Summary
여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.
Abstract
신경 줄기 세포 (NSCs) multipotent 이며 중앙 신경 시스템 (CNS)의 세 가지 주요 셀 형식을 야기할 수 있습니다. 생체 외에서 문화 및 확장 NSCs의 신경의 기능을 연구 하는 신경에 대 한 셀 및 그들의 상호 작용을 함께 glial 세포의 적당 한 소스를 제공 합니다. 성인 또는 배아 포유류 두뇌에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 몇 가지 보고 된 기술이 있다. NSCs 배아 CNS의 다른 지구에서 격리를 microsurgical 동안, 라이브 및 확장 가능한 줄기 세포의 가장 높은 비율을 얻기 위해 뇌 세포에 피해를 줄이기 위해 매우 중요 하다. 쥐 태아의 뇌에서이 세포의 고립 동안 스트레스 감소를 위한 가능한 방법은 수술 시간의 감소입니다. 여기, 우리 E13 마우스 배아 절 예 하에서 이러한 셀의 빠른 격리 개발된 기술을 보여 줍니다. 수술 절차 포함 절단 정면 온 두개골, 수확 절 예 하 고립 된 두뇌의 기정에서에서 두뇌를 추출 구부러진된 바늘 팁, 태아의 자 궁에서 E13 마우스 배아를 수확 단일 셀 서 스 펜 션을 얻기 위해 NSC 매체에 수확된 조직 그리고 마지막으로 neurospheres를 생성 하기 위해 현 탁 액 문화에서 도금 셀의 분리.
Introduction
신경 줄기 세포 (NSCs) 성인과 태아 두뇌의 다른 지역에 있으며 그들은 신경 그리고 glial 세포1의 다른 종류를 생성 하는 경향이 있다. 2 성인 포유류 두뇌 subventricular 영역 및 태아 두뇌에 예 절 하는 NSC 풍부한 지역3. 개발 두뇌 절 예 하는 대뇌 피 질의 수 및 특히 GABAergic 수3의 대부분을 제공합니다. 또한 더 적은 침략 적 방법이 있다 미 발달 줄기 세포 (ESCs)에서 신경 줄기 세포 생성에 대 한 또는 동물에 대 한 수요 감소 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 사용. ESCs 또는 Ipsc NSCs를 생성 하는 것이 가능한4,5는 사실에도 불구 하 고 그것은 몇 가지 장단점이 성인 또는 태아 뇌6,7, 신경 줄기 세포의 분리에 비해 8. ESCs와 신경 고기 향해 Ipsc의 분화 유도 대 한 프로토콜은 항상 시간과 비용을 소모 하 고 성공 (70-80 %Nestin 양성 세포)5 속도 낮은 동물 뇌 (NSCs의 직접 절연 비교 이상 99 %Nestin 양성 세포)9. 또한, 줄기 세포는 여러 구절10,11후 그들의 유전적 안정성과 차별화 추세를 잃게됩니다. 비록 NSCs로 체세포의 직접 변환에 대 한 다른 새로운 보고서는,이 세포 유전자 조작 하 고 모든 랩12에 쉽게 액세스할 수 있습니다. 따라서, 거기는 여전히; 동물 뇌에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 큰 수요가 그것은 수술 기법을 개선 하 여 동물 사용의 수량을 줄일 수 있습니다. 수술 시간을 단축 하 고 기술을 개선, 그것은 손상에서 세포를 유지 하 고 각 동물에서 NSCs의 가장 높은 속도 얻을 수 있습니다.
여기, 우리는 마우스 E13 태아 뇌에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 단순 하 고 재현할 수 기법을 소개합니다.
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Protocol
모든 수술과 동물에 대 한 절차로 양 연구소, 테헤란, 이란 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 버퍼 (HEPES-MEM), 세포 배양 및 세포 배양 배지를 세척 하는 수술 기구 준비
- 압력가 마로 소독 그들 일상적인 소독 지침에 기반 하 여 수술 도구 (가 위, 메스 블레이드 핸들 및 집게)을 소독.
