Summary
Her introduserer vi en Mikrokirurgiske teknikken for isolering av nevrale stamceller fra E13 musen fosteret ganglionic eminense.
Abstract
Nevrale stamceller (NSCs) er multipotent og kan gi opphav til de tre store celle typene sentralnervesystemet (CNS). In vitro kultur og utvidelse av NSCs gi en passende kilde celler for nevrologer å studere funksjon av nevroner og gliacellene sammen med deres samspill. Det finnes flere rapporterte teknikker for isolering av nevrale stamceller fra voksen og embryo pattedyr hjerner. Under Mikrokirurgiske operasjonen isolere NSCs fra forskjellige regioner i embryonale CNS, er det svært viktig å redusere skade på hjernen celler å få den høyeste forholdet mellom live og utvidbart stamceller. En mulig teknikk for stress reduksjon under isolasjon av disse cellene fra musen embryoet hjernen er reduksjonen av kirurgiske tid. Her viser vi en utviklet teknikk for rask isolering av disse cellene fra E13 musen fosteret ganglionic eminense. Kirurgiske prosedyrer inkluderer høsting E13 mouse embryoer fra livmoren, kutte den frontal fontanelle av embryoet med en bøyd pinne-spissen, utpakking hjernen i skallen, microdissection av isolerte hjernen å høste ganglionic eminense, dissosiasjon høstet vevet i NSC medium for å få en enkeltcelle suspensjon, og til slutt plating celler i suspensjon kultur for å generere neurospheres.
Introduction
Nevrale stamceller (NSCs) ligger i forskjellige områder av voksen og embryo hjernen og de har en tendens til å generere ulike typer nerveceller og glial celle1. Subventricular soner i voksen pattedyr hjernen2 og ganglionic anseelse i fosteret hjernen er NSC rike regioner3. I utvikle hjernen leverer ganglionic eminense de fleste kortikale interneurons og spesielt GABAergic interneurons3. Det er også mindre invasive metoder for nevrale stamceller generasjon fra embryonale stamceller (ESCs) eller indusert pluripotent stamceller (iPSCs) som reduserer behovet for dyr bruk. Til tross for at genererer NSCs fra ESCs eller iPSCs er mulig4,5, har den noen fordeler og ulemper sammenlignet med isolering av nevrale stamceller fra voksen og embryo hjernen6,7, 8. Protokollene for inducing differensiering av ESCs og iPSCs mot neuronal fenotyper er alltid tid og kostnader forbruker og frekvensen av suksess (70-80% Nestin positive celler)5 er lavere sammenlignet med direkte isolering av NSCs fra dyr hjernen ( mer enn 99% Nestin positive celler)9. Videre miste stamceller deres genetisk stabilitet og differensiering tendens etter flere avsnitt10,11. Selv om det er andre nye rapporter om direkte konvertering av somatiske celler i NSCs, disse cellene er genmodifisert og er ikke lett tilgjengelig i hver lab12. Derfor er det fortsatt et stort behov for isolering av nevrale stamceller fra dyr hjernen; Det er mulig å redusere antall dyr behandling ved å forbedre kirurgiske teknikker. Reduserer kirurgiske og forbedre teknikkene, er det mulig å holde celler fra skade og få den høyeste frekvensen av NSCs fra hvert dyr.
Her introduserer vi en forenklet og reproduserbar teknikk for isolering av nevrale stamceller fra mus E13 embryoet hjerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle operasjoner og prosedyrer på dyr ble godkjent av dyreetikk av Royan Institute, Sveits.
1. forberedelse av kirurgiske instrumenter, vaske bufferen (HEPES-MEM), celle kultur medier og celle kultur plater
- Sterilisere kirurgiske verktøy (saks, skalpell blad håndtere og tang) av autoklavering dem basert på rutinemessig sterilisering retningslinjene.
- Forberede en tilstrekkelig mengde HEPES-MEM buffer (rundt 100 mL er nok for hver gravid mus). Legge til høye konsentrasjoner av antibiotika (10% penicillin/streptomycin) HEPES-MEM bufferen. Denne konsentrasjonen av antibiotika er nødvendig å redusere risikoen for mikrobiell forurensning.
- For å forberede HEPES-MEM buffer, legger 0.5958 g HEPES pulver til 100 mL MEM (minst viktig middels) og bland godt. Justere pH 7.3-7,4 og filtrere mediet bruker filtere 0.22 µm.
