Summary
Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .
Abstract
Células-tronco neurais (NSCs) são multipotentes e pode dar origem a três tipos principais de célula do sistema nervoso central (SNC). Cultura in vitro e expansão de NSCs fornecem uma fonte adequada de células para neurocientistas estudar a função dos neurônios e células gliais, juntamente com suas interações. Existem várias técnicas relatadas para o isolamento de células-tronco neurais do cérebro de mamíferos adultos ou embrião. Durante a operação microcirúrgica para isolar NSCs de diferentes regiões do SNC embrionário, é muito importante reduzir os danos ao cérebro células para obter o rácio mais elevado de células-tronco ao vivo e expansíveis. Uma possível técnica para redução de estresse durante o isolamento dessas células do cérebro do rato embrião é a redução do tempo cirúrgico. Aqui, vamos demonstrar uma técnica desenvolvida para rápida isolamento dessas células da Eminência ganglionar embrião de rato E13 . Os procedimentos cirúrgicos incluem a colheita de embriões de rato E13 do útero, cortando a fontanela frontal do embrião com uma ponta de agulha torta, extraindo o cérebro do crânio, microdissection do cérebro isolado para colher a Eminência ganglionar, dissociação do tecido colhido no meio de NSC para obter uma suspensão de célula única e, finalmente, chapeamento de células em cultura de suspensão para gerar neurospheres.
Introduction
Células-tronco neurais (NSCs) residem em diferentes regiões do cérebro adulto e embrião e eles têm uma tendência a gerar diferentes tipos de neurônios e células gliais1. Zona subventricular no cérebro de mamíferos adultos2 e Eminência ganglionar do cérebro do embrião são regiões ricas de NSC3. No cérebro em desenvolvimento, a Eminência ganglionar oferece a maioria dos interneurônios corticais e particularmente gabaérgica interneurônios3. Também existem métodos menos invasivos para a geração de células-tronco neurais de células-tronco embrionárias (CES) ou uso de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) que reduzem a demanda por animal. Apesar do fato de que gerar NSCs de CES ou iPSCs é possível4,5, tem algumas vantagens e desvantagens em comparação com o isolamento de células-tronco neurais do adulto ou embrião cérebro6,7, 8. Os protocolos para induzir a diferenciação de CES e iPSCs em direção a fenótipos neuronais são sempre tempo e custo de consumo e a taxa de sucesso (70-80% Nestin células positivas)5 é mais baixo comparada com isolamento direto de NSCs o cérebro animal ( mais de 99% Nestin células positivas)9. Além disso, as células-tronco perdem sua tendência de estabilidade e diferenciação genética após várias passagens10,11. Embora existam outros novos relatórios sobre a conversão direta de células somáticas em NSCs, estas células são geneticamente e não são facilmente acessíveis em cada laboratório12. Portanto, ainda há uma grande demanda por isolamento de células-tronco neurais do cérebro animal; é possível reduzir a quantidade de uso animal, melhorando as técnicas cirúrgicas. Reduzindo o tempo cirúrgico e melhorar as técnicas, é possível manter as células de danos e obter a maior taxa de NSCs de cada animal.
Aqui, apresentamos uma técnica simplificada e reprodutível para isolamento de células-tronco neurais do cérebro de embrião do rato E13 .
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Protocol
Todas as cirurgias e procedimentos em animais, foram aprovados pelo Comitê de ética animal do Instituto de Royan, Teerã, Irã.
1. preparação dos instrumentos cirúrgicos, lavagem Buffer (HEPES-MEM), meios de cultura celular e placas de cultura de células
- Esterilize os instrumentos cirúrgicos (tesouras, punho de lâmina de bisturi e pinça) por autoclave-los baseados nas orientações da rotina de esterilização.
- Preparar um volume adequado de tampão HEPES-MEM (cerca de 100 mL é suficiente para cada ratos grávidas). Altas concentrações de antibióticos (10% penicilina/estreptomicina) adicione o tampão HEPES-MEM. Esta concentração de antibióticos é necessária para reduzir o risco de contaminação microbiana.
- Para preparar o tampão HEPES-MEM, adicionar 100 mL de MEM (meio essencial mínimo) 0,5958 g de pó HEPES e misture bem. Ajustar o pH a 7.3-7.4 e filtrar o meio usando um filtro de 0,22 µm.