- HEPES 메모리 버퍼의 적절 한 볼륨을 준비 (약 100 mL 각 임신 쥐에 대 한 충분 하다). HEPES 메모리 버퍼에 항생제 (10% 페니실린/스)의 높은 농도 추가 합니다. 항생제의이 농도 미생물 오염의 위험을 줄이기 위해 필요 합니다.
- HEPES 메모리 버퍼를 준비 하려면 메모리 (최소 필수 매체), 100 mL를 HEPES 분말의 0.5958 g을 추가 하 고 잘 섞으십시오. 7.3-7.4에 pH를 조정 하 고 매체 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링.
- NSC 중간 포함 neurobasal 매체 (NB) 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 보충 1 %100 x N2 보충 또는 1 %B27 보충 (비타민 A) 없이 1 U/mL 헤 파 린, 1%, L-글루타민, 1% 비 필수 아미노산 (NEAA), 1% 페니실린/스, 그리고 0.1 m m β-mercaptoethanol입니다.
2. 동물 수술과 마이크로 해 부
- 임신의 13번째 날에 임신 마우스 anesthetize (여기, 사용 BALB/c 스트레인 세 4 개월) 케 타 민-xylazine의 복 주입, 100 mg/kg, 10mg/kg으로 체중 각각.
- 동물의 발에 고통 스러운 자극 (예를 들어, 집게와 핀치)을 발휘 하 여 깊은 마 취를 확인 하 고 아무 통증 반사 때 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 희생.
- 깨끗 하 고 살 균 70% 에탄올을 분사 하 여 복 부의 피부.
- 복 부에 피부를 제어 하 고 피부와 기본 근 복 강 및 자 궁 뿔 밝히기에 위로 잘라.
- 배아를 포함 하는 위, 자 궁 뿔을 제거 하 고 차가운 HEPES 메모리 버퍼의 25 mL를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브로 그들을 전송.
- 층 류 흐름 후드 원뿔 튜브를 배치 하 고 후드 뚜껑을 열고. 튜브 및 린스 3 번 충분 한 양의 파편과 혈액을 제거 하는 신선한 감기 HEPES 메모리 버퍼에서 밖으로 자 궁 뿔을가지고.
- 10 cm 배양 접시 찬 HEPES 메모리 버퍼의 7-10 mL를 포함 하는 자 궁 조직을 전송 합니다. 자 궁 뿔 찬 HEPES 메모리 버퍼의 7-10 mL를 포함 하는 새로운 요리를 좋은 위 및 배아를 사용 하 여 엽니다. 이제 마이크로 해 부 작업에 대 한 해 현미경 배아와 10 cm 접시를 넣어.
- 강철 메스 블레이드 핸들에 팁을 추진 하 여 25-27 G 주사기 바늘의 끝을 구 부. 팁은 70-90 °의 각도에서 구 부 러 때까지 바늘의 끝을 구 부. 바늘의 끝에 벤드를 보고 해 현미경 바늘의 팁을 확인 하십시오.
참고: 자연스럽 게, 배아는 접시에 측면 위치가 있다. - 그들의 위치를 변경 하지 않고 태아의 몸과 목 좋은 집게로 누른 다음 태아 머리의 정면 온 바늘 팁의 구부러진된 부분을 삽입 합니다. 작은 출혈 또는 혈 병 거기 있을 것 이라고.
- 바늘 끝으로 이동 합니다. 볼록한이 마 쪽으로 그리고 머리의 뒤쪽 내부 구부러진된 부분을 실행 하는 동안 피부와 두개골을 극복 하 고 기본 두뇌를 손상 하지 않는 있는지 확인 하십시오.
- 두뇌를 폭로 하 고 뇌 아래 지역에 피부의 측면 쪽에서 바늘을 삽입을 옆으로 바늘 끝으로 피부를 밀어. 해 부 두개골에서 나와 그것을 추진 하 여 두개골에서 뇌를 제거 합니다.
