Her introduserer vi en Mikrokirurgiske teknikken for isolering av nevrale stamceller fra E13 musen fosteret ganglionic eminense.
Nevrale stamceller (NSCs) er multipotent og kan gi opphav til de tre store celle typene sentralnervesystemet (CNS). In vitro kultur og utvidelse av NSCs gi en passende kilde celler for nevrologer å studere funksjon av nevroner og gliacellene sammen med deres samspill. Det finnes flere rapporterte teknikker for isolering av nevrale stamceller fra voksen og embryo pattedyr hjerner. Under Mikrokirurgiske operasjonen isolere NSCs fra forskjellige regioner i embryonale CNS, er det svært viktig å redusere skade på hjernen celler å få den høyeste forholdet mellom live og utvidbart stamceller. En mulig teknikk for stress reduksjon under isolasjon av disse cellene fra musen embryoet hjernen er reduksjonen av kirurgiske tid. Her viser vi en utviklet teknikk for rask isolering av disse cellene fra E13 musen fosteret ganglionic eminense. Kirurgiske prosedyrer inkluderer høsting E13 mouse embryoer fra livmoren, kutte den frontal fontanelle av embryoet med en bøyd pinne-spissen, utpakking hjernen i skallen, microdissection av isolerte hjernen å høste ganglionic eminense, dissosiasjon høstet vevet i NSC medium for å få en enkeltcelle suspensjon, og til slutt plating celler i suspensjon kultur for å generere neurospheres.
Nevrale stamceller (NSCs) ligger i forskjellige områder av voksen og embryo hjernen og de har en tendens til å generere ulike typer nerveceller og glial celle1. Subventricular soner i voksen pattedyr hjernen2 og ganglionic anseelse i fosteret hjernen er NSC rike regioner3. I utvikle hjernen leverer ganglionic eminense de fleste kortikale interneurons og spesielt GABAergic interneurons3. Det er også mindre invasive metoder for nevrale stamceller generasjon fra embryonale stamceller (ESCs) eller indusert pluripotent stamceller (iPSCs) som reduserer behovet for dyr bruk. Til tross for at genererer NSCs fra ESCs eller iPSCs er mulig4,5, har den noen fordeler og ulemper sammenlignet med isolering av nevrale stamceller fra voksen og embryo hjernen6,7, 8. Protokollene for inducing differensiering av ESCs og iPSCs mot neuronal fenotyper er alltid tid og kostnader forbruker og frekvensen av suksess (70-80% Nestin positive celler)5 er lavere sammenlignet med direkte isolering av NSCs fra dyr hjernen ( mer enn 99% Nestin positive celler)9. Videre miste stamceller deres genetisk stabilitet og differensiering tendens etter flere avsnitt10,11. Selv om det er andre nye rapporter om direkte konvertering av somatiske celler i NSCs, disse cellene er genmodifisert og er ikke lett tilgjengelig i hver lab12. Derfor er det fortsatt et stort behov for isolering av nevrale stamceller fra dyr hjernen; Det er mulig å redusere antall dyr behandling ved å forbedre kirurgiske teknikker. Reduserer kirurgiske og forbedre teknikkene, er det mulig å holde celler fra skade og få den høyeste frekvensen av NSCs fra hvert dyr.
Her introduserer vi en forenklet og reproduserbar teknikk for isolering av nevrale stamceller fra mus E13 embryoet hjerne.
Bruke en egnet kilde av nevrale stamceller er svært viktig for neuroscientists. Nevrale stamceller kan høstes fra ulike områder av embryoet hjernen og de kan generere bestemte typer nerveceller og gliacellene. Det finnes flere metoder for induksjon av nevrale stamceller å overtale dem til å generere modne nevroner og gliacellene. Det er mange rapporter indikerer at under bestemte kultur forhold og trophic faktor regimenter, de kunne generere neurons14, oligodendrocytes15</su…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Royan Institute.
15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
B27 | Gibco | 17504-44 | |
bFGF | Sigma | F0291 | |
bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
dish 10cm | Falcon | 353003 | |
Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
EGF | Sigma | E9644 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Glutamate | Sigma | G3291 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | |
goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
goat serum | Sigma | G9023 | |
Heparin | Sigma | h3149 | |
HEPES | Sigma | 83264 | |
HEPES | Sigma | 90909C | |
insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
laminin | sigma | L2020 | |
MEM | Sigma | M2279 | |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
NB medium | Gibco | 21103-31 | |
Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
Scissors curve | WPI | 14396 | |
Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
Tween 20 | Sigma | P1379 | |
Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |