Summary
Здесь мы представляем Роман микрохирургическая техника для изоляции нервных стволовых клеток от ганглиозных возвышение эмбриона мыши13 E.
Abstract
Нервные стволовые клетки (NSCs) Multipotent с и может привести к трем видам основных клеток центральной нервной системы (ЦНС). В vitro культуры и расширение NSCs обеспечивают удобный источник клеток для неврологов для изучения функции нейронов и глиальных клеток, а также их взаимодействия. Существует несколько методов сообщил для изоляции нервных стволовых клеток от взрослого или эмбриона млекопитающих мозги. Во время микрохирургической операции изолировать NSCs из разных регионов эмбриональных ЦНС очень важно уменьшить повреждение клетки мозга, чтобы получить самый высокий коэффициент живой и расширяемая стволовых клеток. Возможный способ для снижения стресса во время изоляции этих клеток мозга эмбриона мыши — сокращение времени хирургического. Здесь мы демонстрируем разработанная методика для быстрой изоляции этих клеток от ганглиозных возвышение эмбриона мыши13 E. Хирургические процедуры включают в себя сбор эмбрионов мыши13 E от матки, резка лобной Фонтанелле эмбриона с изогнутой иглой оконечности, извлечение мозг от черепа, microdissection изолированных мозга урожай Ганглиозный возвышение, диссоциация заготовленной ткани в НСК среднего получить одну ячейку подвеска, и, наконец, обшивка клеток в культуре подвеска для создания neurospheres.
Introduction
Нервные стволовые клетки (NSCs) находятся в различных регионах мозга взрослого и эмбрион, и они имеют тенденцию генерировать различные типы нейронов и глиальных клеток1. НБК богатые регионы3субвентрикулярной зоны в взрослого мозга млекопитающих2 и Ганглиозный возвышением головного мозга эмбриона. В развивающемся мозге Ганглиозный возвышение обеспечивает большую часть коры интернейронов и особенно ГАМК интернейронов3. Есть также менее инвазивные методы для генерации нервных стволовых клеток из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или использовать индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), которые снижают спрос на животных. Несмотря на то, что создание NSCs из ЭСК или iPSCs возможно4,5она имеет некоторые преимущества и недостатки по сравнению с изоляции нервных стволовых клеток от взрослого или эмбриона мозга6,7, 8. Протоколы для стимулирования дифференцирования ЭСК и iPSCs сторону нейрональных фенотипов всегда времени и стоимости потребления и уровень успеха (70-80% Nestin положительные клетки)5 ниже по сравнению с прямым изоляции NSCs от животных мозга ( более 99% Nestin позитивных клеток)9. Кроме того стволовые клетки теряют их генетической стабильности и дифференциации тенденция после нескольких проходов10,11. Даже несмотря на то, что есть другие новые сообщения о прямое преобразование соматических клеток в NSCs, эти клетки генетически модифицированные и не являются легко доступны в каждой лаборатории12. Таким образом существует большой спрос на изоляции нервных стволовых клеток от животных мозга; Это позволяет уменьшить количество животных использования путем совершенствования хирургической техники. Путем сокращения времени, хирургические и улучшения методов, можно сохранить клетки от повреждения и получить высокий уровень NSCs от каждого животного.
Здесь мы представляем упрощенной и воспроизводимый метод для изоляции нервных стволовых клеток от мозга эмбриона мыши E13 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все операции и процедуры на животных были утверждены Комитетом животных этики Института Руана, Тегеран, Иран.
1. Подготовка хирургических инструментов, Стиральная буфера (HEPES-MEM), СМИ культуры клеток и клеток культуры пластин
- Стерилизуйте хирургические инструменты (ножницы, ручка лезвие скальпеля и щипцы) путем автоклавирования, которую их на основе обычной стерилизации руководящих принципов.
- Готовить достаточное количество HEPES-MEM буфера (около 100 мл достаточно для каждого беременных мышей). Добавление высоких концентраций антибиотиков (10% пенициллина/стрептомицина) в HEPES-MEM буфер. Эта концентрация антибиотиков, необходимых для уменьшения риска микробного загрязнения.
- Чтобы подготовить HEPES-MEM буфера, добавить 0.5958 g порошка HEPES 100 мл MEM (минимальные основные среды) и хорошо перемешать. Отрегулируйте пэ-аш до 7,3-7.4 и фильтра средство, с помощью фильтра 0.22 мкм.
