Summary
Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.
Abstract
Neurale Stammzellen (NSCs) multipotent sind und kann die drei wichtigsten Zelltypen des zentralen Nervensystems (ZNS) entstehen. In-vitro- Kultur und den Ausbau der NSCs bieten eine geeignete Quelle von Zellen für Neurologen, die Funktion von Neuronen zu studieren und Gliazellen zusammen mit ihren Interaktionen. Es gibt verschiedene gemeldeten Techniken für die Isolierung von neuralen Stammzellen von Erwachsenen oder Embryo Säugetier-Gehirne. Während der mikrochirurgischen Operation, NSCs aus verschiedenen Regionen des embryonalen ZNS zu isolieren ist es sehr wichtig, den Schaden zu reduzieren, die Gehirnzellen, das höchste Verhältnis von Live- und erweiterbare Stammzellen zu erhalten. Eine mögliche Technik zum Stressabbau während Isolierung dieser Zellen aus dem Gehirn der Maus-Embryo ist die Reduzierung von OP-Dauer. Hier zeigen wir eine entwickelte Technik für schnelle Isolierung dieser Zellen aus der E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz. Chirurgische Eingriffe sind Ernte E13 -Maus-Embryonen aus der Gebärmutter, schneiden die vordere Fontanelle des Embryos mit einer gebogenen Nadelspitze, extrahieren das Gehirn aus dem Schädel, Mikrodissektion von isolierten Gehirn ganglionic Eminenz zu ernten, Dissoziation des geernteten Gewebes im NSC Medium um eine einzelne Zelle Aussetzung zu gewinnen und schließlich Beschichtung Zellen in Suspensionskultur, Neurosphären zu generieren.
Introduction
Neurale Stammzellen (NSCs) befinden sich in verschiedenen Regionen des Gehirns Erwachsener und Embryo und sie haben eine Tendenz, verschiedene Arten von Neuronen und Gliazelle1zu generieren. Die subventricular Zonen im erwachsenen Gehirn von Säugetieren2 und ganglionic Eminenz im Embryo Gehirn sind NSC reichen Regionen3. In das sich entwickelnde Gehirn liefert die ganglionic Eminenz die meisten kortikale Interneurone und insbesondere GABAergen Interneuronen3. Es gibt auch weniger invasiven Methoden zur Erzeugung von neuronalen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen (WSR) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die Senkung der Nachfrage nach Tier verwenden. Trotz der Tatsache, dass die Erzeugung von NSCs aus WSR oder iPSCs möglich4,5ist hat es einige vor- und Nachteile im Vergleich zur Isolierung von neuralen Stammzellen von Erwachsenen oder Embryo Gehirn6,7, 8. Die Protokolle zur Induktion der Differenzierung der WSR und iPSCs gegenüber neuronalen Phänotypen sind immer Zeit- und verbrauchen und die Rate der Erfolg (70-80 % Nestin positive Zellen)5 sind niedriger im Vergleich mit direkten Isolierung der NSCs aus dem tierischen Gehirn ( mehr als 99 % Nestin positive Zellen)9. Darüber hinaus verlieren die Stammzellen ihre genetische Stabilität und Differenzierung Tendenz nach mehreren Passagen10,11. Obwohl es andere neue Berichte über die direkte Umwandlung von Körperzellen in NSCs gibt, diese Zellen sind gentechnisch verändert und sind nicht leicht zugänglich in jedem Labor-12. Daher gibt es noch eine große Nachfrage für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus dem tierischen Gehirn; Es ist möglich, die Menge an tierischen Verbrauch zu reduzieren, durch die Verbesserung der Operationstechniken. Durch Reduzierung der OP-Dauer und die Techniken zu verbessern, ist es möglich, halten Zellen weg von Schäden und die höchste Rate an NSCs von jedem Tier zu erhalten.
Hier stellen wir eine vereinfachte und reproduzierbare Technik zur Isolierung von neuronalen Stammzellen von Embryos Gehirn der Maus E13 .
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Protocol
Alle Operationen und Prozeduren auf Tier stimmten mit der Tierethik-Ausschuss des Instituts Royan, Teheran, Iran.
