Summary
هنا، نحن نقدم تقنية microsurgical رواية لعزل الخلايا الجذعية العصبية من الماوس الجنين ه13 ganglionic نيافة.
Abstract
هي multipotent الخلايا الجذعية العصبية (الود) ويمكن أن تؤدي إلى ثلاثة أنواع الخلية الرئيسية للجهاز العصبي المركزي (CNS). الثقافة في المختبر ، والتوسع في الود توفير مصدر مناسب للخلايا لعلماء الأعصاب لدراسة وظيفة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية جنبا إلى جنب مع التفاعلات الخاصة بها. وهناك عدة تقنيات الإبلاغ عنها لعزل الخلايا الجذعية العصبية من أدمغة الثدييات الكبار أو الجنين. أثناء عملية ميكروسورجيكال لعزل الود من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي الأجنة، من المهم جداً للحد من الضرر لخلايا الدماغ للحصول على أعلى نسبة من الخلايا الجذعية حية وقابلة للتوسيع. تقنية ممكنة للحد من التوتر خلال عزل هذه الخلايا من المخ الجنين الماوس هو الحد وقت الجراحة. هنا، نحن إظهار تقنية المتقدمة لعزل السريع لهذه الخلايا من الماوس الجنين ه13 ganglionic نيافة. وتشمل الإجراءات الجراحية حصاد الأجنة الماوس13 ه من الرحم، وقطع fontanelle أمامي للجنين مع تلميح إبرة بنت، استخراج المخ من الجمجمة، ميكروديسيكشن الدماغ معزولة لحصاد نيافة جانجليونيك، تفكك الأنسجة المقطوع في المتوسط القومي للحصول على تعليق خلية مفردة، وأخيراً طلاء الخلايا في ثقافة تعليق لتوليد نيوروسفيريس.
Introduction
تتواجد الخلايا الجذعية العصبية (الود) في مناطق مختلفة من الدماغ الكبار والأجنة، ولديهم ميل لإنشاء أنواع مختلفة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية1. مناطق سوبفينتريكولار في المخ الثدييات الكبار2 ونيافة ganglionic في الدماغ الجنين بمجلس الأمن القومي المناطق الغنية3. في الدماغ، يسلم نيافة ganglionic معظم إينتيرنيورونس القشرية وخاصة جابايرجيك إينتيرنيورونس3. وهناك أيضا أساليب أقل الغازية لتوليد الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا) أو استخدام الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) التي تقلل من الطلب على الحيوانات. وعلى الرغم من حقيقة أن توليد الود من بتوليدا أو إيبسكس هو ممكن4،5، له بعض المزايا والعيوب مقارنة بعزل الخلايا الجذعية العصبية من الكبار أو الجنين الدماغ6،7، 8. البروتوكولات من أجل حفز التفريق بين بتوليدا وإيبسكس تجاه الخلايا العصبية تعمل دائماً الوقت والتكلفة المستهلكة ومعدل النجاح (70-80% نيستين الخلايا إيجابية)5 هو أقل مقارنة مع العزل مباشرة من الود من (الدماغ الحيواني أكثر من 99% نيستين الخلايا إيجابية)9. وعلاوة على ذلك، تفقد الخلايا الجذعية ميلها الاستقرار والتمايز الوراثي بعد عدة ممرات10،11. على الرغم من أن هناك تقارير أخرى جديدة حول التحويل المباشر للخلايا الجسدية في الود، هذه الخلايا هي المهندسة وراثيا ولا يمكن الوصول إليها بسهولة في كل مختبر12. ولذلك، لا يزال هناك طلب كبير لعزل الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الحيواني؛ فمن الممكن للحد من كمية الاستخدام الحيواني عن طريق تحسين التقنيات الجراحية. تقليل وقت الجراحية وتحسين التقنيات، فمن الممكن للحفاظ على الخلايا بعيداً عن الأضرار والحصول على أعلى معدل للود من كل الحيوانات.
نقدم لك هنا، أسلوب مبسط واستنساخه لعزل الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الجنين13 الماوس ه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع العمليات الجراحية والإجراءات على الحيوان بموافقة لجنة الأخلاقيات الحيوان من معهد Royan، طهران، إيران.