- Сделать НСК средних содержащие neurobasal среднего (NB), дополнены 20 нг/мл EGF, bFGF 10 нг/мл, 100 x N2 дополнение 1% или 1% B27 дополнение (без витамина А), 1 ед/мл гепарина, 1% L-глютамином, 1%-важная аминокислота (NEAA), 1% пенициллина/стрептомицина, и β-меркаптоэтанол 0,1 мм.
2. животных хирургия и микро рассечение
- Анестезировать беременных мышь на 13-й день беременности (здесь, использование BALB/c штамм в возрасте 4 месяцев) внутрибрюшинной инъекцией кетамин Ксилазина, 100 мг/кг и 10 мг/кг на вес тела соответственно.
- Подтвердить глубокую анестезии, оказав болезненный стимул (например, сжатие с щипцами) на ноги животного и когда есть рефлекс не боль, пожертвовать животное шейки матки дислокации.
- Чистый и дезинфицирующее кожу живота путем распыления на 70% спирте.
- Контроль кожу живота, а затем вырезать кожу и базовой фасции с ножницами, чтобы раскрыть в брюшной полости и маточные рожки.
- Удаление матки рога, содержащего эмбрионы ножницами и перенести их в конической Тюбик 50 мл, содержащие 25 мл холодного HEPES-MEM буфера.
- Место Конические трубки под капотом ламинарного потока и откройте крышку под капотом. Выведи маточные рожки из трубки и промыть 3 раза с достаточным объемом свежей холодной HEPES-MEM буфера для ликвидации мусора и крови.
- Передать 10 см Петри, содержащий 7-10 мл холодного HEPES-MEM буфера ткани матки. Откройте маточные рожки, с помощью тонкой ножницы и переноса эмбрионов в новое блюдо, содержащий 7-10 мл холодного HEPES-MEM буфера. Сейчас ставлю 10 см блюдо с эмбрионами под микроскопом рассечения для микро рассечение операции.
- Согните кончик иглы шприца 25-27 G, нажав его кончик на рукоятке ножа стальной скальпель. Согните кончик иглы, пока кончик изогнут под углом 70-90°. Проверьте кончик иглы под рассечения Микроскоп, чтобы увидеть изгиб на кончике иглы.
Примечание: Естественно, эмбрионы имеют боковой позиции в блюдо. - Без изменения их позиции, удерживайте шеи и тела эмбриона с тонкой щипцами, а затем вставьте изогнутой частью кончик иглы в лобной Фонтанелле голова эмбриона. Там бы небольшое кровотечение или сгусток крови.
- Переместите кончик иглы поверхностно. В то время как Бент часть внутри выпуклость к лоб, а затем к задней части головы, убедитесь, чтобы прорваться через кожу и черепа и не повредить основные мозга.
- Сдвиньте кожу с кончик иглы сбоку, чтобы раскрыть мозга и вставить иглу с боковой стороны кожи в области под мозга. Удаление мозга от черепа, нажав его выйти из расчлененных черепа.
- Стабильна мозга с помощью Изогнутый пинцет и вырезать коры каждого полушария с помощью микро ножницы подвергать Ганглиозный возвышение.
- Держите мозга и поместите расчлененных Ганглиозный возвышение в 15 мл пластиковых пробирок, содержащие среднего нервных стволовых клеток. Ганглиозный возвышение четко показано с его средние и боковые части.
- Повторите эту процедуру, пока все мозги были микро расчлененный.
- Вырежьте расчлененных Ганглиозный возвышение, поместив кончик пипеткой против нижней части трубки. Пипетка подвески вверх и вниз 4 до 5 раз, чтобы разрушить ткани для подвески одной ячейки.
- Центрифуга подвеска на 110 x g для 5 минут удалить супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА.
- Инкубировать суспензию клеток в 37 ° C в течение 10 минут, а затем добавьте эквивалентный объем ингибитора трипсина сои (25 мкг/мл) для остановки активности трипсина. Пипетка суспензию клеток вверх и вниз, чтобы убедиться, что полностью инактивированных трипсина.
- Центрифуга суспензию клеток на 110 x g 5 минут удалить супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл полного среднего НБК и подсчитать количество ячеек.