- 두뇌 꾸준한 곡선된 겸 자 사용 하 고 마이크로-가 위를 사용 하 여 노출 절 예 하 각 반구의 피 질을 잘라.
- 두뇌를 보유 하 고 신경 줄기 세포 매체를 포함 하는 15 mL 원심 분리기 관으로 해 부 절 예 하 장소. 절 예 하 그것의 중간과 옆 부분과 명확 하 게 표시 됩니다.
- 이 절차를 반복 하 여 모든 두뇌 마이크로 해 부 했습니다.
- 튜브의 하단에 대 한 피 펫 팁을 배치 하 여 해 부 절 예를 잘라. 서 스 펜 션 4 ~ 5 배는 단일 세포 현 탁 액에 대 한 조직 헤어 위아래로 플라스틱
- 원심에서 110 x g 5 분 제거에 대 한 정지는 상쾌한 고 다시 0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL에 셀을 일시 중단.
- 10 분 동안 37 ° C에 세포 현 탁 액을 품 어 고 트립 신 활동 중지 콩 트립 신 억제제 (25 µ g/mL)의 해당 볼륨을 추가 합니다. 아래로 트립 신이 완전히 활성화 되었는지 확인에 세포 현 탁 액 플라스틱
- 5 분은 상쾌한 제거를 다시 완전 한 NSC 매체의 1 mL에 셀을 일시 중단 하 고 셀의 수를 계산에 대 한 110 x g에 세포 현 탁 액을 원심.
- 적당 한 크기 조직 배양 플라스 크에 NSC 매체에서 세포 (2 x 105 셀/mL) 접시. 5 mL 전송 T25, T75 및 T175 플라스 크를 40 mL 20 mL.
참고: Neurospheres 5% CO2습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 3 일 문화 후 표시 됩니다. 6-7 일 후 구체 150-200 µ m 직경에서을 측정 해야 하 고 서브 컬쳐에 대 한 준비가 될 것입니다. 7 일 후 1 백만 주 NSCs를 배양 하 여 셀의 수는 3-4 백만에 증가 합니다.
3. trypsinization 및 Neurospheres의 뿌리고
- 하위는 neurospheres, 하려면 원심 분리기 튜브에 일시 neurospheres와 매체를 전송 하 고 5 분 동안 110 x g에서 원심는 상쾌한 다음 삭제 합니다. 0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 부드럽게 최대 콩 트립 신 억제 물 및 피 펫은 neurospheres 사용 하 여 트립 신을 비활성화 하 고 확인까지 그들 단일 셀.
- 110 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심는 상쾌한 삭제 하 고 다시 NSC 매체의 1 mL에 셀을 일시 중단. 이 세포는 다음 하위 또는 Laminin에 문화에 대 한 준비와 폴 리-L-Ornithine 코팅 고급 실험에 대 한 표면.
- 다음 subculture에 대 한 새로운 플라스 크 (수행 단계 2.8)에 NSCs를 전송 하 고 NSC 매체에 문화. 신경 감 별 법 문화 NSCs bFGF와 폴 리-L-Ornithine Laminin에 EGF의 부재에서 NSC 매체에서의 유도 대 한 코팅 판 (그림 1B).
- 코팅 절차 완전 셀 문화 접시에 충분 한 양의 희석된 폴 리-L-ornithine 솔루션 (25 µ g/mL)를 추가 하 여 셀 문화 표면 코트이 고 2 h 37 ° C에서 품 어.
- 폴 리-L-ornithine 발음 하 고 PBS 가진 잘 2 x 린스. 완전히 문화 표면 영역을 커버 하 고 셀을 도금 하기 전에 2 h. Aspirate는 laminin에 대 한 37 ° C에서 품 어 또는 접시 필요할 때까지 4 ° C에서 저장 5 µ g/mL laminin의 충분 한 볼륨을 추가 합니다.