1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten, Wasch-Puffer (HEPES-MEM), Zellkulturmedien und Kultur Zellplatten
- Chirurgische Instrumente (Schere, Skalpell Klinge Griff und Zange) durch Autoklavieren sie basierend auf den routinemäßigen Sterilisation Leitlinien zu sterilisieren.
- Bereiten Sie eine angemessene Menge HEPES-MEM-Puffer (etwa 100 mL ist ausreichend für jede Schwangere Mäuse). Hohe Konzentrationen von Antibiotika (Penicillin/Streptomycin 10 %) in den Puffer HEPES-MEM hinzufügen. Diese Konzentration von Antibiotika ist notwendig, um das Risiko einer mikrobiellen Kontamination.
- Um HEPES-MEM Puffer vorzubereiten, 100 mL von MEM (minimale wesentliche Mittel) 0,5958 g HEPES Pulver hinzufügen und gut verrühren. Den pH-Wert 7,3-7,4 einstellen und das Medium mit einem 0,22 µm-Filter filtern.
- NSC Mittel enthaltenden Neurobasal Mittel (NB) zu machen, ergänzt mit 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF 100 x N2-Zuschlag von 1 % oder 1 % B27 ergänzen (ohne Vitamin A), 1 U/mL Heparin, 1 % L-Glutamin, 1 % nicht-essentielle Aminosäure (NEAA), 1 % Penicillin/Streptomycin, und 0,1 mM β-Mercaptoethanol.
(2) Tier Chirurgie und Mikro-Dissektion
- Eine schwangere Maus aufdem 13 Tag der Trächtigkeit zu betäuben (hier Verwendung BALB/c Belastung im Alter von 4 Monaten) durch intraperitoneale Injektion von Ketamin-Xylazin, 100 mg/kg und 10 mg/kg Körpergewicht bzw..
- Bestätigen Sie Tiefe Narkose durch einen schmerzhaften Reiz (z. B. Prise mit Zange) am Fuß des Tieres ausüben und wenn es keine Schmerz-Reflex gibt, Opfern Sie das Tier durch zervikale Dislokation zu.
- Sauber und Desinfektion der Haut des Bauches durch Besprühen 70 % Ethanol.
- Kontrolle der Haut über den Bauch und dann schneiden Sie die Haut und die darunter liegenden Faszie mit einer Schere, die Bauchhöhle und die Gebärmutter Hörner aufzudecken.
- Entfernen Sie der Gebärmutter Hörner mit den Embryonen von Schere und übertragen Sie sie in ein 50 mL konische Röhrchen mit 25 mL kalte HEPES-MEM-Puffer.
- Das konische Rohr unter der Laminar-Flow-Haube und öffnen Sie die Kappe unter der Haube. Bringen Sie die uterine Hörner aus der Röhre und 3 Mal mit genügend Volumen des frischen kalten HEPES-MEM-Puffers zur Beseitigung von Schmutz und Blut spülen.
- Übertragen Sie das uterine Gewebe auf einer 10 cm Petrischale mit 7-10 mL kalte HEPES-MEM-Puffer. Öffnen Sie die uterine Hörner mit feinen Schere und Transfer Embryonen um eine neue Schale mit 7-10 mL kalte HEPES-MEM-Puffer. Setzen Sie nun die 10 cm Teller mit Embryonen unter dem sezierenden Mikroskop für den Mikro-Dissektion Betrieb.
- Biegen Sie ein 25-27 G Spritze Nadelspitze durch seine Spitze auf einem Stahl Skalpell Klinge Griff drücken. Biegen Sie die Spitze der Nadel, bis die Spitze in einem Winkel von 70-90 ° gebogen ist. Überprüfen Sie die Spitze der Nadel unter dem sezierenden Mikroskop zu sehen, die Biegung an der Spitze der Nadel.
Hinweis: Natürlich haben Embryonen eine seitliche Position in der Schale. - Ohne ihre Position zu ändern, halten Sie den Hals und Körper des Embryos mit feinen Zangen und legen Sie das Biegeteil der Nadelspitze in den frontalen Fontanelle des Embryos Kopfes. Kleine Blutungen oder ein Blutgerinnsel es gäbe.