1-إعداد الأدوات الجراحية، غسل العازلة (حبيس-الفنزويلية) وخلية ثقافة الإعلام ولوحات ثقافة الخلية
- تعقيم الأدوات الجراحية (مقص والتعامل مع شفرة مشرط وملقط) بالتعقيم لهم استناداً إلى المبادئ التوجيهية التعقيم الروتينية.
- إعداد وحدة تخزين كافية حبيس-ذاكرة المخزن المؤقت (حوالي 100 مل ما يكفي لكل الفئران الحوامل). إضافة تركيزات عالية من المضادات الحيوية (البنسلين 10%/ستربتوميسين) إلى المخزن المؤقت حبيس-الفنزويلية. هذا التركيز للمضادات الحيوية أمر ضروري للحد من خطر التلوث الميكروبي.
- إعداد المخزن المؤقت هيبيس-الفنزويلية، إضافة 0.5958 غرام مسحوق هيبيس إلى 100 مل MEM (الحد الأدنى الأساسية المتوسطة)، ومزيج جيد. ضبط درجة الحموضة إلى 7.3-7.4 وتصفية المتوسطة استخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
- جعل مجلس الأمن القومي المتوسطة التي تحتوي على نيوروباسال المتوسطة (ملحوظة)، وتستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر مماثلة، 10 نانوغرام/مل بفجف، الملحق x N2 100 1% أو 1% B27 الملحق (بدون فيتامين A)، الهيبارين يو/مليلتر 1، 1% ل الجلوتامين، 1% من الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا)، 1% البنسلين/ستربتوميسين، و مم 0.1 β-ميركابتوثانول.
2-الحيوان الجراحة والتشريح الصغير
- تخدير ماوس حامل في اليومال 13 من الحمل (هنا، استخدام سلالة BALB/c تتراوح أعمارهم بين 4 أشهر) عن طريق الحقن داخل من الكيتامين xylazine، 100 مغ/كغ و 10 مغ/كغ من وزن جسم على التوالي.
- تأكيد التخدير العميق بما تمارسه من حافز مؤلمة (مثل قرصه مع الملقط) سيرا على الأقدام للحيوان، وعندما يكون هناك لا منعكس الألم، التضحية بالحيوان بخلع عنق الرحم.
- نظيفة ومطهرة جلد البطن بالرش إيثانول 70%.
- السيطرة الجلد على البطن وثم قطع الجلد واللفافة الأساسية مع مقص للكشف عن تجويف البطن وابواق الرحم.
- إزالة قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة بالمقص وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 25 مل من البرد حبيس-ذاكرة المخزن المؤقت.
- ضع أنبوب مخروطي تحت غطاء محرك السيارة الاندفاق الصفحي وفتح الغطاء تحت غطاء محرك السيارة. تبرز قرون الرحم من الأنبوب وشطف 3 مرات بما يكفي حجم المخزن المؤقت MEM حبيس البارد الطازج لإزالة الحطام والدم.
- نقل أنسجة الرحم إلى 10 سم طبق بتري يحتوي على 7-10 مل من البرد هيبيس-ذاكرة المخزن المؤقت. فتح ابواق الرحم استخدام الأجنة غرامة المقص ونقل إلى طبق جديد يحتوي على 7-10 مل من البرد حبيس-ذاكرة المخزن المؤقت. الآن وضع الطبق 10 سم مع الأجنة تحت مجهر تشريح لعملية تشريح الصغرى.
- ثني طرف إبرة حقنه ز 25-27 عن طريق دفع طرفها في التعامل مع شفرة المبضع الصلب. ثني طرف الإبرة حتى التلميح عازمة بزاوية من 70-90 درجة مئوية. تحقق من طرف الإبرة تحت مجهر تشريح لرؤية منعطف في غيض الإبرة.
ملاحظة: بطبيعة الحال، الأجنة لديها موقف أفقي في الطبق. - دون تغيير موقفهم، عقد العنق وجسم الجنين بالملقط غرامة وقم بإدراج الجزء بنت من طرف الإبرة في fontanelle أمامي لرأس الجنين. يكون هناك نزيف صغيرة أو تجلط الدم هناك.
- نقل تلميح إبرة سطحي. بينما الجزء بنت داخل الإنتفاخ نحو الجبين ومن ثم نحو مؤخرة رأسه، تأكد من إلى قطع طريق الجلد والجمجمة وليس إلى تلف الدماغ الكامنة.
