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Neuroscience

अलगाव और भ्रूण माउस तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति

Published: November 11, 2018 doi: 10.3791/58874
Automatic Translation
1, 1,3, 1,3, 1,3, 1,2, 1,3, 1, 1
1Department of Cellular Biotechnology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Biotechnology, ACECR, 2Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, 3Department of Biology, ACECR Institute of Higher Education

Summary

यहां, हम ई13 माउस भ्रूण ganglionic उभार से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक उपंयास microsurgical तकनीक परिचय ।

Abstract

तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) multipotent है और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के तीन प्रमुख कोशिका प्रकार को जंम दे सकते हैं । इन विट्रो में संस्कृति और एनएससी के विस्तार neuroscientists के लिए कोशिकाओं का एक उपयुक्त स्रोत प्रदान करने के लिए न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के समारोह के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन. वयस्क या भ्रूण स्तनधारी दिमाग से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए कई तकनीक की सूचना दी । भ्रूण सीएनएस के विभिन्न क्षेत्रों से एनएससी को अलग करने के लिए microsurgical आपरेशन के दौरान, यह जीवित और विस्तार योग्य स्टेम कोशिकाओं के उच्चतम अनुपात प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क की कोशिकाओं को नुकसान को कम करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । माउस भ्रूण मस्तिष्क से इन कोशिकाओं के अलगाव के दौरान तनाव में कमी के लिए एक संभव तकनीक शल्य चिकित्सा समय की कमी है । यहां, हम ई13 माउस भ्रूण ganglionic उभार से इन कोशिकाओं के तेजी से अलगाव के लिए एक विकसित तकनीक का प्रदर्शन । सर्जिकल प्रक्रियाओं ई गर्भाशय से13 चूहे भ्रूण कटाई शामिल हैं, एक तुला सुई टिप के साथ भ्रूण के ललाट ब्रह्मारंध्र काटने, खोपड़ी से मस्तिष्क निकालने, अलग मस्तिष्क के microdissection ganglionic उभार फसल के लिए, पृथक्करण एक सेल निलंबन हासिल करने के लिए एनएससी माध्यम में काटा ऊतक के, और अंत में निलंबन संस्कृति में कोशिकाओं चढ़ाना neurospheres उत्पंन करने के लिए ।

Introduction

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) वयस्क और भ्रूण मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में रहते हैं और वे न्यूरॉन्स और glial सेल1के विभिन्न प्रकार उत्पन्न करने के लिए एक प्रवृत्ति है. subventricular जोन में वयस्क स्तनधारी ब्रेन2 और ganglionic उभार भ्रूण मस्तिष्क में एनएससी समृद्ध क्षेत्र3हैं । विकासशील मस्तिष्क में, ganglionic उभार cortical न्यूरॉन्स की सबसे अधिक बचाता है और विशेष रूप से GABAergic न्यूरॉन्स3. वहां भी कर रहे है कम इनवेसिव विधि भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) है कि पशु उपयोग के लिए मांग को कम से स्टेम कोशिका पीढ़ी के लिए । तथ्य यह है कि ESCs या iPSCs से एनएससी पैदा करने के बावजूद4संभव है,5, यह कुछ फायदे और नुकसान है तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव की तुलना में वयस्क या भ्रूण मस्तिष्क6,7से, 8. न्यूरॉन phenotypes की ओर ESCs और iPSCs के भेदभाव उत्प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल हमेशा समय और लागत लेने वाले हैं और सफलता की दर (70-80% Nestin सकारात्मक कोशिकाओं)5 पशु मस्तिष्क से एनएससी के प्रत्यक्ष अलगाव के साथ तुलना में कम है ( ९९% से अधिक Nestin धनात्मक कोशिकाएं)9. इसके अलावा, स्टेम सेल कई मार्ग10,11के बाद उनके आनुवंशिक स्थिरता और भेदभाव की प्रवृत्ति खो देते हैं । हालांकि वहां एनएससी में दैहिक कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रूपांतरण के बारे में अंय नई रिपोर्ट कर रहे हैं, इन कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से इंजीनियर है और हर12प्रयोगशाला में आसानी से सुलभ नहीं हैं । इसलिए, अभी भी पशु मस्तिष्क से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक बड़ी मांग है; यह शल्य चिकित्सा तकनीक में सुधार के द्वारा पशु उपयोग की मात्रा को कम करने के लिए संभव है । शल्य चिकित्सा समय को कम करने और तकनीक में सुधार करके, कोशिकाओं को नुकसान से दूर रखने के लिए और प्रत्येक जानवर से एनएससी की उच्चतम दर प्राप्त करने के लिए संभव है ।