- Gjøre NSC middels inneholder neurobasal medium (NB), supplert med 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% 100 x N2 supplement eller 1% B27 supplement (uten vitamin A), 1 U/mL Heparin, 1% L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyren (NEAA), 1% Penicillin/streptomycin, og 0,1 mM β-mercaptoethanol.
2. dyr kirurgi og mikro-disseksjon
- Bedøve gravid mus 13th dag av svangerskapet (her, bruk BALB/c belastning år 4 måneder) ved intraperitoneal injeksjon av ketamin-xylazine, 100 mg/kg og 10 mg/kg av kropp vekt henholdsvis.
- Bekreft dyp anestesi ved en smertefull stimulans (f.eks knip med tang) fots dyr og når det er ingen smerte refleks, ofre dyr for cervical forvridning.
- Ren og desinfiserende huden av abdomen ved sprøyting 70% etanol.
- Kontrollere huden over magen og skjæres hud og underliggende fascia med saks å avdekke bukhulen og livmor horn.
- Fjern livmor hornene som inneholder embryoene ved saks og overføre dem til en 50 mL konisk rør som inneholder 25 mL kaldt HEPES-MEM-bufferen.
- Sett konisk røret under laminær strømning panseret og åpne lokket under panseret. Få livmor hornene ut fra rør og skyll 3 ganger med nok volum frisk kaldt HEPES-MEM bufferstørrelsen å fjerne rusk og blod.
- Overføre livmor vev til en 10 cm Petriskål inneholder 7-10 mL kaldt HEPES-MEM-bufferen. Åpne livmor hornene med fine saks og overføre embryo til en ny rett som inneholder 7-10 mL kaldt HEPES-MEM-bufferen. Nå legge 10 cm parabolen med embryo under dissecting mikroskop for mikro-disseksjon operasjonen.
- Bøye spissen på en 25-27 G sprøyte nål ved å trykke på spissen sin et stål skalpell blad håndtak. Bøye spissen på nålen før spissen er bøyd i vinkel på 70-90°. Sjekk tuppen av nålen under dissecting mikroskop for å se svingen på spissen av nålen.
Merk: Naturligvis embryoer har en lateral posisjon i fatet. - Uten å endre sin posisjon, hold halsen og kroppen av embryoet med fine tang og deretter sette inn delen bøyd i pinne-spissen i frontal fontanelle av embryoet hodet. Det vil være liten blødning eller blodpropp det.
- Flytte pinne-spissen overfladisk. Mens den bøyde delen er inne bule mot pannen og deretter mot baksiden av hodet, må skjære gjennom huden og kraniet og ikke skade den underliggende hjernen.
- Trykk huden med pinne-spissen sidelengs å avdekke hjernen og sette inn nålen fra den laterale siden av huden til området under hjernen. Fjern hjernen fra skallen ved å skyve det å komme ut fra dissekert skallen.
- Hold hjernen stødig med buet tang og kuttet cortex på hver halvkule med mikro-saks for å avsløre ganglionic eminense.
- Hold hjernen og plassere dissekert ganglionic eminense i 15 mL sentrifuge røret som inneholder nevrale stamceller medium. Ganglionic eminense er klart vist med midten og lateral deler.
- Gjenta dette til alle hjernen er mikro-dissekert.
- Cut dissekert ganglionic eminense ved å plassere pipette mot bunnen av røret. Pipetter suspensjon opp og ned 4 til 5 ganger å bryte opp vev for en enkeltcelle suspensjon.
- Sentrifuge suspensjon 110 x g for 5 min. Fjern nedbryting og å suspendere cellene i 1 mL av 0,05% trypsin-EDTA.
- Inkuber celle suspensjon i en 37 ° C i 10 min, og deretter legge en tilsvarende volum av soyabønner trypsin inhibitor (25 µg/mL) å stoppe trypsin aktiviteten. Pipetter celle suspensjon opp og ned for å sikre at trypsin har vært helt deaktivert.
- Sentrifuge celle suspensjon 110 x g for 5 min. fjerne nedbryting og å suspendere cellene i 1 mL av komplett NSC medium og telle antall celler.
