Summary
Här introducerar vi en ny mikrokirurgisk teknik för isolering av neurala stamceller från E13 mus embryo ganglieblockerande höjd.
Abstract
Neurala stamceller (Karolina) är multipotenta och kan ge upphov till de tre stora cell typerna av centrala nervsystemet (CNS). In vitro kultur och expansion av Karolina ger en lämplig källa av celler för neuroforskare att studera funktionen av neuron och gliaceller tillsammans med deras interaktioner. Det finns flera rapporterade metoder för isolering av neurala stamceller från vuxna eller embryo däggdjurs hjärnor. Under den mikrokirurgisk operationen för att isolera Karolina från olika regioner av embryonala CNS, är det mycket viktigt att minska skadan hjärncellerna att erhålla den högsta andelen av levande och utbyggbart stamceller. En möjlig teknik för stressreducering under isolering av dessa celler från mus embryo hjärnan är minskning av kirurgisk tid. Här visar vi en utvecklad teknik för snabb isolering av dessa celler från den E13 mus embryo ganglieblockerande eminens. Kirurgiska ingrepp inkluderar skörd E13 musembryon från livmodern, skära den främre fontanellen av embryot med en böjd nål spets, extrahera hjärnan från skallen, lokalt av isolerade hjärnan att skörda den ganglieblockerande eminens, dissociation skördade vävnaden i NSC medium att få en enda cellsuspension, och slutligen plätering celler i suspension kultur att generera neurospheres.
Introduction
Neurala stamceller (Karolina) bosatta i olika regioner av hjärnan som vuxen och embryo och de har en tendens att generera olika typer av nervceller och glial cell1. De subventrikulära zonerna i vuxna däggdjur hjärnan2 och ganglieblockerande eminens i embryo hjärnan är NSC rika regioner3. I hjärnans utveckling levererar höjd ganglieblockerande de flesta kortikala interneuronen och särskilt GABAergic interneuroner3. Det finns också mindre invasiva metoder för neurala stamceller generation från embryonala stamceller (råden) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som minskar efterfrågan på djur använder. Trots att generera Karolina från ESCs eller iPSCs är möjligt4,5, har den vissa fördelar och nackdelar jämfört med isolering av neurala stamceller från vuxna eller embryo hjärnan6,7, 8. Protokollen för att inducera differentiering av ekonomiska och sociala råden och iPSCs mot neuronala fenotyper är alltid tid och kostnad konsumerar och graden av framgång (70-80% Nestin positiva celler)5 är lägre jämfört med direkt isolering av Karolina från den djura hjärna ( Mer än 99% Nestin positiva celler)9. Dessutom förlorar stamceller deras genetiska stabilitet och differentiering tendens efter flera passager10,11. Även om det finns andra nya rapporter om direkt omvandling av somatiska celler till Karolina, dessa celler är genetiskt konstruerade och är inte lätt tillgängliga i varje lab12. Därför finns det fortfarande en stor efterfrågan för isolering av neurala stamceller från animaliska hjärnan; Det är möjligt att minska mängden animaliska användning genom att förbättra de kirurgiska teknikerna. Genom att minska det kirurgiska tid och förbättra teknikerna, är det möjligt att hålla celler från skador och erhålla den högsta andelen Karolina från varje djur.
Här introducerar vi en förenklad och reproducerbara teknik för isolering av neurala stamceller från mus E13 embryo hjärna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla operationer och förfaranden på djuret godkändes av utskottet djuretik i Royan Institutet, Teheran, Iran.
1. beredning av kirurgiska instrument, tvätt buffert (HEPES-MEM), Cell kulturmassmedia och Cell kultur plattor
- Sterilisera kirurgiska verktyg (sax, skalpell blad handtag och tången) i autoklav dem baserat på riktlinjerna som rutinmässig sterilisering.
- Förbereda en lämplig volym av HEPES-MEM buffert (omkring 100 mL räcker till varje dräktiga möss). Lägga till höga koncentrationer av antibiotika (10% penicillin/streptomycin) HEPES-MEM bufferten. Denna koncentration av antibiotika är nödvändigt att minska risken för mikrobiell kontamination.