- Faça proteína médio (NB) do neurobasal médio contendo de NSC, suplementada com 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, suplemento de x N2 100 1% ou 1% B27 suplemento (sem vitamina A), 1 U/mL heparina, 1% L-glutamina, 1% não-essenciais aminoácidos (timina), 1% penicilina/estreptomicina, e 0,1 mM β-Mercaptoetanol.
2. animal cirurgia e micro-dissecção
- Anestesiar um rato grávido no dia 13th de gestação (aqui, uso estirpe BALB/c com 4 meses) por injeção intraperitoneal de xilazina-cetamina, 100 mg/kg e 10 mg/kg de peso corporal respectivamente.
- Confirmar a anestesia profunda exercendo um estímulo doloroso (por exemplo, pitada com fórceps) no pé do animal e quando não há nenhum reflexo de dor, sacrificar o animal por deslocamento cervical.
- Desinfetante e limpa a pele do abdômen por pulverização de etanol a 70%.
- Controlar a pele ao longo do abdômen e em seguida, corte a pele e a fáscia subjacente com tesouras para descobrir a cavidade abdominal e cornos uterinos.
- Remover os cornos uterinos contendo os embriões por tesouras e transferi-los para um tubo cónico de 50 mL contendo 25 mL de tampão de HEPES-MEM frio.
- Coloque o tubo cônico sob o capô de fluxo laminar e abra a tampa do capô. Tragam os cornos uterinos do tubo e lavar 3 vezes com volume suficiente do fresco frio buffer HEPES-MEM para eliminar detritos e sangue.
- Transferi o tecido uterino para uma placa de Petri contendo 7-10 mL de frio tampão HEPES-MEM de 10 cm. Abra os cornos uterinos usando fina tesoura e transferência de embriões para um novo prato com 7-10 mL de frio tampão HEPES-MEM. Agora coloque o prato de 10 cm com embriões ao microscópio para a operação de micro-dissecção dissecação.
- Dobre a ponta de uma agulha de seringa G 25-27, empurrando sua dica sobre uma alça de lâmina de bisturi de aço. Dobre a ponta da agulha até que a ponta é dobrada em um ângulo de 70-90°. Verifique se a ponta da agulha ao microscópio dissecação para ver a curvatura na ponta da agulha.
Nota: Naturalmente, os embriões têm uma posição lateral no prato. - Sem alterar sua posição, segure o pescoço e o corpo do embrião com pinça fina e em seguida Insira a parte dobrada da ponta da agulha a fontanela frontal da cabeça do embrião. Haveria sangramento pequeno ou um coágulo de sangue lá.
- Mova a ponta de agulha superficialmente. Enquanto a parte dobrada está dentro o bojo em direção a testa e, em seguida, em direção a nuca, certifique-se de cortar a pele e o crânio e para não danificar o cérebro subjacente.
- Empurre a pele com a ponta da agulha lateralmente para descobrir o cérebro e insira a agulha do lado lateral da pele para a área embaixo do cérebro. Remova o cérebro do crânio, empurrando-o para sair do crânio dissecado.
- Mantenha o cérebro firme usando a pinça curvada e cortar o córtex de cada hemisfério usando microtesoura para expor a Eminência ganglionar.
- Agarre o cérebro e coloque a Eminência ganglionar dissecada no tubo de centrífuga de 15 mL contendo meio de células-tronco neurais. A Eminência ganglionar é claramente demonstrada com suas partes central e laterais.
- Repita este procedimento até que todos os cérebros foram dissecados por micro.
- Corte a Eminência ganglionar dissecada, colocando a ponta da pipeta contra o fundo do tubo. Pipete a suspensão e descer de 4 a 5 vezes para quebrar o tecido para uma suspensão de célula única.
- Centrifugar a suspensão de 110 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de 0,05% do trypsin-EDTA.
- Incube a suspensão de células em um 37 ° C por 10 min e em seguida, adicionar uma quantidade equivalente de inibidor de tripsina de soja (25 µ g/mL) para parar a atividade de tripsina. Pipete a suspensão de células para cima e para baixo certifique-se que a tripsina foi totalmente inactivada.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 110 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de meio de NSC completo e contar o número de células.
- As células (2 x 105 células/mL) no meio do NSC da placa para o balão de cultura de tecidos de tamanho adequado. Transferi 5ml para T25, 20 mL de T75 e 40 mL para balões T175.