यहां, हम माउस ई13 भ्रूण मस्तिष्क से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक सरलीकृत और reproducible तकनीक परिचय ।

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Protocol

पशु पर सभी सर्जरी और प्रक्रियाओं रोयन् संस्थान, तेहरान, ईरान की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. शल्य चिकित्सा उपकरणों की तैयारी, बफर (HEPES-मेम), सेल संस्कृति मीडिया और सेल संस्कृति प्लेटें धुलाई

  1. नित्य नसबंदी संबंधी दिशानिर्देशों के आधार पर उन्हें autoclaving करके सर्जिकल टूल्स (कैंची, स्केलपेल ब्लेड हैंडल और संदंश) को निष्फल करें.
  2. HEPES-मेम बफ़र (लगभग १०० मिलीलीटर प्रत्येक गर्भवती चूहों के लिए पर्याप्त है) की एक पर्याप्त मात्रा तैयार करें । HEPES-मेम बफर करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के उच्च सांद्रता (10% पेनिसिलिन/streptomycin) जोड़ें । एंटीबायोटिक दवाओं की इस एकाग्रता के लिए माइक्रोबियल संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए आवश्यक है ।
    1. HEPES-मेम बफर तैयार करने के लिए, HEPES पाउडर के ०.५९५८ g मेम (न्यूनतम आवश्यक माध्यम) के १०० मिलीलीटर के लिए जोड़ें, और अच्छी तरह से मिश्रण । 7.3-7.4 करने के लिए पीएच समायोजित करें और एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर मध्यम फिल्टर ।
  3. एनएससी मीडियम युक्त neurobasal मीडियम (एनबी), 20 एनजी/एमएल EGF के साथ पूरक बनाओ, 10 एनजी/एमएल bFGF, 1% 100x N2 अनुपूरक या 1% B27 अनुपूरक (विटामिन ए के बिना), 1 U/एमएल हेपरिन, 1% L-glutamine, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), 1% पेनिसिलिन/streptomycin, और ०.१ मिमी β-mercaptoethanol.