- دفع الجلد بطرف الإبرة أفقياً كشف الدماغ وأدخل الإبرة من الجهة الجانبية للجلد إلى المنطقة أسفل الدماغ. إزالة الدماغ من الجمجمة بدفعها للخروج من تشريح الجمجمة.
- عقد الدماغ ثابت باستخدام الملقط المنحنية وقطع قشرة كل نصف الكرة الأرضية باستخدام مقص الجزئي لفضح نيافة جانجليونيك.
- عقد الدماغ ومكان نيافة ganglionic تشريح في أنبوب الطرد المركزي 15 مل التي تحتوي على الخلايا الجذعية العصبية المتوسطة. نيافة ganglionic يظهر بوضوح مع الأجزاء الوسطى والجانبية.
- كرر هذا الإجراء حتى يتم جميع العقول تشريح الصغرى.
- قص نيافة ganglionic تشريح بوضع طرف ماصة ضد الجزء السفلي من الأنبوب. "الماصة؛" تعليق صعودا وهبوطاً 4 إلى 5 مرات لتفريق الأنسجة لتعليق خلية مفردة.
- الطرد المركزي من التعليق في ز 110 x لأدنى 5 إزالة المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا الموجودة في 1 مل من 0.05% التربسين-يدتا.
- احتضان تعليق خلية في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم قم بإضافة وحدة تخزين ما يعادل من فول الصويا التربسين مثبط (25 ميكروغرام/مل) لوقف نشاط التربسين. "الماصة؛" تعليق خلية صعودا وهبوطاً للتأكد من أن التربسين كانت معطلة تماما.
- الطرد المركزي بتعليق خلية في 110 x ز لإزالة المادة طافية 5 كحد أدنى، وإعادة تعليق الخلايا الموجودة في 1 مل متوسط القومي كاملة وحساب عدد الخلايا.
- لوحة الخلايا (2 × 105 خلايا/مل) في مجلس الأمن القومي المتوسطة في قارورة زراعة الأنسجة مناسبة الحجم. نقل 5 مل T25، 20 مل T75 ومل 40 إلى قوارير T175.
ملاحظة: سوف تظهر نيوروسفيريس بعد 3 أيام الثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد مع شركة 5%2. بعد 6-7 أيام، المجالات ينبغي قياس بين 150-200 ميكرون في القطر، وسيكون جاهزاً لثقافة فرعية. بزراعة الود الابتدائي 1 مليون بعد سبعة أيام سوف تزيد عدد الخلايا إلى 3 مليون.
3-تريبسينيزيشن وباساجينج من نيوروسفيريس
- لثقافة فرعية نيوروسفيريس، نقل المتوسطة مع نيوروسفيريس مع وقف التنفيذ إلى أنبوب الطرد والطرد المركزي في ز 110 x لمدة 5 دقائق وثم تجاهل المادة طافية. أضف 1 مل من 0.05% التربسين-يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- إلغاء تنشيط التربسين استخدام مثبطات التربسين فول الصويا وماصة نيوروسفيريس برفق حتى ووصولا إلى جعل منهم واحدة من الخلايا.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في ز 110 x لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا الموجودة في 1 مل متوسط القومي. هذه الخلايا على استعداد للقادم من ثقافة فرعية أو الثقافة في لامينين وبولي-L-Ornithine مغلفة الأسطح لتجارب متقدمة.
- لثقافة فرعية التالي، نقل الود في قارورة جديدة (اتبع الخطوة 2.8) والثقافة لهم في الأجلين المتوسط ومجلس الأمن القومي. لتحريض تمايز الخلايا العصبية ثقافة الود في الأجلين المتوسط ومجلس الأمن القومي في غياب بفجف ولو على لامينين وبولي-L-Ornithine مغلفة بلوحات (الشكل 1B).
- لهذا الإجراء طلاء، تماما معطف السطح ثقافة الخلية بإضافة ما يكفي حجم المخفف بولي-L-ornithine الحل (25 ميكروغرام/مل) للوحة الثقافة الخلية واحتضان في 37 درجة مئوية ح 2.
