Summary
כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.
Abstract
תאי גזע עצביים (NSCs) multipotent, יכולים להצמיח שלושת הסוגים התא העיקריים של מערכת העצבים המרכזית (CNS). In vitro לקשרי תרבות והרחבה של NSCs מספקים מקור מתאים של תאים עבור מדעני מוח ללמוד את הפונקציה של נוירונים ותאי גלייה יחד עם האינטראקציות שלהם. ישנן מספר טכניקות שדווחו על בידודו של תאי גזע עצביים של המוח בתרבית של מבוגר או העובר. במהלך פעולת המיקרוכירורגית לבודד NSCs מאזורים שונים של מערכת העצבים עובריים, חשוב מאוד לצמצם את הנזק לתאי המוח כדי לקבל את היחס הגבוה של תאי גזע בשידור חי וניתן להרחבה. טכניקה אפשרית להפחתת מתח במהלך בידוד התאים האלה מהמוח העובר העכבר הוא צמצום זמן כירורגי. . הנה, נדגים טכניקה שפותחה עבור בידוד מהיר של תאים אלה מן E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו. ניתוחים כוללות קצירת E13 העכבר העוברים מן הרחם, חותכים את פונטאנלה חזיתית של העובר עם טיפ המחט בנט, חילוץ במוח הגולגולת, microdissection של המוח מבודדים לקצור את קדושתו ganglionic, דיסוציאציה של הרקמה שנקטפו במדיום לבטחון לאומי כדי לקבל השעיה תא בודד, ולבסוף תאי ציפוי בתרבות ההשעיה ליצירת neurospheres.
Introduction
תאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים באזורים שונים של המוח מבוגר ואת העובר, ויש להם נטייה ליצור סוגים שונים של נוירונים, תאי גליה1. האזורים subventricular המוח יונקים בוגרים2 קדושתו ganglionic במוח העובר לבטחון לאומי אזורים עשירים3בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. במוח המתפתח, מספק קדושתו ganglionic רוב interneurons קורטיקלית במיוחד GABAergic interneurons3. יש גם שיטות פולשניות פחות לייצור תאי גזע עצביים מתאי גזע עובריים (ESCs) או להשתמש בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) להפחית את הביקוש חיה. למרות העובדה כי יצירת NSCs ESCs או iPSCs הוא אפשרי4,5, זה יש כמה יתרונות וחסרונות לעומת הבידוד של תאי גזע עצביים מבוגר או העובר המוח6,7, 8. הפרוטוקולים עבור גרימת את הבידול של ESCs ו- iPSCs לכיוון פנוטיפים עצביים הם תמיד זמן ועלות לצרוך, הקצב של הצלחה (70-80% Nestin חיובי תאים)5 מושווה נמוך עם בידוד ישיר של NSCs מ (החייתי במוח יותר מ-99% Nestin חיובי תאים)9. יתר על כן, תאי גזע לאבד את נטייתם הגנטית של יציבות ובידול אחרי קטעים מספר10,11. למרות שישנם דיווחים חדשים אחרים על המרה ישירה של תאים סומטיים לתוך NSCs, תאים אלה הם מהונדסים גנטית והם אינם נגישים בקלות בכל מעבדה12. לכן, עדיין יש ביקוש גדול עבור בידוד של תאי גזע עצביים מהמוח בעלי חיים; זה אפשרי לצמצם את כמות השימוש בבעלי חיים על ידי שיפור טכניקות כירורגיות. על-ידי הפחתת זמן ניתוח ושיפור הטכניקות, זה אפשרי לשמור תאים מן הנזק ולקבל שיעור הגבוה ביותר של NSCs של כל בעל חיים.
כאן, אנחנו מציגים טכניקה פשוטה and לשחזור עבור בידוד של תאי גזע עצביים של מוח העובר13 העכבר E.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניתוחים ופרוצדורות על בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים של מכון Royan, טהראן, איראן.