- Plate cellene (2 x 105 celler/mL) på NSC middels til passende størrelse vev kultur kolbe. Overføre 5 mL til T25, 20 mL MT75 og 40 mL til T175 flasker.
Merk: Neurospheres vises etter 3 dager kultur på 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2. Etter 6-7 dager, kulene skal måle mellom 150-200 µm i diameter og vil være klar for subkultur. Ved å dyrke en million primære NSCs etter syv dager vil antall celler øke til 3-4 millioner.
3. trypsinization og Passaging av Neurospheres
- Subkultur av neurospheres, overføre mediet med suspendert neurospheres til sentrifuge røret, sentrifuge 110 x g i 5 min og deretter kaste nedbryting. Legg 1 mL av 0,05% trypsin-EDTA og ruge ved 37° C i 10 min.
- Deaktiver trypsin bruker soyabønner trypsin hemmer og pipette neurospheres forsiktig opp og ned for å gjøre dem enkelt celler.
- Sentrifuge celle suspensjon 110 x g i 5 min, forkaste nedbryting og å suspendere cellene i 1 mL av NSC medium. Disse cellene er klar for neste subkultur eller kultur på Laminin og Poly-L-Ornithine belagt overflater for avansert eksperimenter.
- For neste subkultur, overføre NSCs til nye kolbe (Følg trinn 2.8) og kultur dem i NSC medium. For induksjon av neuronal differensiering kultur NSCs i NSC medium i fravær av bFGF og EGF på Laminin og Poly-L-Ornithine belagt plater (figur 1B).
- Fremgangsmåten for belegg, fullt pels kultur celleoverflaten ved å legge til nok volum utvannet poly-L-ornithine løsning (25 µg/mL) celle kultur plate og ruge ved 37 ° C i 2 timer.
- Sug opp poly-L-ornithine og skyll godt 2 x med PBS. Legg nok volum av 5 µg/mL laminin helt dekker areal kultur og ruge ved 37 ° C i 2 h. leveringstanken laminin før plating celler eller lagre platen på 4 ° C inntil nødvendig.
4. flyt cytometri analysen
Merk: Uttrykket for bestemte NSCs, nerveceller og gliacellene kan måles ved flyt cytometri analysen13. Protokollen er basert på Menon et al.,13 med mindre modifikasjoner.
- Oppheve tilknytningen neurospheres eller koble kulturperler NSCs fra belagt plater av trypsinization å gjøre dem enkeltceller. Legg til 500 µL fiksering bufferen (2% paraformaldehyde (PFA) i PBS) 100 µL av cellen suspensjon (rundt 1 million celler er nok for flekker med hver antistoff), og deretter ruge rørene på RT i 15 min.
- Vask celler ved å legge til 1 mL av PBS tunnelbane og sentrifuge 110 x g for 5 min. forkaste nedbryting og resuspend celle pellets, forlater ca 100 µL i røret.
- Permeabilize celler med Tween-20 (0,7% Tween-20 i PBS) ved å legge 500 µL Tween-20 bufferen til 100 µL av cellen suspensjon. Inkuber rørene på RT i 15 min på en orbital shaker (100 rpm).
- Gjenta sentrifugering og PBS vask. Fjerne nedbryting fra rørene fullstendig, etterlot bare pellets. Legge til 100 µL av utvannet primære antistoffer (kanin anti musen βtub-III, GFAP og Nestin antistoffer i 1:200 konsentrasjon) fortynning buffer som inneholder 1% bovin serum albumin, 10% serum (geit serum) og 0,5% Tween-20 i PBS og forsiktig triturate å blande. Inkuber rørene på RT i 30 min på en orbital shaker.
- Vask cellene gang med PBS og fjerne nedbryting fra rørene fullstendig, etterlot bare pellets.
- Legge til 100 µL utvannet sekundære antistoff (geit anti kanin FITC bøyd på 1:500 konsentrasjon) i PBS celle pellets og forsiktig triturate for å blande. Inkuber rørene på RT i 30 min på en shaker i mørket.