- Пластина клетки (2 x 105 клеток/мл) на НСК средних в колбу культуры ткани подходящего размера. Передача 5 мл на Т25, 20 мл T75 и 40 мл для фляги T175.
Примечание: Neurospheres будет отображаться после 3-х дней культуры при 37 ° C в увлажненные инкубатор с 5% CO2. После 6-7 дней сферах должен измерить между 150-200 мкм в диаметре и будут готовы к субкультуре. Выращивая один миллион первичной NSCs после семи дней количество клеток возрастет до 3-4 млн.
3. trypsinization и осеменяющ из Neurospheres
- Субкультура neurospheres передачи в среду с отсрочкой neurospheres для пластиковых пробирок, центрифуги на 110 x g 5 мин и затем удалить супернатант. Добавить 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировать при 37° C за 10 мин.
- Инактивирует трипсина, использование сои ингибитор трипсина и пипетки neurospheres мягко вверх и вниз, чтобы сделать их одной клетки.
- Центрифуга суспензию клеток на 110 x g 5 минут, удалить супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл среды НБК. Эти клетки будут готовы к следующему субкультуры или культуры на Ламинин и поли-L-орнитин покрытием поверхностей для продвинутых экспериментов.
- Для следующего субкультуры передача NSCs в новый флакон (следуйте шаг 2.8) и культура их в среде НБК. Для индукции нейрональных дифференциация культуры NSCs в среде НСК в отсутствие bFGF и EGF Ламинин и поли-L-орнитин покрытием пластины (рис. 1B).
- Для процедуры покрытия полностью пальто поверхности культуры клеток путем добавления достаточного объема разреженных поли L-орнитин раствора (25 мкг/мл) на пластину культуры клеток и инкубировать при 37 ° C на 2 ч.
- Аспирационная поли L-орнитин и промыть хорошо 2 x с PBS. Добавьте достаточно объем 5 мкг/мл Ламинин полностью покрыть площадь поверхности культуры и инкубировать при 37 ° C для 2 h. аспирата Ламинин перед гальванических клеток или хранить тарелку на 4 ° C до тех пор, пока требуется.
4. поток Cytometry Assay
Примечание: Выражение определенных маркеров NSCs, нейронов и глиальных клеток может быть измерен потока цитометрии пробирного13. Протокол основан на Менон et al.,13 с незначительными изменениями.
- Отделить neurospheres или снимите культивируемых NSCs из пластины с покрытием, trypsinization сделать их одиночных клеток. Добавьте 500 мкл буфера фиксации (2% параформальдегида (PFA) в PBS) 100 мкл суспензии клеток (около 1 миллиона клетки являются достаточно для окрашивания с каждое антитело), затем и инкубировать и трубы в РТ за 15 мин.
- Вымыть клетки путем добавления 1 мл PBS трубки и центрифуги на 110 x g 5 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте ячейки Пелле, оставив примерно 100 мкл в трубе.
- Разрушения клеток с Tween-20 (0,7% Tween-20 в PBS) путем добавления 500 мкл буфера Tween-20 100 мкл суспензии клеток. Инкубируйте трубы на RT для 15 мин на орбитальный шейкер (100 об/мин).
- Повторите центрифугирования и мыть PBS. Супернатант полностью удалите из трубы, оставив только гранулы. Добавить 100 мкл разбавленного первичных антител (кролик анти мыши βtub-III, СВМС и Нестин антител в концентрации 1: 200) в разведении буфер, содержащий альбумина bovine сыворотки 1%, 10% сыворотки (козьего сыворотки) и 0,5% Tween-20 в PBS и аккуратно нарезанных смешивать. Инкубируйте трубы на RT 30 мин на орбитальный шейкер.
- Вымыть клетки один раз с PBS и удалить супернатант из трубы полностью, оставив только гранулы.
- 100 мкл разбавленного вторичное антитело (коза анти кролик FITC спрягаются в концентрации 1: 500) в PBS Пелле клеток и мягко нарезанных смешивать. Инкубируйте трубы на RT 30 мин на шейкер в темноте.