1. הכנת מכשירי ניתוח שוטף מאגר (HEPES-מ), תא תרבות המדיה וצלחות תרבות תא
- לחטא כלים כירורגיים (מספריים, סכין להב ידית ומלקחיים) על ידי autoclaving שאותם בהתבסס על הקווים המנחים עיקור שגרתית.
- הכנת אמצעי אחסון נאותים מאגר HEPES-מ (בסביבות 100 מ ל זה מספיק בשביל כל העכברים בהריון). הוסף ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה (10% פניצילין/סטרפטומיצין) למאגר HEPES-מ. בריכוז זה של אנטיביוטיקה יש צורך להפחית את הסיכון של זיהום מיקרוביאלי.
- כדי להכין מאגר HEPES-מ, להוסיף 0.5958 גר' אבקת HEPES 100 מ של מאמ (מינימום הכרחי בינוני), ומערבבים היטב. להתאים את ה-pH ל 7.3-7.4 ולסנן את המדיום באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22.
- להפוך לבטחון לאומי בינוני המכיל neurobasal בינוני (NB), בתוספת 20 ng/mL EGF, bFGF 10 ננוגרם למ"ל, תוספת x N2 100 1% או 1% B27 תוספת (ללא ויטמין A), 1 U/mL הפארין, 1%-גלוטמין, חומצת אמינו שאינן הכרחיות 1% (NEAA), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ו 0.1 מ מ β-mercaptoethanol.
2. בעלי חיים ניתוח, ניתוח מיקרו
- עזים ומתנגד עכבר בהריון ביוםה 13 של ההיריון (כאן, שימוש BALB/c המתח מגיל 4 חודשים) על ידי הזרקת בקרום הבטן של קטמין-חריגות השירותים הווטרינריים, 100 מ"ג/ק"ג ו- 10 מ"ג/ק"ג על ידי למשקל הגוף בהתאמה.
- לאשר הרדמה עמוקה מצידה של גירוי כואב (למשל, קמצוץ עם מלקחיים) ברגל של החיה, כאשר יש רפלקס אין כאב, להקריב את החיה על ידי נקע בצוואר הרחם.
- נקי, מחטא העור של הבטן על ידי התזת 70% אתנול.
- שליטה על העור בבטן ולאחר מכן לחתוך את העור ואת fascia הבסיסית עם מספריים כדי לחשוף את חלל הבטן ואת הרחם קרניים.
- הסר את הקרניים הרחם המכילה את העוברים על-ידי מספריים, להעביר אותם לתוך צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 25 מ של מאגר HEPES-מ קר.
- למקם את צינור חרוטי מתחת למכסה המנוע זרימה שכבתית ופתח את הכובע מתחת למכסה המנוע. . תוציא את הקרניים הרחם מן צינור שטיפה 3 פעמים עם מספיק נפח המאגר טרי HEPES-מ קר לסלק פסולת ודם
- להעביר את רקמת הרחם 10 ס מ המכיל 7-10 מ"ל של מאגר HEPES-מ קר צלחת פטרי. פתח את הקרניים הרחם באמצעות עוברי מספריים והעברת בסדר תבשיל חדש המכיל 7-10 מ"ל של מאגר HEPES-מ קר. עכשיו לשים את הצלחת 10 ס מ עם העוברים תחת המיקרוסקופ ויבתר עבור פעולת ניתוח מיקרו.
- לכופף את קצה מחט מזרק 25-27 גרם על ידי דחיפת את קצהו על ידית להב סכין פלדה. לכופף את קצה המחט עד הקצה מכופף בזווית של 70-90 מעלות. בדוק את קצה המחט תחת המיקרוסקופ ויבתר לראות העיקול בקצה המחט.
הערה: באופן טבעי, העוברים יש עמדה לרוחב בצלחת. - מבלי לשנות את עמדתם, להחזיק את הצוואר ואת הגוף של העובר עם מלקחיים בסדר ולאחר מכן להכניס את החלק כפוף של קצה המחט פונטאנלה חזיתית ראש העובר. שם יהיה דימום קטן או קריש דם שם.