Nota: Neurospheres aparecerá após cultura de 3 dias a 37 ° C numa incubadora umidificado com 5% de CO2. Depois de 6-7 dias, as esferas devem medir entre 150-200 µm de diâmetro e estarão prontas para repicagem. Por cultivar 1 milhão NSCs primárias após sete dias, o número de células aumentará para 3 milhões.
3. tripsinização e passagem de Neurospheres
- Subcultura do neurospheres, transferir médio com suspensão neurospheres para tubo de centrífuga, centrifugar a 110 x g por 5 min e em seguida, descartar o sobrenadante. Adicione 1 mL de 0,05% do trypsin-EDTA e incubar a 37° C por 10 min.
- Inativar a tripsina usando inibidor de tripsina da soja e pipeta o neurospheres suavemente até e para baixo para fazer os único células.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 110 x g por 5 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de meio de NSC. Estas células estão prontas para a próxima subcultura ou cultura na laminina e poli-L-ornitina revestido superfícies para experiências avançadas.
- Para a próxima subcultura, transfira NSCs para o balão de novo (siga os passos 2.8) e cultura-los no meio de NSC. Indução da cultura diferenciação neuronal NSCs no meio de NSC na ausência de bFGF e EGF na laminina e poli-L-ornitina revestido placas (figura 1B).
- Para o procedimento de revestimento, totalmente revestir a superfície de cultura de células, adicionando volume suficiente de solução diluída de poli-L-ornitina (25 µ g/mL) para a placa de cultura de células e incubar a 37 ° C por 2 h.
- Aspire o poli-L-ornitina e lave-o bem 2x com PBS. Adicione o volume suficiente de 5 µ g/mL laminina completamente cobrir a área de superfície de cultura e incubar a 37 ° C por 2 h. Aspire a laminina antes de chapear pilhas ou armazenar placa a 4 ° C, até que seja necessário.
4. fluxo Cytometry ensaio
Nota: A expressão de marcadores específicos de NSCs, neurônios e células gliais pode ser medida por citometria de fluxo do ensaio13. O protocolo é baseado em Menon et al.13 com pequenas modificações.
- Dissociar a neurospheres ou desanexar NSCs cultivadas de placas revestidas por tripsinização tornar as células únicas. Adicionar 500 µ l de tampão de fixação (2% paraformaldeído (PFA) em PBS) para 100 µ l de suspensão de célula (cerca de 1 milhão de células são suficientes para coloração com cada anticorpo) e então incubar os tubos no RT por 15 min.
- Lavagem de células, adicionando 1 mL de PBS para o tubo e centrifugar 110 x g por 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o celular, deixando aproximadamente 100 µ l do tubo.
- Permeabilize células com Tween-20 (0,7% Tween-20 em PBS) adicionando 500 µ l de tampão de Tween-20 a 100 µ l de suspensão de células. Incube os tubos no RT por 15 min em um agitador orbital (100 rpm).
- Repeti a centrifugação e a lavagem de PBS. Retire o sobrenadante os tubos completamente, deixando apenas a pelota. Adicionar 100 µ l de anticorpos primários diluídos (coelho anti rato βtub-III, GFAP e Nestin anticorpos na concentração de 1: 200) em tampão de diluição contendo albumina de soro bovino 1%, 10% de soro (soro de cabra) e 0.5% Tween-20 em PBS e suavemente triture a mistura. Incube os tubos no RT por 30 min em um agitador orbital.
- Lavar as células uma vez com PBS e retire o sobrenadante os tubos completamente, deixando apenas a pelota.
- Adicione 100 µ l de anticorpo secundário diluído (cabra anticoelho FITC Conjugado na concentração de 1: 500) em PBS para o centrifugado e suavemente triture para misturar. Incube os tubos no RT durante 30 min num agitador no escuro.
- Lavar as amostras 2 x com PBS e então lave uma vez com buffer de fluxo. Centrifugue e ressuspender as células em aproximadamente 150 µ l de tampão de fluxo para análise de citômetro de fluxo.