- Стирать образцы 2 x с PBS и затем промыть после потока буфера. Центрифуга и вновь приостановить клетки в приблизительно 150 мкл буфера потока для анализа потока цитометр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микро рассечение, изоляция клетки и культуры нейросферы. Здесь мы представили быстрый и эффективный метод для изоляции нервных стволовых клеток и мышь E13 мозга микрохирургии. Эта статья показывает, что это возможно удалить весь мозг из черепа E по13 эмбриона мыши через штраф разрыв в родничок лобной. С помощью этого метода мозг выносит меньше вреда, и это можно изолировать клетки из разных частей мозга. Заготовленных клеток может генерировать neurospheres в НСК среде в присутствии bFGF и EGF, и они являются размер 150-200 мкм в диаметре после семи дней в культуре (рис. 1A). Neurospheres были отделены с помощью 0,05% трипсина/ЭДТА сделать их единичных клеток и их культура на Ламинин/поли-L-орнитин покрытием блюда в отсутствие bFGF и EGF показал, что они neurite как ветви и показать нейрональных морфология после 7-10 дней (Рис. 1B).
Результаты потока Cytometry Assay. Как показано на рисунке 2А, 95±3.16% клеток, составляющих neurospheres Нестин положительный, который является известным маркера для NSCs (рис. 2A). Анализы на одну ячейку культивируемых NSCs с помощью β-тубулина III и СВМС антител выявлено, что путем культивирования клеток на покрытием поверхностей, наиболее NSCs будет дифференцировать большинство нейронов (94±2.67%) и меньше глиальных клеток (5±2.46%).
Рисунок 1 : Представитель изображения из первичных E13 мышь нервных стволовых клеток эмбриона. А. культурный neurospheres после 7 дней. B. дифференциация нервных стволовых клеток для зрелых нейронов после 7 дней культуры на Ламинин/поли-L-орнитин покрытием блюда в среде НСК в отсутствие bFGF и EGF. Масштаб бары представляют 20 мкм в A и 50 мкм в б. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Население Нестин (A), βtubulin-III (B) и GFAP (C) положительных клеток были проверены потока цитометрии пробирного. A. большинство клеток (95±3.16%), строительство neurospheres Нестин положительный. B. Assay на клей культивируемых NSCs на Ламинин/поли-L-орнитин покрытием пластин в отсутствие EGF и bFGF показали что 94±3.67% клеток были βtubulin-III положительным и 5±2.46% выразили СВМС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С помощью подходящего источника нервных стволовых клеток является очень важным для неврологов. Нервные стволовые клетки могут быть собраны из различных областей мозга эмбриона и они могут генерировать конкретные типы нейронов и глиальных клеток. Существует несколько методов для индукции дифференцировки нервных стволовых клеток, чтобы побудить их к генерации зрелых нейронов и глиальных клеток. Есть многочисленные сообщения, свидетельствующие о что определенной культуры условиях и трофических фактор полков, они могут генерировать нейронов14, олигодендроциты15,16 и астроциты17в пробирке. На основе данных из литературы, Ганглиозный Высокопреосвященнейшего обеспечивает хороший источник нервных стволовых клеток с потенциалом для создания различных типов тормозящее и возбуждающих нейронов такие типы19 18 и дофаминергической ГАМК. Таким образом основываясь на естественную тенденцию этих NSCs для генерации более высокий уровень ГАМК нейронов, они обеспечивают удобный источник для исследования на ингибирующих нейронов.
В этой статье мы усовершенствовали технику microdissection мозга вывести весь мозг от черепа эмбриона мыши13 E во время оказывают меньшее повреждение ткани мозга. Чтобы получить самый высокий уровень NSCs от животных мозга, рекомендуется уменьшить продолжительность хирургического и выполнить ключевые моменты, такие как температура и стерильных условиях.
Есть некоторые важные шаги для успешного выполнения этой процедуры. Животных хирургия и рассечение матки должно быть сделано как можно быстрее и в чистой комнате. Используйте ультрафиолетовый свет для чистой комнаты до операции, если таковые имеются. Чтобы уменьшить риск заражения, передача маточные рожки в коническую пробирку, содержащую 25 мл холодного HEPES-MEM буфера и закройте крышку. Не используйте чашку Петри в этот шаг, как ей не хватает колпачок. Трубка помогает избежать средних утечки из крышки и помогает замочить маточные рожки в HEPES-MEM буфера. Положите маточных труб под ламинарным капот и перед передачей матки на чашку Петри, ополосните матки по крайней мере 3 x с холодной HEPES-MEM буфера. Этот шаг эффективно снижает риск возникновения микробной контаминации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликта интересов не объявлен.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана института Руана.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2 Unit2D.6 (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neuroscience. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