- הזז את מחט באופן שטחי. בעוד החלק כפופות בתוך הבליטה כלפי המצח ולאחר מכן לכיוון האחורי של הראש, ודא לחתוך את העור ואת הגולגולת ולא נזק למוח המשמש כבסיס.
- לדחוף את העור עם קצה המחט רוחבית כדי לחשוף את המוח ולהוסיף את המחט מן הצד הלטראלי של העור באזור מתחת המוח. הסר במוח הגולגולת על-ידי דחיפתו לצאת החוצה מהגולגולת גזור.
- תחזיק את המוח יציב עם המלקחיים מעוקל וחותכים וקליפה של האונה כל באמצעות מיקרו-מספריים כדי לחשוף את קדושתו ganglionic.
- . תחזיק את המוח ולמקם את קדושתו ganglionic גזור לתוך צנטריפוגה 15 מ"ל הצינור המכיל תאי גזע עצביים בינוני. קדושתו ganglionic מוצג בבירור עם חלקיו האמצעי ולא לרוחב.
- חזור על הליך זה עד כל המוחות היה גזור-מיקרו.
- חותכים את קדושתו ganglionic גזור על-ידי הצבת את הטיפ פיפטה בתחתית הצינורית. Pipette התליה לאורך 4 עד 5 פעמים כדי לשבור את הרקמה להשעיה תא בודד.
- Centrifuge התליה ב 110 x g עבור 5 דק. הסר את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA.
- דגירה התליה תא ב- 37 מעלות למשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף אמצעי מקביל של מעכבי טריפסין סויה (25 µg/mL) להפסיק את הפעילות טריפסין. Pipette התליה תא למעלה ולמטה כדי לוודא כי טריפסין כבר לגמרי לא מופעל.
- Centrifuge התליה תא ב 110 x g עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע מחדש להשעות את התאים 1 מ"ל של מדיום לבטחון לאומי מלאה ואת לספור את מספר התאים.
- צלחת התאים (2 x 105 תאים/mL)-המועצה לבטחון לאומי בינוני לתוך הבקבוק תרביות רקמה בגודל מתאים. העברה מ ל T25, 20 מ"ל T75, 40 מ"ל עד T175 המבחנות.
הערה: Neurospheres יופיע לאחר שלושה ימי תרבות-37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO2. אחרי 6-7 ימים, הספירות צריך למדוד בין 150-200 מיקרומטר בקוטר, תהיה מוכן תת-תרבות. ע י טיפוח מיליון NSCs הראשי לאחר שבעה ימים מספר התאים יגדל ל 3-4 מליון.
3. trypsinization ו- Passaging של Neurospheres
- כדי תת-תרבות neurospheres, להעביר את המדיום עם neurospheres מושעה הצינור צנטריפוגה, צנטריפוגה ב 110 x g למשך 5 דקות ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- בטל את טריפסין בעזרת מעכבי טריפסין סויה פיפטה neurospheres בעדינות עד ורווקה למטה כדי לבצע אותם תאים.
- Centrifuge התליה תא ב 110 x g למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש תאי 1 מ"ל של המועצה לבטחון לאומי בינוני. תאים אלה מוכנים תת-תרבות או תרבות על Laminin הבא, פולי-L-Ornithine מצופה משטחים לניסויים מתקדמים.
- תת-תרבות הבא, להעביר NSCs לתוך הבקבוק החדש (בצע שלב 2.8), תרבות אותם במדיום לבטחון לאומי. עבור אינדוקציה של בידול עצביים תרבות NSCs במדיום לבטחון לאומי בהיעדרו של bFGF ו EGF Laminin, פולי-L-Ornithine מצופה לוחות (איור 1B).
- תהליך ציפוי, מלא מעיל על פני התרבות התא על-ידי הוספת נפח מספיק של פולי-L-ornithine מדולל פתרון (25 µg/mL) לצלחת תרבות תא, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
- וארוקן את פולי-L-ornithine ולשטוף את x 2 טוב עם PBS. להוסיף נפח מספיק של 5 µg/mL laminin לגמרי לכסות את פני השטח תרבות, דגירה ב 37 ° C עבור 2 ח' וביופסיה laminin לפני ציפוי תאים או לאחסן צלחת ב 4 ° C עד שהוא נדרש.