- Verschieben Sie die Nadelspitze oberflächlich. Während das Biegeteil innerhalb der Beule auf der Stirn und dann in Richtung Rückseite des Kopfes befindet, stellen Sie sicher, Schnitt durch die Haut und der Schädel und nicht die zugrunde liegende Gehirn beschädigen.
- Drücken Sie die Haut mit der Spitze der Nadel seitlich um das Gehirn aufzudecken und stechen die Nadel aus der lateralen Seite der Haut auf den Bereich unterhalb des Gehirns. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel indem man es aus dem seziert Schädel herauskommt.
- Halten Sie das Gehirn ruhig mit den gebogenen Pinzette und schneiden Sie den Kortex des jede Hemisphäre mit Mikro-Schere, um ganglionic Eminenz verfügbar zu machen.
- Halten Sie das Gehirn und platzieren Sie die sezierte ganglionic Eminenz in der 15 mL Zentrifugenröhrchen mit neuronalen Stammzellen Medium. Die ganglionic Eminenz ist mit seiner mittleren und seitlichen Teile deutlich.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Gehirne Mikro seziert wurden.
- Schneiden Sie sezierte ganglionic Eminenz, indem man die Pipettenspitze gegen den Boden des Röhrchens. Pipette die Aussetzung nach oben und unten 4 bis 5 Mal, bis das Gewebe für eine einzelne Zelle Aussetzung zu brechen.
- Zentrifugieren Sie der Federung bei 110 X g für 5 min. Entfernen des Überstands und wieder auszusetzen Sie, die Zellen in 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA.
- Inkubieren Sie die Zellsuspension in einem 37 ° C für 10 min, und fügen Sie dann eine gleiche Menge an Soja Trypsin Inhibitor (25 µg/mL), die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Pipette die Zellsuspension rauf und runter, um sicherzustellen, dass die Trypsin völlig inaktiv gewesen ist.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 110 X g, für 5 min. Überstand zu entfernen und wieder auszusetzen, die Zellen in 1 mL der kompletten NSC Medium und die Anzahl der Zellen.
- Platte der Zellen (2 x 105 Zellen/mL) bei NSC Medium in die passende Größe Gewebekultur Flasche. Übertragen Sie 5 mL auf T25, 20 mL T75 und 40 mL bis T175 Kolben.
Hinweis: Neurosphären erscheint nach 3 Tage Kultur bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Nach 6-7 Tagen die Kugeln sollten zwischen 150-200 µm im Durchmesser messen und werden bereit für Subkultur. Durch den Anbau von 1 Million primäre NSCs nach sieben Tagen steigt die Anzahl der Zellen auf 3 Millionen.
3. Trypsinization und Passagierung von Neurospheres
- Zur Subkultur der Neurosphären übertragen Sie das Medium mit abgehängten Neurosphären auf die Zentrifugenröhrchen, 110 X g für 5 min Zentrifugieren Sie und verwerfen Sie den überstand. Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und bei 37° C für 10 min inkubieren.
- Die Trypsin mit Soja-Trypsin-Inhibitor und Pipette den Neurosphären sanft bis zu inaktivieren und hinunter machen sie einzelne Zellen.
- Die Zellsuspension bei 110 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand verwerfen und erneut aussetzen der Zellen in 1 mL der NSC Medium. Diese Zellen sind bereit für die nächste Subkultur oder Kultur auf Laminin und Poly-L-Ornithin beschichteten Oberflächen für fortgeschrittene Experimente.
- Für die nächste Subkultur NSCs in den neuen Kolben (folgen Schritt 2,8) zu übertragen und sie im NSC Medium Kultur. Für die Induktion von neuronaler Differenzierung Kultur NSCs in der NSC-Medium in der Abwesenheit von bFGF und EGF Laminin und Poly-L-Ornithin beschichtete Platten (Abbildung 1 b).
- Für den Beschichtungsvorgang voll Mantel der Zelloberfläche Kultur von der Zellplatte Kultur genügend Volumen der Lösung verdünnt Poly-L-Ornithin (25 µg/mL) hinzufügen und Inkubation bei 37 ° C für 2 h.