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Representative Results
Micro-dissecção, cela de isolamento e cultura de Neurosphere. Aqui, apresentamos um método rápido e eficiente para o isolamento de células-tronco neurais e Microcirurgia de cérebro do rato E13 . Este artigo mostra que é possível remover o cérebro de um crânio de embrião de rato de13 E através de uma ruptura bem na fontanela frontal. Com esse método, o cérebro sofre menos dano e é possível isolar as células de diferentes partes do cérebro. As células colhidas poderiam gerar neurospheres em meio de NSC na presença de bFGF e EGF, e eles são tamanho de 150-200 µm de diâmetro após sete dias em cultura (figura 1A). Neurospheres foram dissociados usando 0,05% tripsina/EDTA para torná-los células únicas e sua cultura em pratos laminina/poli-L-ornitina-revestido na ausência de bFGF e EGF mostrou que eles estendem o axônio como ramos e mostram a morfologia neuronal após 7-10 dias (Figura 1B).
Resultados de ensaio de fluxo Cytometry. Como mostrado na Figura 2A, 95±3.16% das células que constituem o neurospheres foram Nestin positiva, que é um conhecido marcador para NSCs (Figura 2A). Ensaios na única célula cultivadas NSCs usando β-tubulina-III e anticorpos GFAP revelaram que por cultivar células em superfícies envernizadas, a maior parte do NSCs irá diferenciar a maioria para os neurônios (94±2.67%) e menos para as células gliais (5±2.46%).
Figura 1 : Imagens representativas da primária E13 células-tronco neurais embrião de rato. R. culto neurospheres após 7 dias. B. diferenciação de células-tronco neurais para neurônios maduros após a cultura de 7 dias em laminina/poli-L-ornitina revestido pratos no meio e na ausência de bFGF e EGF de NSC. Barras de escala representam 20 µm em lá e 50 µm em B. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : As populações de células positivas Nestin (A), (B) βtubulin-III e GFAP (C) foram verificadas pelo ensaio de citometria de fluxo. R. a maioria das células (95±3.16%) construindo o neurospheres foram Nestin positivo. B. ensaio em adesivo cultivadas NSCs em placas de laminina/poli-L-ornitina revestido na ausência de EGF e bFGF revelou que 94±3.67% das células foram % positivo e 5±2.46 de βtubulin-III expressa GFAP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Usar uma fonte adequada de células-tronco neurais é muito importante para os neurocientistas. Células-tronco neurais pode ser colhidas de diferentes áreas do cérebro do embrião e podem gerar tipos específicos de neurônios e células gliais. Existem vários métodos para a indução da diferenciação de células-tronco neurais para induzi-los a gerar neurônios maduros e células gliais. Há inúmeros relatos indicando que em condições de cultura específica e regimentos fator trófico, poderia gerar neurônios14, oligodendrócitos15,16 e astrócitos17em vitro. Baseado nos dados da literatura, Eminência ganglionar fornece uma boa fonte de células-tronco neurais com potencial para gerar diferentes tipos de neurônios inibitórios e excitatórios como tipos de19 18 e dopaminérgico gabaérgica. Portanto, baseando-se a tendência natural destas NSCs para geração de maior taxa de neurônios gabaérgica, eles fornecem uma fonte adequada para estudos sobre neurônios inibitórios.
Neste artigo, melhorámos a técnica de microdissection do cérebro para retirar o crânio de embrião de rato de13 E o cérebro inteiro enquanto exercendo menos dano ao tecido cerebral. Para obter a maior taxa de NSCs de cérebro animal, é recomendável para reduzir a duração do tempo cirúrgico e executar os pontos-chave tais como a temperatura ambiente e condições estéreis.
Existem alguns passos críticos para o desempenho bem sucedido deste procedimento. A cirurgia animal e dissecação uterina devem ser feitos tão rapidamente quanto possível e em um quarto limpo. Use a luz UV para limpar o quarto antes da cirurgia, se disponível. Para reduzir o risco de contaminação, cornos uterinos de transferência para o tubo cônico contendo 25 mL de tampão de HEPES-MEM frio e feche a tampa. Não utilize uma placa de Petri nesta etapa pois falta-lhe uma tampa de rosca. O tubo ajuda a evitar vazamento médio da PAC e ajuda a absorver os cornos uterinos em tampão HEPES-MEM. Colocar o tubo uterino-sob o capô laminar e antes de transferir o útero para uma placa de Petri, enxágue uterina pelo menos 3x com frio tampão HEPES-MEM. Esta etapa efetivamente reduz o risco de contaminação microbiana.
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Disclosures
Não há conflito de interesse declarado.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Royan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
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