- نضح بولي-L-ornithine وشطف x 2 جيدا مع برنامج تلفزيوني. إضافة إلى حجم ما يكفي من 5 ميكروغرام/مل laminin تماما تغطي مساحة الثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية ل 2 حاء أسبيراتي لامينين قبل طلاء الخلايا أو تخزين اللوحة عند 4 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
4-التدفق الخلوي الإنزيم
ملاحظة: يمكن قياس التعبير عن علامات محددة من الود، والخلايا العصبية والخلايا الدبقية بالتدفق الخلوي المقايسة13. ويستند البروتوكول مينون et al.،13 مع تعديلات طفيفة.
- ننأى نيوروسفيريس أو فصل الود مثقف المغلفة ألواح من تريبسينيزيشن لجعل خلايا واحد منهم. إضافة 500 ميليلتر لتثبيت المخزن المؤقت (بارافورمالدهيد 2% (PFA) في برنامج تلفزيوني) إلى 100 ميليلتر من تعليق خلية (حوالي 1 مليون الخلايا ما يكفي لتلوين مع كل الأجسام المضادة)، وثم احتضان هذه الأنابيب في RT لمدة 15 دقيقة.
- غسل الخلايا بإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني للأنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 110 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية، تاركاً ما يقرب من 100 ميليلتر في الأنبوب.
- بيرميبيليزي الخلايا مع توين-20 (0.7% 20 توين في برنامج تلفزيوني) بإضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت توين-20 إلى 100 ميليلتر من تعليق خلية. احتضان هذه الأنابيب في RT لمدة 15 دقيقة على شاكر مدارية (100 لفة في الدقيقة).
- كرر الطرد المركزي والغسيل PBS. إزالة المادة طافية من الأنابيب تماما، تاركين فقط بيليه. إضافة 100 ميليلتر من الأجسام المضادة الأساسي المخفف (الأرنب المضادة للماوس βtub الثالث وتوصيني نيستين الأجسام المضادة بتركيز 1: 200) في إضعاف المخزن المؤقت الذي يحتوي على ألبومين المصل البقري 1%، 10% مصل الدم (المصل الماعز) و 0.5% 20 توين في برنامج تلفزيوني ولطف تريتوراتي المزيج. احتضان الأنابيب في الرايت مدة 30 دقيقة حول شاكر مداري.
- تغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإزالة المادة طافية من الأنابيب تماما، تاركين فقط بيليه.
- إضافة 100 ميليلتر من جسم الثانوي المخفف (الماعز المضادة لأرنب فيتك مترافق بتركيز 1: 500) في برنامج تلفزيوني لبيليه الخلية ولطف تريتوراتي إلى المزيج. احتضان هذه الأنابيب في RT لمدة 30 دقيقة على شاكر في الظلام.
- تغسل العينات 2 x مع برنامج تلفزيوني ويغسل ثم مرة واحدة مع تدفق المخزن المؤقت. الطرد المركزي، وإعادة تعليق الخلايا في حوالي 150 ميليلتر من تدفق المخزن المؤقت لتحليل تدفق سيتوميتير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الصغير-تشريح وعزل الخلية والثقافة نيوروسفيري- وهنا، قدمنا طريقة سريعة وفعالة للماوس ه13 الدماغ الجراحة الدقيقة وعزل الخلايا الجذعية العصبية. يوضح هذا المقال أنه من الممكن إزالة الدماغ كله من جمجمة جنين ماوس ه13 من خلال تمزق الجميلة في فونتانيلي أمامي. مع هذا الأسلوب، يتحمله المخ أقل ضررا ومن الممكن أن عزل الخلايا من أجزاء مختلفة من المخ. يمكن أن تولد خلايا المقطوع نيوروسفيريس في مجلس الأمن القومي المتوسطة حضور بفجف ولو، وحجم 150-200 ميكرومتر في القطر بعد سبعة أيام في الثقافة (الشكل 1A). نيوروسفيريس تم فصلها باستخدام 0.05% التربسين/أدتا إلى جعلها الخلايا المفردة وثقافتهم في أطباق لامينين/بولي-L-أورنيثيني-المغلفة في غياب بفجف ولو أظهر أن يمدد نورت مثل الفروع وإظهار مورفولوجيا الخلايا العصبية بعد 7-10 أيام (الشكل 1B).
نتائج الفحص الخلوي التدفق. كما هو مبين في الشكل 2 أ، 95±3.16% من الخلايا التي تشكل في نيوروسفيريس كانت نيستين إيجابية، وعلامة معروفة للود (الشكل 2A). فحوصات في خلية مفردة مثقف الود استخدام β-tubulin-ثالثا وكشف الأجسام المضادة توصيني أن أكثر الود سوف يفرق بزراعة الخلايا على الأسطح المطلية، معظم الخلايا العصبية (94±2.67%)، وأقل في الخلايا الدبقية (5±2.46%).