- För att förbereda HEPES-MEM buffert, tillsätt 0.5958 g HEPES pulver till 100 mL MEM (minsta viktigt medium) och blanda väl. Justera pH till 7,3-7,4 och filtrera medium med 0,22 µm filter.
- Gör NSC medel innehållande neurobasal medel (NB), kompletterat med 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% 100 x N2 supplement eller 1% B27 komplettera (utan vitamin A), 1 U/mL Heparin, 1% L-glutamin, 1% icke-essentiell aminosyra (NEAA), 1% Penicillin/streptomycin, och 0,1 mM β-merkaptoetanol.
2. djur kirurgi och Micro-dissektion
- Söva en gravid mus på den 13: e dagen av dräktigheten (här, Använd stam BALB/c 4 månaders ålder) som en intraperitoneal injektion av ketamin-xylazin, 100 mg/kg och 10 mg/kg av kroppsvikt respektive.
- Bekräfta djup anestesi genom att utöva ett smärtsamt stimulus (t.ex. dra ihop med pincett) djurets fots och när det finns ingen smärta reflex, offra djur av cervikal dislokation.
- Ren och desinficerande huden på buken genom sprutning 70% etanol.
- Kontrollera huden över buken och sedan skära huden och underliggande fascia med sax för att avslöja de bukhålan och livmoderns horn.
- Ta bort livmoder hornen innehållande embryona sax och överföra dem till en 50 mL konisk tub som innehåller 25 mL kall HEPES-MEM buffert.
- Placera den koniska rör under LAF och öppna locket under huven. Ta livmodern hornen från röret och skölj 3 gånger med tillräckligt med volym för färskt kallt HEPES-MEM bufferten att eliminera skräp och blod.
- Överföra uterin vävnaden till en 10 cm petriskål innehållande 7-10 mL kall HEPES-MEM buffert. Öppna livmoder hornen med fina sax och överföra embryon till en ny maträtt som innehåller 7-10 mL kall HEPES-MEM buffert. Nu lägga 10 cm skålen med embryon under mikroskopet dissekera för mikro-dissektion.
- Böj en 25-27 G spruta nålspetsen genom att trycka sin spets på ett stål skalpell blad handtag. Böj toppen av nålen tills spetsen är böjd i vinkel på 70-90°. Kontrollera spetsen på nålen under mikroskopet dissekera att se böjen på spetsen av nålen.
Obs: Naturligtvis embryon har en lateral position i skålen. - Utan att ändra deras position, håll hals och kropp av embryot med fin pincett och sedan infoga den böjda delen av nålens spets i den främre fontanellen av embryo huvudet. Det skulle vara liten blödning eller blodpropp det.
- Flytta nålspetsen ytligt. Medan den böjda delen är inuti bulan mot pannan och sedan mot baksidan av huvudet, se till att skära igenom huden och skalle och inte för att skada underliggande hjärnan.
- Tryck huden med kanylspetsen sidled till avslöja hjärnan och stick in nålen från den laterala sidan av huden i området under hjärnan. Ta bort hjärnan från skallen genom att trycka den att komma ut från dissekerade skallen.
- Håll hjärnan stadigt med böjda pincetten och skär cortex av varje halvklotet med mikro-sax för att exponera den ganglieblockerande eminens.
- Håll hjärnan och placera dissekerade ganglieblockerande höjd i centrifugeringsröret 15 mL som innehåller neurala stamceller medium. Ganglieblockerande höjd visas tydligt med dess mellersta och laterala delar.
- Upprepa proceduren tills alla hjärnor har varit mikro-dissekeras.
- Skär dissekerade ganglieblockerande höjd genom att placera pipettspetsen mot botten av röret. Pipettera suspensionen upp och ner 4 till 5 gånger att bryta upp vävnaden för en enda cellsuspension.