2. पशु शल्य चिकित्सा और सूक्ष्म विच्छेदन

  1. Anesthetize के 13वें दिन पर एक गर्भवती माउस (यहां, उपयोग बालब/सी तनाव आयु वर्ग 4 महीने) के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा ketamine-xylazine, १०० मिलीग्राम/किलोग्राम और 10 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन के अनुसार क्रमशः ।
    1. एक दर्दनाक उत्तेजना (जैसे, संदंश के साथ चुटकी) जानवर के पैर पर और जब कोई दर्द पलटा है, गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के द्वारा पशु बलिदान लागू करने के द्वारा गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि करें ।
  2. ७०% इथेनॉल का छिड़काव करके पेट की त्वचा को साफ और विसंक्रमित करें ।
  3. पेट के ऊपर त्वचा को नियंत्रित करें और फिर उदर गुहा और गर्भाशय सींग को उजागर करने के लिए कैंची के साथ त्वचा और अंतर्निहित प्रावरणी में कटौती ।
    1. गर्भाशय कैंची से भ्रूण युक्त सींग निकालें और उंहें एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब ठंड HEPES-मेम बफर के 25 मिलीलीटर युक्त में स्थानांतरण ।
    2. लामिना फ्लो हूड के तहत शंकु ट्यूब प्लेस और हुड के तहत टोपी खुला । गर्भाशय ट्यूब से बाहर सींग लाने के लिए और कुल्ला ताजा ठंड HEPES की पर्याप्त मात्रा के साथ 3 बार-मेम बफर मलबे और खून को खत्म करने के लिए ।
  4. एक 10 सेमी पेट्री शीत HEPES-मेम बफर की 7-10 मिलीलीटर युक्त पकवान को गर्भाशय ऊतक स्थानांतरण । ठीक कैंची और एक नई शीत HEPES-मेम बफर की 7-10 मिलीलीटर युक्त पकवान को हस्तांतरण भ्रूण का उपयोग कर गर्भाशय सींग खोलो । अब माइक्रो-विच्छेदन ऑपरेशन के लिए कीट नाशक माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण के साथ 10 सेमी डिश रखें ।
  5. एक इस्पात स्केलपेल ब्लेड संभाल पर अपनी नोक धक्का द्वारा एक 25-27 जी सिरिंज सुई की नोक मोड़ । सुई की नोक मोड़ जब तक टिप 70-90 ° के एक कोण पर आमादा है । सुई की नोक पर मोड़ देखने के लिए विदारक खुर्दबीन के नीचे सुई की नोक की जाँच करें ।
    नोट: स्वाभाविक रूप से, भ्रूण पकवान में एक पार्श्व स्थिति है ।
  6. उनकी स्थिति को बदलने के बिना, ठीक संदंश के साथ भ्रूण की गर्दन और शरीर पकड़ और फिर भ्रूण सिर के ललाट ब्रह्मारंध्र में सुई टिप के तुला हिस्सा डालें । वहां छोटे खून बह रहा है या एक खून का थक्का होगा ।
    1. सुई टिप सतही ले जाएं । जबकि तुला हिस्सा माथे की ओर उभार अंदर है और फिर सिर के पीछे की ओर, करने के लिए त्वचा और खोपड़ी के माध्यम से कटौती सुनिश्चित करें और अंतर्निहित मस्तिष्क को नुकसान नहीं है ।
    2. बाद में मस्तिष्क को उजागर करने के लिए सुई टिप के साथ त्वचा पुश और मस्तिष्क के नीचे क्षेत्र के लिए त्वचा के पार्श्व पक्ष से सुई डालें. इसे विच्छेदित खोपड़ी से बाहर आने के लिए धकेल कर खोपड़ी से मस्तिष्क को निकाल दें ।
    3. घुमावदार संदंश का उपयोग कर स्थिर मस्तिष्क पकड़ो और ganglionic उभार को बेनकाब करने के लिए माइक्रो कैंची का उपयोग कर प्रत्येक गोलार्द्ध के प्रांतस्था में कटौती.
    4. मस्तिष्क पकड़ो और 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में विच्छेदित ganglionic उभार जगह तंत्रिका स्टेम सेल मध्यम । ganglionic उभार स्पष्ट रूप से अपने मध्य और पार्श्व भागों के साथ दिखाया गया है ।
    5. इस कार्यविधि को तब तक दोहराएँ जब तक कि सभी दिमाग सूक्ष्म-विदारक हो चुके हों.
  7. ट्यूब के नीचे पिपेट टिप को रखकर विच्छेदित ganglionic उभार को काट लें । पिपेट निलंबन ऊपर और नीचे 4 से 5 बार एक एकल सेल निलंबन के लिए ऊतक को तोड़ने के लिए ।
    1. 5 मिनट के लिए ११० x g पर निलंबन केंद्रापसारक । supernatant को निकालें और ०.०५% trypsin-EDTA के 1 मिलीलीटर में कक्षों को पुन: निलंबित करें ।
    2. 10 मिनट के लिए एक ३७ ° c में सेल निलंबन की मशीन, और फिर trypsin गतिविधि को रोकने के लिए सोयाबीन trypsin अवरोधक (25 µ g/एमएल) के एक समकक्ष मात्रा में जोड़ें । trypsin को पूरी तरह से निष्क्रिय कर दिया गया है यह सुनिश्चित करने के लिए कक्ष निलंबन ऊपर और नीचे पिपेट ।
    3. 5 मिनट के लिए ११० x g पर सेल सस्पेंशन की शुरुआत करें । supernatant को हटा दें और कोशिकाओं को पूरी एनएससी मीडियम की 1 मिलीलीटर में फिर से सस्पेंड करें और कोशिकाओं की संख्या को गिनना ।
  8. एनएससी मीडियम में उपयुक्त आकार के टिशू कल्चर कुप्पी में कोशिकाओं (2x105 कोशिकाओं/ स्थानांतरण 5 मिलीलीटर से T25, 20 मिलीलीटर से T75 और ४० मिलीलीटर से T175 कुप्पी तक ।
    नोट: Neurospheres 5% CO2के साथ एक humidified मशीन में ३७ ° c में 3 दिनों संस्कृति के बाद दिखाई देगा । 6-7 दिनों के बाद, क्षेत्रों व्यास में 150-200 µm के बीच उपाय करना चाहिए और उपसंस्कृति के लिए तैयार हो जाएगा । की खेती करके १,०००,००० प्राथमिक एनएससी सात दिन बाद कक्षों की संख्या बढ़कर 3-4 करोड़ हो जाएगी.