4. 교류 Cytometry 분석 결과
참고: NSCs, 신경 그리고 glial 세포의 특정 마커 표현의 교류 cytometry 분석 결과13측정할 수 있습니다. 프로토콜 메 논 외.를 사소한 수정13 을 기반으로 합니다.
- 해리 neurospheres 또는 코팅된 접시에서 교양된 NSCs trypsinization 그들 단일 세포를 분리. 고정 버퍼 (2 %paraformaldehyde (PFA) PBS에)의 500 µ L의 세포 현 탁 액 (약 1 백만 셀은 충분히 얼룩에 대 한 각 항 체와 함께), 100 µ L을 추가 하 고 15 분 동안 RT에 튜브를 품 어.
- 워시 튜브를 5 분에 대 한 110 x g에서 원심 분리기 1 mL의 PBS 추가 하 여 셀 삭제는 상쾌한 고 튜브에 약 100 µ L를 떠나 셀 펠 릿 resuspend.
- 트윈-20 세포를 permeabilize (0.7 %PBS 트윈-20) 세포 현 탁 액의 100 µ L에 트윈 20 버퍼의 500 µ L을 추가 하 여. 궤도 셰이 커 (100 rpm)에 15 분 동안 RT에 튜브를 품 어.
- 원심 분리와 PBS 세척을 반복 합니다. 제거는 상쾌한 튜브에서 완전히, 펠 릿만을 남겨두고. 100 µ L 희석된 주 항 체 (안티 마우스 βtub III, GFAP와 1: 200 농도에서 항 체 Nestin 토끼)의 1% 소 혈 청 알 부 민, 혈 청 10% (염소 혈 청) 및 0.5%를 포함 하는 희석 버퍼에 추가 트윈-20 PBS와 부드럽게 혼합 triturate. 궤도 통에 30 분 동안 RT에 튜브를 품 어.
- PBS 한번 셀을 세척 하 고는 상쾌한 튜브에서 완전히 제거, 펠 릿만을 남겨두고.
- 100 µ L 희석된 이차 항 체의 추가 (안티 염소 토끼 FITC 활용 1: 500 농도에) PBS 셀 펠 릿을 부드럽게 혼합 하 triturate. 어둠 속에서 통에 30 분 동안 RT에 튜브를 품 어.
- 워시 샘플 2 x PBS와 흐름 버퍼를 한번 누른 다음 씻어. 원심 및 다시 교류 cytometer 분석 흐름 버퍼의 약 150 µ L에서 세포를 일시 중지.
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Representative Results
마이크로 해 부, 셀 고립과 Neurosphere 문화. 여기, 우리는 마우스 E13 뇌 미세 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 신속 하 고 효율적인 방법을 제시. 이 문서는 정면 온에 잘 파열을 통해 E13 마우스 배아 두개골에서 전체 뇌를 제거 하는 것을 보여줍니다. 이 방법으로 뇌 영 덜 손상 그리고 두뇌의 다른 부분에서 세포를 분리 가능 합니다. 수확된 셀 NSC 매체 bFGF와 EGF, 존재에 neurospheres를 생성할 수 있으며 그들은 직경에서 150-200 µ m 크기 문화 (그림 1A)에서 7 일 후. Neurospheres는 사용 하 여 0.05 %trypsin / EDTA 그들 Laminin/폴 리-L-Ornithine-코팅 요리에 그들의 문화와 단일 세포 그들은 나뭇가지 처럼 neurite 연장 하 고 7-10 일 후 신경 형태를 표시 하는 EGF와 bFGF의 부재에서 해리 했다 (그림 1B)입니다.