- Vask prøvene 2 x med PBS og deretter vask en gang med flyt buffer. Virvel og å suspendere cellene i ca 150 µL av flyt bufferen for flyt cytometer analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikro-disseksjon, cellen aisolering og Neurosphere kultur. Her presentert vi en rask og effektiv metode mus E13 hjernen mikrokirurgi og isolering av nevrale stamceller. Denne artikkelen viser at det er mulig å fjerne hele hjernen fra en E13 musen embryoet skallen gjennom en fin brudd i frontal fontanelle. Med denne metoden hjernen varer mindre skade og er det mulig å isolere celler fra ulike deler av hjernen. Høstet cellene kunne generere neurospheres i NSC medium i nærvær av bFGF og EGF, og de er 150-200 µm størrelse i diameter etter syv dager i kultur (figur 1A). Neurospheres var atskilt med 0,05% trypsin/EDTA for å gjøre dem enkeltceller og deres kultur Laminin/Poly-L-Ornithine-belagt retter i fravær av bFGF og EGF viste at de utvide neurite som grener og viser neuronal morfologi etter 7-10 dager (Figur 1B).
Flyt cytometri analysen resultater. Som vist i figur 2A, var 95±3.16% av cellene utgjør neurospheres Nestin positiv, som er en kjent for NSCs (figur 2A). Analyser på enkeltcelle kultivert NSCs bruker β-tubulin-III og GFAP antistoffer avslørte at ved å dyrke celler på bestrøket overflater, mest av NSCs vil skille mest til neurons (94±2.67%) og mindre til gliacellene (5±2.46%).
Figur 1 : Representant bilder fra primære E13 mus embryoet nevrale stamceller. A. kultivert neurospheres etter 7 dager. B. differensiering av nevrale stamceller til modne nevroner etter 7 dager kultur på Laminin/Poly-L-ornithine belagt retter i NSC medium i fravær av bFGF og EGF. Skala stolper representerer 20 µm i A og 50 µm i B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Bestander av Nestin (A), βtubulin-III (B) og GFAP (C) positive celler ble bekreftet av flyt cytometri analysen. A. de fleste cellene (95±3.16%) bygging av neurospheres var Nestin positive. B. analysen på selvklebende kultivert NSCs på Laminin/Poly-L-Ornithine belagt plater i fravær av EGF og bFGF avslørt at 94±3.67% av celler ble βtubulin-III positive og 5±2.46% uttrykt GFAP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruke en egnet kilde av nevrale stamceller er svært viktig for neuroscientists. Nevrale stamceller kan høstes fra ulike områder av embryoet hjernen og de kan generere bestemte typer nerveceller og gliacellene. Det finnes flere metoder for induksjon av nevrale stamceller å overtale dem til å generere modne nevroner og gliacellene. Det er mange rapporter indikerer at under bestemte kultur forhold og trophic faktor regimenter, de kunne generere neurons14, oligodendrocytes15,16 og astrocyttene17i vitro. Ganglionic eminense basert på data fra litteratur, og gir en god kilde av nevrale stamceller til å generere ulike typer hemmende og eksitatoriske nerveceller som GABAergic18 og dopaminergic19 typer. Derfor gir de basert på naturlige tendensen av disse NSCs for generering av høyere rate av GABAergic neurons, en egnet kilde for studier på hemmende neurons.
I denne artikkelen forbedret vi hjernen microdissection teknikken for å ta ut hele hjernen fra E13 musen embryoet skallen mens du presser mindre skade på hjernevev. For å oppnå den høyeste frekvensen av NSCs fra dyr hjerne, anbefales det å redusere kirurgisk tidsperioden og utføre de viktigste punktene som omgivelsestemperatur og sterile forhold.
Det er noen viktige trinn for vellykket forestilling av denne prosedyren. Dyr kirurgi og livmor disseksjon må gjøres så raskt som mulig og i et rent rom. Bruk UV lys for å rengjøre rommet før operasjonen hvis tilgjengelig. For å redusere risikoen for forurensing, overføre livmor horn til konisk røret som inneholder 25 mL kaldt HEPES-MEM bufferen og lukk dekselet. Ikke bruk en Petriskål i dette trinnet som mangler skrukork. Røret bidrar til å unngå medium fra lokket og hjelper suge livmor hornene i HEPES-MEM buffer. Legge livmor-røret under laminær panseret og før du overfører den livmor til en Petriskål, skyll livmor minst 3 x med kaldt HEPES-MEM buffer. Dette trinnet reduserer effektivt risikoen for mikrobiell forurensning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Noen interessekonflikt erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Royan Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2 Unit2D.6 (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neuroscience. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