3. Trypsinization और Passaging के Neurospheres

  1. neurospheres को उपसंस्कृति के लिए, निलंबित neurospheres के साथ मध्यम हस्तांतरण केंद्रापसारक ट्यूब के लिए, 5 मिनट के लिए ११० x g पर केंद्रापसारक और फिर supernatant त्यागें । 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ०.०५% trypsin-EDTA और मशीन की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    1. सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला और पिपेट का उपयोग कर trypsin को निष्क्रिय धीरे ऊपर और नीचे उन्हें एकल कोशिकाओं बनाने के लिए neurospheres.
  2. 5 मिनट के लिए ११० x g पर सेल सस्पेंशन के केंद्रापसारक, supernatant को त्यागें और एनएससी मीडियम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें । इन कोशिकाओं को अगले उपसंस्कृति या संस्कृति के लिए तैयार Laminin और पाली-एल Ornithine पर उंनत प्रयोगों के लिए लेपित सतहों रहे हैं ।
  3. अगले उपसंस्कृति के लिए, नई कुप्पी में एनएससी हस्तांतरण (२.८ कदम का पालन करें) और उंहें एनएससी के माध्यम में संस्कृति । Laminin और पाली-एल-Ornithine लेपित प्लेटों (आंकड़ा 1b) पर bFGF और EGF के अभाव में एनएससी के माध्यम में एनएससी विभेदक संस्कृति की प्रेरण ।
  4. कोटिंग प्रक्रिया के लिए, पूरी तरह से पतला पाली-L-ornithine समाधान (25 µ जी/एमएल) सेल संस्कृति प्लेट और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए गर्मी की पर्याप्त मात्रा जोड़ने के द्वारा सेल संस्कृति की सतह कोट ।
    1. महाप्राण पाली-L-ornithine और कुल्ला अच्छी तरह से पंजाबियों के साथ 2x । 5 µ g/mL laminin की पर्याप्त मात्रा को पूरी तरह से संस्कृति सतह क्षेत्र को कवर करने के लिए जोड़ें और 2 h. महाप्राण के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर laminin कोशिकाओं या स्टोर प्लेट चढ़ाना से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर जरूरत तक की मशीन ।

4. फ्लो Cytometry परख

नोट: एनएससी, ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं के विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति प्रवाह cytometry परख13से मापा जा सकता है । प्रोटोकॉल मेनन एट अलपर आधारित है,13 मामूली संशोधनों के साथ ।

  1. अलग कर देना neurospheres या अलग trypsinization द्वारा लेपित प्लेटों से संस्कृति एनएससी उंहें एकल कोशिकाओं बना । निर्धारण बफर के ५०० µ एल जोड़ें (2% paraformaldehyde (पीएफए) पंजाब में) के लिए १०० सेल निलंबन के µ एल (लगभग १,०००,००० कोशिकाओं को प्रत्येक एंटीबॉडी के साथ धुंधला के लिए पर्याप्त हैं), और फिर आरटी में 15 मिनट के लिए ट्यूब मशीन ।
  2. ट्यूब के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धोने और 5 मिनट के लिए ११० x g पर केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और सेल गोली resuspend, लगभग १०० µ एल ट्यूब में जा रहा है ।
    1. Permeabilize के बीच के साथ कोशिकाओं-20 (०.७% के बीच-पंजाब में 20) ५०० µ एल जोड़कर के बीच-20 बफर के १०० µ एल के लिए सेल निलंबन । एक कक्षीय शेखर (१०० rpm) पर 15 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब मशीन ।
  3. इस केंद्रापसारक और पंजाबियों धो दोहराएं । पूरी तरह से ट्यूबों से supernatant निकालें, केवल गोली पीछे जा रहा है । पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के १०० µ एल जोड़ें (खरगोश विरोधी माउस βtub-III, GFAP और 1:200 एकाग्रता में Nestin एंटीबॉडी) कमजोर पड़ने बफर में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, 10% सीरम (बकरी सीरम) और ०.५% के बीच-20 में पंजाब और धीरे triturate मिश्रण करने के लिए. एक कक्षीय शेखर पर 30 मिनट के लिए आर टी पर ट्यूब मशीन ।
  4. पंजाबियों के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें और ट्यूबों से supernatant को पूरी तरह से हटा दें, केवल गोली पीछे छोड़कर ।
    1. १०० µ पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के एल जोड़ें (बकरी विरोधी खरगोश FITC संयुग्मित में 1:500 एकाग्रता) पंजाब में सेल गोली करने के लिए और धीरे से triturate मिश्रण करने के लिए । 30 मिनट के लिए RT पर अंधेरे में एक शेखर पर ट्यूब मशीन ।
    2. पंजाब के साथ 2x नमूनों धो और फिर प्रवाह बफर के साथ एक बार धो लो । केंद्रापसारक और प्रवाह cytometer विश्लेषण के लिए प्रवाह बफर के लगभग १५० µ एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित ।