4. לזרום Cytometry Assay
הערה: הביטוי של סמנים ספציפית של NSCs, נוירונים ותאי גלייה נמדד על ידי לזרום cytometry assay13. הפרוטוקול מבוסס על מנון. et al.,13 עם שינויים מזעריים.
- מביצועם neurospheres או ניתוק NSCs בתרבית מ מצופה לוחות מאת trypsinization כדי להפוך אותם תאים בודדים. להוסיף 500 µL מאגר קיבעון (2% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS) 100 µL של התליה תא (בסביבות 1 מיליון תאים הם מספיק מכתים עם כל נוגדן) ולאחר מכן דגירה הצינורות-RT למשך 15 דקות.
- שטיפת התאים על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS שפופרת, צנטריפוגה-110 גרם x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא, עוזב כ 100 µL בצינור.
- Permeabilize תאים עם Tween-20 (0.7% Tween-20 ב- PBS) על-ידי הוספת µL 500 מאגר Tween-20 100 µL תא השעיה. דגירה הצינורות-RT למשך 15 דקות על שייקר מסלולית (100 סל"ד).
- חזור על צנטריפוגה וכן לשטוף את PBS. הסר את תגובת שיקוע הצינורות לחלוטין, משאיר רק בגדר מאחור. להוסיף 100 µL של נוגדנים העיקרי מדולל (ארנב אנטי עכבר βtub-III, GFAP, Nestin נוגדנים-ריכוז 1:200) דילול מאגר המכיל אלבומין פרה 1%, 10% סרום (נסיוב עז) ו- 0.5% Tween-20 ב- PBS ובעדינות triturate לערבב. דגירה הצינורות-RT במשך 30 דקות על תפקודי לב / נשימה.
- לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS ולהסיר את תגובת שיקוע הצינורות לחלוטין, משאיר רק בגדר מאחור.
- להוסיף 100 µL של נוגדנים משניים מדולל (עז אנטי ארנב FITC מצומדת-ריכוז שבערך) ב- PBS בגדר תא, בעדינות triturate לערבב. דגירה הצינורות-RT במשך 30 דקות על מטרף בחושך.
- לשטוף את הדגימות 2 x עם PBS, ואז לשטוף פעם אחת עם מאגר זרימה. צנטריפוגה, מחדש להשעות בתאים µL בכ 150 זרימה מאגר לניתוח cytometer זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח מיקרו, בידוד תא ותרבות Neurosphere. כאן, אנו הציג שיטה מהירה ויעילה העכבר E13 המוח למיקרו ובידוד של תאי גזע עצביים. מאמר זה מראה שזה אפשרי להסיר את כל המוח גולגולת העובר E העכבר13 דרך קרע בסדר ב פונטאנלה חזיתית. בשיטה זו, המוח מחזיקה מעמד פחות נזק, וזה אפשרי לבודד תאים מחלקים שונים של המוח. התאים שנקטפו יכול לייצר neurospheres במדיום לבטחון לאומי בנוכחות bFGF EGF, והם 150-200 µm גודל קוטר לאחר שבעה ימים בתרבות (איור 1 א'). Neurospheres היו הפומבית באמצעות 0.05% טריפסין/EDTA כדי להפוך אותם תאים בודדים ותרבותם על מנות Laminin/פוליפוני-L-Ornithine-מצופה בהיעדרו של bFGF ו EGF הראה כי הם להרחיב את neurite כמו ענפים ולהראות מורפולוגיה עצביים לאחר 7-10 ימים (איור 1B).
Assay Cytometry זרימה תוצאות. כפי שמוצג באיור 2A, 95±3.16% של תאים המהווים את neurospheres היו Nestin חיובי, אשר מהווה סמן ידוע עבור NSCs (איור 2 א). מבחני על תא בודד תרבותי NSCs באמצעות β-טובולין-III, נוגדנים GFAP חשף כי ע י טיפוח תאים על משטחים מצופים, להבדיל המירב NSCs ביותר הנוירונים (94±2.67%) ופחות אל תאי גליה (5±2.46%).