- Aspirieren Sie Poly-L-Ornithin und spülen Sie die gut 2 X mit PBS. Fügen Sie genügend Volumen von 5 µg/mL Laminin vollständig bedecken die Oberfläche Kultur und Inkubation bei 37 ° C für 2 h Aspirat die Laminin vor galvanischen Zellen oder Platte bei 4 ° C bis benötigt speichern.
(4) Flow Cytometry Assay
Hinweis: Der Ausdruck spezifischer Marker des NSCs, Neuronen und Gliazellen kann Flow Cytometry Assay13gemessen werden. Das Protokoll basiert auf Menon Et Al.,13 mit geringfügigen Änderungen.
- Neurosphären distanziert oder kultivierten NSCs aus beschichteten Platten durch Trypsinization Sie einzelne Zellen zu lösen. 100 µL Zellsuspension (rund 1 sind Millionen Zellen genug zum Beizen mit jeder Antikörper) 500 µL Fixierung Puffer (2 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer) hinzu, und dann inkubieren Sie die Rohre bei RT für 15 min.
- Wash-Zellen durch Zugabe von 1 mL PBS Tube und Zentrifuge bei 110 X g für 5 min. überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet, verlassen ca. 100 µL in der Röhre.
- Permeabilize Zellen mit Tween-20 (0,7 % Tween 20 in PBS) durch Zugabe von 500 µL Puffer Tween-20 bis 100 µL Zellsuspension. Inkubieren Sie die Rohre bei RT für 15 min auf einem Orbitalschüttler (100 u/min).
- Wiederholen Sie die Zentrifugation und PBS waschen. Entfernen Sie den Überstand von den Röhren vollständig, nur das Pellet hinterlässt. Fügen Sie 100 µL verdünnter Primärantikörper (Kaninchen anti-Maus βtub-III und GFAP, Nestin Antikörper bei 1: 200-Konzentration) in Verdünnungspuffer mit 1 % Rinderserumalbumin, 10 % Serum (Ziegenserum) und 0,5 % Tween 20 in PBS und sanft genannte mischen. Inkubieren Sie die Rohre bei RT für 30 min auf einem Orbitalschüttler.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und entfernen Sie den Überstand aus den Rohren vollständig, nur das Pellet hinterlässt.
- Fügen Sie 100 µL verdünnter Sekundärantikörper (Ziege anti-Kaninchen-FITC konjugiert in Konzentration von 1: 500) mit PBS-Puffer zum Zelle Pellet und sanft genannte um zu mischen. Inkubieren Sie die Rohre bei RT für 30 min auf einen Shaker im Dunkeln.
- Waschen Sie die Proben 2 X mit PBS und dann waschen einmal mit Flow-Puffer. Zentrifugieren und Zellen in ca. 150 µL fließen Puffer für Flow Cytometer Analyse wieder auszusetzen.
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Representative Results
Micro-Dissektion, Zelle Isolation und Kultur Neurosphäre. Hier präsentierten wir eine schnelle und effiziente Methode zur Maus E13 Gehirn Mikrochirurgie und Isolierung von neuralen Stammzellen. Dieser Artikel zeigt, dass es möglich ist, das ganze Gehirn von einem E13 Maus Embryo Schädel durch einen feinen Bruch im vorderen Fontanelle zu entfernen. Mit dieser Methode wird das Gehirn erträgt weniger Schaden und es ist möglich, Zellen aus verschiedenen Teilen des Gehirns zu isolieren. Die geernteten Zellen im NSC Medium im Beisein von bFGF und EGF Neurosphären erzeugen könnte, und sie sind 150-200 µm Größe Durchmesser nach sieben Tagen in der Kultur (Abbildung 1A). Neurosphären wurden getrennt mit 0,05 % Trypsin/EDTA um sie einzelne Zellen und ihre Kultur auf Laminin/Poly-L-Ornithin-beschichtete Gerichte in der Abwesenheit von bFGF und EGF hat gezeigt, dass sie Neuriten wie Äste verlängern und neuronale Morphologie nach 7-10 Tagen zeigen (Abbildung 1 b).