الشكل 1 : صور الممثل من الابتدائي ه13 الماوس الخلايا الجذعية العصبية الجنين. ألف مثقف نيوروسفيريس بعد 7 أيام. ب التفريق بين الخلايا الجذعية العصبية للخلايا العصبية الناضجة بعد 7 أيام الثقافة في لامينين/بولي-L-ornithine المغلفة الأطباق في مجلس الأمن القومي في المتوسط في غياب بفجف ولو. أشرطة مقياس تمثل 20 ميكرومتر في ألف و 50 ميكرومتر في b الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تم التحقق من السكان في الخلايا إيجابية نيستين (A)، βtubulin-الثالث (ب)، و GFAP (C) بالتدفق الخلوي المقايسة. أ معظم الخلايا (95±3.16 ٪) بناء نيوروسفيريس كانت نيستين إيجابية. باء مقايسة على لاصق مثقف الود في لوحات Laminin/بولي-L-Ornithine المغلفة في غياب مماثلة وكشفت بفجف أن 94±3.67 ٪ من الخلايا كانت % إيجابية و 5±2.46 βtubulin-ثالثا أعرب توصيني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدام مصدر مناسب للخلايا الجذعية العصبية مهم جداً لعلماء الأعصاب. يمكن حصاد الخلايا الجذعية العصبية من مناطق مختلفة في الدماغ الجنين وأنها يمكن أن تولد أنواع محددة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. هناك عدة طرق لتحريض تمايز الخلايا الجذعية العصبية حملها على توليد الخلايا الدبقية والخلايا العصبية الناضجة. وهناك العديد من التقارير التي تشير إلى أنها يمكن أن تولد تحت ظروف ثقافة معينة وافواج العوامل التغذوية، الخلايا العصبية14و15،أوليجوديندروسيتيس16 و astrocytes17في المختبر. استناداً إلى البيانات من الأدب، نيافة ganglionic يوفر مصدرا جيدا للخلايا الجذعية العصبية مع القدرة على إنشاء أنواع مختلفة من الخلايا العصبية المثبطة وضادات مثل أنواع19 18 وتتميز جابايرجيك. ولذلك، استناداً إلى الميل الطبيعي لهذه الود لجيل معدل أعلى من الخلايا العصبية جابايرجيك، أنها توفر مصدر مناسب للدراسات المتعلقة بالخلايا العصبية المثبطة.
في هذه المقالة، قمنا بتحسين أسلوب ميكروديسيكشن الدماغ بسحب الدماغ كله من جمجمة الجنين ه13 الماوس أثناء ممارسة أقل ضررا لانسجة المخ. للحصول على أعلى معدل للود من الدماغ الحيواني، فمن المستحب تقليل مدة الجراحية وتنفيذ النقاط الرئيسية مثل درجة الحرارة المحيطة وظروف معقمة.
وهناك بعض الخطوات الحاسمة للأداء الناجح لهذا الإجراء. ويجب أن يتم بجراحه الحيوان وتشريح الرحم أسرع وقت ممكن وفي غرفة نظيفة. استخدام الأشعة فوق البنفسجية لتنظيف الغرفة قبل الجراحة إذا كانت متوفرة. للحد من خطر التلوث، نقل قرنية الرحم إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 25 مل من البرد حبيس-ذاكرة المخزن المؤقت وأغلق الغطاء. لا تستخدم طبق بيتري في هذه الخطوة كما أنها تفتقر إلى سداده ملولبة. الأنبوب يساعد على تجنب تسرب متوسطة من عملية النداءات الموحدة ويساعد على امتصاص قرون الرحم في المخزن المؤقت حبيس-الفنزويلية. وضع الرحم الأنبوب تحت غطاء محرك السيارة الصفحي وقبل نقل الرحم إلى طبق بيتري، شطف الرحم x 3 على الأقل مع الباردة حبيس-ذاكرة المخزن المؤقت. فعالية هذه الخطوة تقلل من مخاطر التلوث الميكروبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأعلن عدم تضارب المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل المعهد Royan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2 Unit2D.6 (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neuroscience. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