איור 1 : נציג תמונות מ- E הראשי13 עכבר תאי גזע עצביים העובר. א תרבותי neurospheres לאחר 7 ימים. B. התמיינות של תאי גזע עצביים להבשיל נוירונים לאחר 7 ימים תרבות על Laminin/פוליפוני-L-ornithine מצופה מנות לבטחון לאומי בינוני בהיעדרו של bFGF ו EGF. סרגלי קנה מידה מייצגים מיקרומטר 20 א', 50 מיקרומטר ב' אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : באוכלוסיות של תאים Nestin (א) βtubulin-III (B), GFAP (C) חיובי אומתו על ידי assay cytometry זרימה. א רוב התאים (95±3.16%) לבנות את neurospheres היו Nestin חיובי. B. Assay על דבק תרבותי NSCs על Laminin/פוליפוני-L-Ornithine מצופה לוחות בהיעדר EGF ו bFGF גילה כי % 94±3.67 של תאים היו βtubulin-III חיובי ו- 5±2.46% הביעו GFAP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היא מאוד חשוב עבור מדעני מוח בעזרת מקור מתאים של תאי גזע עצביים. תאי גזע עצביים יכול להיות שנקטפו מאזורים שונים במוח העובר, הם יכולים ליצור סוגים ספציפיים של נוירונים ותאי גלייה. ישנן מספר שיטות אינדוקציה של ההתמיינות של תאי גזע עצביים כדי לגרום להם לייצר נוירונים בוגרים ותאי גלייה. ישנם דיווחים רבים המעידים כי תחת תרבות מסוים התנאים גדודים גורם עם מחלות, הם יכולים לייצר נוירונים14oligodendrocytes להפוך15,16 , האסטרוציטים17במבחנה. בהתבסס על הנתונים מן הספרות, קדושתו ganglionic מספק מקור טוב של תאי גזע עצביים עם פוטנציאל ליצור סוגים שונים של נוירונים מעכבות, מעוררים כגון סוגי19 18 ודופאמין GABAergic. לכן, בהתבסס על הנטייה הטבעית של אלה NSCs לדור של שיעור גבוה יותר של נוירונים GABAergic, הם מספקים מקור מתאים ללימודים על הנוירונים מעכבות.
במאמר זה, שיפרנו את הטכניקה microdissection המוח כדי לפרוש את כל המוח הגולגולת העובר E העכבר13 בעת הפעלת פחות נזק לרקמת המוח. כדי לקבל את שיעור הגבוה ביותר של NSCs מהמוח בבעלי חיים, זה recommendable להפחית את משך הזמן כירורגי ולבצע את נקודות המפתח כגון טמפרטורת הסביבה בתנאים סטריליים.
ישנם כמה צעדים קריטיים עבור ביצועים מוצלחים של הליך זה. בעלי חיים ואם שלגדול חייב להיעשות מהר ככל האפשר, בתוך חדר נקי. השתמש אור UV לנקות את החדר לפני ניתוח, אם הם זמינים. כדי להפחית את הסיכון לזיהום, להעביר קרניים הרחם הצינור חרוט המכיל 25 מ של מאגר HEPES-מ קר וסגור את הכובע. אל תשתמש צלחת פטרי בשלב זה כפי שזה חסר כובע בורג. הצינור מסייעת למנוע זליגות בינוני הכיפה ומשרים מסייע הקרניים הרחם במאגר HEPES-מ. לשים את הרחם-הצינור מתחת למכסה המנוע למינריות לפני העברת את הרחם צלחת פטרי, לשטוף את הרחם לפחות 3 x עם מאגר HEPES-מ קר. שלב זה ביעילות מפחיתה את הסיכון של זיהום מיקרוביאלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון Royan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2 Unit2D.6 (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neuroscience. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