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Representative Results

सूक्ष्म विच्छेदन, कोशिका अलगाव और Neurosphere संस्कृति । यहां, हम माउस ई13 मस्तिष्क microsurgery और तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक तेजी से और कारगर तरीका प्रस्तुत किया । इस लेख से पता चलता है कि यह एक ई13 माउस से पूरे मस्तिष्क को दूर करने के लिए संभव है ललाट ब्रह्मारंध्र में एक ठीक टूटना के माध्यम से भ्रूण खोपड़ी । इस विधि के साथ, मस्तिष्क कम नुकसान सहना और यह मस्तिष्क के विभिन्न भागों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए संभव है. फसल की कोशिकाओं bFGF और EGF की उपस्थिति में एनएससी माध्यम में neurospheres उत्पन्न कर सकता है, और वे संस्कृति में सात दिनों के बाद व्यास में 150-200 µm आकार (चित्र 1a) कर रहे हैं । Neurospheres ०.०५% trypsin/EDTA का उपयोग कर उंहें एकल कोशिकाओं और Laminin पर उनकी संस्कृति बनाने के लिए असंबद्ध/पाली-एल Ornithine-लेपित व्यंजन bFGF और EGF के अभाव में पता चला कि वे शाखाओं की तरह neurite का विस्तार और 7-10 दिनों के बाद न्यूरॉन आकृति विज्ञान दिखा (चित्र 1b) ।

प्रवाह Cytometry परख परिणाम । जैसा कि चित्र 2aमें दिखाया गया है, neurospheres गठित करने वाली कोशिकाओं का 95 ± Nestin पॉजिटिव था, जो एनएससी (फिगर 2a) के लिए एक ज्ञात मार्कर है । एकल कोशिका पर परख एनएससी β-tubulin-III और GFAP एंटीबॉडी का उपयोग करके पता चला कि लेपित सतहों पर कोशिकाओं की खेती से, एनएससी के सबसे ंयूरॉंस के लिए सबसे अधिक अंतर होगा (94 ±) और glial कोशिकाओं को कम (5 ± 2.46%) ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्राथमिक ई13 से प्रतिनिधि छवियां माउस भ्रूण तंत्रिका स्टेम सेल । A. कल्चर्ड neurospheres 7 दिन बाद । B. bFGF और EGF के अभाव में एनएससी माध्यम में Laminin/पाली-एल-ornithine लेपित व्यंजन पर 7 दिनों के बाद न्यूरॉन्स के लिए तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अंतर । स्केल बार्स एक में 20 µm का प्रतिनिधित्व करते है और B. में ५० µm इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : Nestin की आबादी (क), βtubulin-III (ख), और GFAP (ग) सकारात्मक कोशिकाओं को प्रवाह cytometry परख द्वारा सत्यापित किया गया । A. कोशिकाओं के अधिकांश (95 ±) neurospheres का निर्माण Nestin सकारात्मक थे । Laminin/पाली-एल-Ornithine पर चिपकने वाला कल्चर्ड एनएससी पर बीएसए EGF और bFGF के अभाव में लेपित प्लेटों से पता चला कि 94 ± 4% कोशिकाओं के βtubulin-III सकारात्मक और 5 ± 2.46% GFAP व्यक्त किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के एक उपयुक्त स्रोत का उपयोग neuroscientists के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं भ्रूण मस्तिष्क के विभिंन क्षेत्रों से काटा जा सकता है और वे ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं के विशिष्ट प्रकार उत्पंन कर सकते हैं । वहां तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के प्रेरण के लिए कई तरीके है उंहें प्रेरित करने के लिए परिपक्व ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं उत्पंन करते हैं । ऐसे कई रिपोर्टों का संकेत है कि विशिष्ट संस्कृति की स्थिति और पौष्टिकता कारक रेजिमेंटों के तहत, वे ंयूरॉंस में14, oligodendrocytes15,16 , और astrocytes17इन विट्रोउत्पंन कर सकता है । साहित्य के आंकड़ों के आधार पर, ganglionic उभार इस तरह के GABAergic18 और dopaminergic19 प्रकार के रूप में निरोधात्मक और उत्तेजक न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार के उत्पन्न करने की क्षमता के साथ तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का एक अच्छा स्रोत प्रदान करता है. इसलिए, GABAergic न्यूरॉन्स की उच्च दर के उत्पादन के लिए इन एनएससी की प्राकृतिक प्रवृत्ति के आधार पर, वे निरोधात्मक न्यूरॉन्स पर अध्ययन के लिए एक उपयुक्त स्रोत प्रदान करते हैं.