교류 Cytometry 분석 결과 결과. 그림 2A같이 neurospheres를 구성 하는 세포의 95±3.16%는 NSCs (그림 2A)에 대 한 알려진된 마커는 긍정적인을 Nestin 했다. 단일 셀에 분석 실험 경작 NSCs β-tubulin-III를 사용 하 여 및 GFAP 항 체 코팅된 표면에 세포를 배양 하 여는 NSCs의 대부분은 신경 (94±2.67%)에 가장 차별화 밝혀 glial 세포 (5±2.46%)을 덜.
그림 1 : 기본 E13 에서 대표 이미지 배아 신경 줄기 세포를 마우스. A. 7 일 후 neurospheres 경작. B. Laminin/폴 리-L-ornithine에 7 일 문화 후 성숙한 뉴런 신경 줄기 세포의 분화 코팅 bFGF와 EGF의 부재에서 NSC 매체에 요리. 스케일 바 대표 a에서 20 µ m, 50 µ m b에서 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Nestin (A), (B), βtubulin-III 그리고 GFAP (C) 긍정적인 세포의 인구 흐름 cytometry 분석 결과 의해 확인 되었다. A. 셀 (95±3.16%)의 대부분은 neurospheres 건설 긍정적인 Nestin 했다. B. EGF의 부재에서 Laminin/폴 리-L-Ornithine 코팅 접시에 접착제에 분석 결과 교양 NSCs와 bFGF 밝혀 그 세포의 94±3.67% βtubulin III 양수와 5±2.46 %GFAP 표현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
신경 줄기 세포의 적합 한 소스를 사용 하 여 하는 것은 신경에 대 한 매우 중요 합니다. 신경 줄기 세포는 태아 두뇌의 다른 지역에서 수확 될 수 그리고 그들은 신경 그리고 glial 세포의 특정 유형을 생성할 수 있습니다. 성숙한 신경 그리고 glial 세포를 생성 하도록 유도 하는 신경 줄기 세포의 분화의 유도 대 한 몇 가지 방법이 있다. 수많은 보고서를 나타내는 특정 문화권 조건과 영양 요소 연대에서 그들은 신경14, oligodendrocytes15,16 및 이다17체 외에을 생성할 수 있다. 문학에서 데이터에 따라, 예 절 하 억제 및 흥분 성의 뉴런 GABAergic18 와 dopaminergic19 종류 등의 다른 형식을 생성할 가능성이 신경 줄기 세포의 좋은 소스를 제공 합니다. 따라서 그들은 억제 하는 신경에 대 한 연구에 대 한 적합 한 소스를 제공 GABAergic 신경 세포의 생성에 대 한 이러한 NSCs의 자연적인 경향에 따라.
이 문서에서는, 우리는 뇌 서 기술을 발휘 하는 뇌 조직에 손상을 줄일 동안 E13 마우스 배아 두개골에서 전체 뇌를 철회 하 개선. 동물의 뇌에서 NSCs의 최고 속도를, 그것은 수술 시간의 시간을 단축 하 여 실행 주위 온도 멸 균 조건 등 핵심 포인트 추천.
이 절차의 성공적인 성능에 대 한 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 가능한 한 빨리 하 고 깨끗 한 객실에 동물 수술과 자 궁 해 부를 수행 합니다. 자외선을 사용 하 여 가능한 경우 수술 전에 방을 청소. 오염 위험을 줄이기 위해, 차가운 HEPES 메모리 버퍼의 25 mL를 포함 하는 원뿔 튜브를 자 궁 뿔을 전송 하 고 뚜껑을 닫습니다. 나사 모자 부족으로이 단계에서 배양 접시를 사용 하지 마십시오. 튜브 캡에서 중간 누설을 방지할 수 고 도움이 HEPES 메모리 버퍼에서 자 궁 뿔을 만끽해 보세요. 자 궁-튜브 층 류 후드와 페 트리 접시에는 자 궁을 전송 하기 전에, 차가운 HEPES 메모리 버퍼와 자 궁 이상 3 x 린스. 이 단계는 효과적으로 미생물 오염의 위험을 줄일 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
이 작품은로 양 연구소에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
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