de los tubos completamente, dejando únicamente el pellet.
- Añada 100 μl del anticuerpo secundario diluido (de cabra anti conejo FITC conjugado en concentración de 1: 500) en PBS el precipitado de células y suavemente triturate para mezclar. Incubar los tubos a temperatura ambiente por 30 min en un agitador en la oscuridad.
- Lavar las muestras 2 x con PBS y luego lavado una vez con tampón de flujo. Centrifugar y resuspender las células en aproximadamente 150 μL de tampón de flujo para el análisis de citometría de flujo.
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Representative Results
Micro disección y aislamiento de células desarrolló cultura. Aquí, presentamos un método rápido y eficiente para microcirugía de cerebro de ratón E13 y aislamiento de células madre neurales. Este artículo muestra que es posible quitar todo el cerebro de un cráneo de embrión de ratón de E13 a través de una ruptura fina en fontanela frontal. Con este método, el cerebro sufre menos daño y es posible aislar células de diferentes partes del cerebro. Las células cosechadas podrían generar neuroesferas en medio de la NSC en presencia de bFGF y EGF y son 150-200 μm tamaño de diámetro después de siete días en cultivo (figura 1A). Neuroesferas fueron disociados con 0.05% tripsina/EDTA para hacer que las células y su cultura en los platos de laminina/Poly-L-ornitina-revestida en la ausencia de bFGF y EGF demostró que extender neurite como ramas y mostrar la morfología neuronal después de 7-10 días (Figura 1B).
Resultados de análisis de citometría de flujo. Como se muestra en la figura 2A, 95±3.16% de las células que constituyen las neuroesferas fueron nestina positivas, que es un conocido marcador de NSC (figura 2A). Ensayos sobre unicelular cultivan NSCs usando β-tubulina III y anticuerpos GFAP revelaron que por cultivo de células en superficies pintadas, la mayoría de las NSCs diferenciará más a las neuronas (94±2.67%) y menos a las células gliales (5±2.46%).
Figura 1 : Imágenes representativas de primaria E13 neural células de embrión de ratón. A. cultivo de neuroesferas después de 7 días. B. diferenciación de las células madre neurales a madurar las neuronas después de cultivo de 7 días en laminina/Poly-L-ornitina cubierto platos en medio de la NSC en la ausencia de bFGF y EGF. Barras de escala representan 20 μm en el A y 50 en B. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Las poblaciones de células nestina (A), βtubulin-III (B) y GFAP (C) positivas fueron verificadas por análisis de citometría de flujo. A. la mayoría de las células (95±3.16%) construcción de las neuroesferas fueron nestina positivas. B. ensayo sobre adhesivo cultivadas NSCs en placas recubierta laminina/Poly-L-ornitina en ausencia de EGF y bFGF reveló que 94±3.67 el % de células fueron % positivo y 5±2.46 de βtubulin-III expresa GFAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Utilizando una fuente adecuada de células madre neurales es muy importante para los neurólogos. Las células madre neurales podría cosecharse de diferentes áreas del cerebro embrionario y pueden generar tipos específicos de neuronas y células gliales. Existen varios métodos para la inducción de la diferenciación de las células madre neurales para inducirlos a generar neuronas maduras y células gliales. Hay numerosos informes que indican que bajo condiciones de cultivo específicas y regimientos de factor trófico, podría generar neuronas14, oligodendrocitos15,16 y17de astrocitosen vitro. Basado en los datos de la literatura, eminencia gangliónica proporciona una buena fuente de células madre neurales con el potencial para generar diferentes tipos de neuronas inhibitorias y excitatorias como tipos de GABAérgico18 y dopaminérgicas19 . Por lo tanto, basado en la tendencia natural de estos NSC para la generación de tasa más alta de las neuronas GABAérgicas, proporcionan una fuente conveniente para estudios sobre neuronas inhibitorias.
En este artículo, hemos mejorado la técnica de microdisección de cerebro para retirar todo el cerebro del cráneo de embrión de ratón E13 y ejerciendo menos daño al tejido cerebral. Para obtener la tasa más alta de NSCs del cerebro animal, es recomendable reducir la duración del tiempo quirúrgico y ejecutar los puntos clave como la temperatura ambiente y las condiciones de esterilidad.
Hay algunos pasos críticos para el desempeño exitoso de este procedimiento. La cirugía animal y disección uterina deben hacerse lo antes posible y en una habitación limpia. Utilizar luz ultravioleta para limpiar la habitación antes de la cirugía si está disponible. Para reducir el riesgo de contaminación, transferencia de cuernos uterinos en el tubo cónico que contiene 25 mL de tampón HEPES-MEM frío y cierre la tapa. No utilice una placa de Petri en este paso, pues carece de un tapón de rosca. El tubo ayuda a evitar la salida media de la tapa y ayuda a disfrutar de los cuernos uterinos en tampón HEPES-MEM. Poner el tubo uterino bajo la campana laminar y antes de transferir el útero a una placa Petri, enjuague uterina por lo menos 3 x con frío tampón HEPES-MEM. Este paso reduce efectivamente el riesgo de contaminación microbiana.
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Disclosures
Ningún conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Royan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
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