Flow Cytometry Assay Ergebnisse. Wie in Abbildung 2Agezeigt, 95±3.16 % der Zellen bilden die Neurosphären Nestin waren positiv, was ein bekannter Marker für NSCs (Abbildung 2A). Assays auf einzelne Zelle kultiviert NSCs mit β-Tubulin-III und GFAP-Antikörper ergab, dass durch die Kultivierung von Zellen auf beschichteten Oberflächen, die den Großteil der NSCs die meisten Neuronen (94±2.67 %) unterscheiden und weniger auf die Gliazellen (5±2.46 %).
Abbildung 1 : Repräsentative Bilder vom primären E13 Maus Embryo neuralen Stammzellen. A. kultiviert Neurosphären nach 7 Tagen. B. Differenzierung von neuralen Stammzellen reife Neuronen nach 7-Tage-Kultur auf Laminin/Poly-L-Ornithin beschichtet Gerichte im NSC Medium in der Abwesenheit von bFGF und EGF. Maßstabsleisten repräsentieren in A 20 µm und 50 µm in B. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Die Populationen von Nestin (A), βtubulin-III (B) und GFAP (C) positive Zellen wurden von Flow Cytometry Assay überprüft. A. die meisten Zellen (95±3.16 %) die Neurosphären Bau waren positive Nestin. B. Assay auf Kleber kultiviert NSCs auf Laminin/Poly-L-Ornithin beschichteten Platten in der Abwesenheit von EGF und bFGF ergab, dass 94±3.67 % der Zellen waren positiv und 5±2.46 % βtubulin-III ausgedrückt zuzuführen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Mit einer geeigneten Bezugsquelle von neuralen Stammzellen ist sehr wichtig für die Neurowissenschaftler. Neurale Stammzellen könnten aus verschiedenen Bereichen des Gehirns Embryo geerntet werden und sie können bestimmte Typen von Neuronen und Gliazellen zu generieren. Es gibt mehrere Methoden für die Induktion der Differenzierung der neuralen Stammzellen induzieren sie Reifen Neuronen und Gliazellen zu generieren. Es gibt zahlreiche Berichte, wonach unter bestimmten Kulturbedingungen und trophischen Faktor Regimenter, sie Neuronen14, Oligodendrozyten15,16 und Astrozyten17in Vitroerzeugen könnte. Basierend auf den Daten aus der Literatur, bietet ganglionic Eminenz eine gute Quelle von neuralen Stammzellen mit dem Potenzial, verschiedene Arten von inhibitorischen und exzitatorischen Neuronen wie GABAergen18 und dopaminergen19 Arten erzeugen. Daher, basierend auf die natürliche Tendenz des diese NSCs für höhere Rate der GABAergen Neuronen-Generation, bieten sie eine geeignete Quelle für Studien über hemmende Neuronen.
In diesem Artikel haben wir die Gehirn Mikrodissektion Technik um das ganze Gehirn vom E13 Maus Embryo Schädel zurückzuziehen, während weniger Schäden an das Hirngewebe auszuüben verbessert. Um die höchste Rate der NSCs aus tierischen Gehirn zu erhalten, ist es empfehlenswert, Reduzierung der Dauer der OP-Dauer und die wichtigsten Punkte wie Umgebungstemperatur und sterilen Bedingungen auszuführen.
Es gibt einige wichtige Schritte für eine erfolgreiche Leistung dieses Verfahrens. Die tierischen Chirurgie und uterine Dissektion müssen so schnell wie möglich und in einem sauberen Raum erfolgen. Verwenden Sie UV-Licht, um den Raum vor der Operation zu reinigen, falls vorhanden. Um das Kontaminationsrisiko zu reduzieren, übertragen Sie uterine Hörner auf der konischen Röhrchen mit 25 mL kalte HEPES-MEM-Puffer und schließen Sie den Deckel. Verwenden Sie eine Petrischale nicht in diesem Schritt, wie es einen Schraubverschluss fehlt. Das Rohr kann Auslaufen des Mediums von der Kappe zu vermeiden und hilft einweichen die uterine Hörner in HEPES-MEM-Puffer. Habe das uterine-Rohr unter der laminar Haube und vor der Übertragung der Gebärmutter zu einer Petrischale, uterine mindestens 3 X mit kalten HEPES-MEM-Puffer spülen. Dieser Schritt reduziert das Risiko einer mikrobiellen Kontamination.
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Disclosures
Kein Interessenkonflikt erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Royan-Institut unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
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