इस लेख में, हम मस्तिष्क microdissection तकनीक में सुधार के लिए ई13 माउस भ्रूण खोपड़ी से पूरे मस्तिष्क को वापस लेने, जबकि मस्तिष्क के ऊतकों को कम नुकसान डालती । पशु मस्तिष्क से एनएससी की उच्चतम दर प्राप्त करने के लिए, यह शल्य चिकित्सा समय की अवधि को कम करने और ऐसे परिवेश तापमान और बाँझ शर्तों के रूप में महत्वपूर्ण बिंदुओं को निष्पादित करने के लिए सिफारिश की है.

इस कार्यविधि के सफल प्रदर्शन के लिए कुछ महत्वपूर्ण चरण हैं । पशु शल्य चिकित्सा और गर्भाशय विच्छेदन जितना जल्दी हो सके और एक साफ कमरे में किया जाना चाहिए । यदि उपलब्ध हो तो सर्जरी से पहले कमरे को साफ करने के लिए यूवी लाइट का प्रयोग करें । प्रदूषित जोखिम को कम करने के लिए, शंकु ट्यूब ठंड HEPES-मेम बफर के 25 मिलीलीटर युक्त और टोपी बंद करने के लिए गर्भाशय सींग हस्तांतरण । इस स्टेप में एक पेट्री डिश का इस्तेमाल न करें क्योंकि इसमें स्क्रू कैप का अभाव होता है । ट्यूब टोपी से मध्यम रिसाव से बचने में मदद करता है और HEPES-मेम बफर में गर्भाशय सींग सोख में मदद करता है । लामिना हूड के तहत गर्भाशय ट्यूब रखो और एक पेट्री डिश के लिए गर्भाशय के हस्तांतरण से पहले, कुल्ला गर्भाशय ठंडा HEPES-मेम बफर के साथ कम से 3x । यह कदम प्रभावी रूप से माइक्रोबियल संक्रमण के जोखिम को कम कर देता है ।

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Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

इस काम को रोयन् इंस्टीट्यूट ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tubes Falcon 352097
50 mL tubes Falcon 352235
Adson Forceps, 12 cm, Straight WPI 14226
B27 Gibco 17504-44
bFGF Sigma F0291
bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153
dish 10cm  Falcon 353003
Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight WPI 15908
Dumont Tweezers, 11 cm, Straight WPI 500342
EGF Sigma E9644
Ethanol Merck 100983 
Glutamate Sigma  G3291
Glutamax Gibco 35050061
goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody Sigma AP307F
goat serum Sigma G9023
Heparin   Sigma h3149
HEPES Sigma 83264
HEPES Sigma 90909C
insulinsyringe with 25-27 gauge Needle  SUPA medical A1SNL127
laminin sigma    L2020
MEM Sigma M2279
N2 supplement Gibco 17502048
NB medium Gibco 21103-31
Non-essential amino acid (NEAA) Gibco 11140050
PBS without Ca and Mg Gibco 20012050
Penicilin/ Streptomycin Gibco 5140122
Poly-L-ornithine Sigma  P4957
rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody Sigma T2200
rabbit anti mouse GFAP antibody Sigma G4546
rabbit anti mouse Nestin antibody Sigma N5413
Scalpel Handle #3 WPI 500236
Scissors curve WPI 14396
Scissors sharp straight WPI 14192
Soybean trypsin inhibitor Roche 10109886001 
Tissue culture flasks, T25 BD 353014
Tissue culture flasks, T75 BD 353024
Tween 20 Sigma P1379
Vannas Scissors,  8 cm, Straight  WPI 14003
β-mercaptoethanol Sigma M6250

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References

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