- Centrifugera suspensionen vid 110 x g i 5 min. ta bort supernatanten och Slamma upp cellerna i 1 mL 0,05% trypsin-EDTA.
- Inkubera cellsuspensionen i en 37 ° C i 10 min och sedan Tillsätt en motsvarande volym av sojabönor trypsin hämmare (25 µg/mL) att stoppa aktiviteten trypsin. Pipettera cellsuspensionen upp och ner för att se till att trypsin har varit helt inaktiverade.
- Centrifugera cellsuspension på 110 x g för 5 min. avlägsna supernatanten och Slamma upp cellerna i 1 mL av komplett NSC medium och räkna antalet celler.
- Platta celler (2 x 105 celler/mL) vid NSC medium i lämplig storlek vävnadsodling kolven. Överföra 5 mL till T25, 20 mL T75 och 40 mL till T175 kolvar.
Obs: Neurospheres visas efter 3-dagar kultur vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% CO2. Efter 6-7 dagar, sfärernas bör mäta mellan 150-200 µm i diameter och kommer att vara redo för subkultur. Genom att odla en miljon primära Karolina efter sju dagar kommer antalet celler öka till 3-4 miljoner.
3. trypsinization och Passaging av Neurospheres
- Subkultur i neurospheres, överför mediet med svävande neurospheres till centrifugröret, Centrifugera vid 110 x g i 5 min och sedan Kassera supernatanten. Tillsätt 1 mL 0,05% trypsin-EDTA och inkubera vid 37° C i 10 min.
- Inaktivera den trypsin använder sojabönor trypsin hämmare och pipett neurospheres försiktigt upp och ned till göra dem enstaka celler.
- Centrifugera cellsuspension vid 110 x g i 5 min, avlägsna supernatanten och Slamma upp cellerna i 1 mL av NSC medium. Dessa celler är redo för nästa subkultur eller kultur på Laminin och Poly-L-Ornithine belagda ytor för avancerade experiment.
- För nästa subkultur, Karolina och överför till den nya (Följ steg 2,8) och kultur dem i NSC medium. För induktion av neuronal differentiering kultur Karolina NSC medium i avsaknad av bFGF och fonden den Laminin och Poly-L-Ornithine belagda plattor (figur 1B).
- För beläggning förfarande, fullt belägga kultur cellytan genom att lägga till tillräckligt med volym för utspädda poly-L-ornithine lösning (25 µg/mL) till cell kultur plattan och inkubera vid 37 ° C i 2 h.
- Aspirera den poly-L-ornitin och skölj väl 2 x med PBS. Tillsätt tillräckligt mängd 5 µg/mL laminin att helt täcka ytan kultur och inkubera vid 37 ° C under 2 h. Aspirera till laminin före plätering celler eller förvara plattan vid 4 ° C tills den behövs.
4. flödet flödescytometri Assay
Anmärkning: Uttrycket av specifika infektionsmarkörer Karolina, neuron och gliaceller kan mätas genom flödet flödescytometri assay13. Protokollet är baserat på Menon et al.,13 med smärre ändringar.
- Separera neurospheres eller lossa odlade Karolina från plattorna genom trypsinization göra dem enstaka celler. Tillsätt 500 µL fixering buffert (2% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS) i 100 µL cellsuspension (runt 1 miljon celler är nog för färgning med varje antikropp), och sedan Inkubera rören på RT i 15 min.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 mL PBS till rör och centrifugera vid 110 x g under 5 min. avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten, lämnar ca 100 µL i röret.
- Permeabilize celler med Tween-20 (0,7% Tween-20 i PBS) genom att lägga till 500 µL av Tween-20 buffert 100 µL cellsuspension. Inkubera rören på RT under 15 minuter i orbitalskak (100 rpm).
- Upprepa centrifugeringen och PBS tvätten. Ta bort supernatanten från rören helt, efterlämnade endast pelleten. Tillsätt 100 µL utspätt primära antikroppar (kanin anti mus βtub-III, Fredsgenomförande och Nestin antikroppar vid koncentration av 1: 200) i förtunningsbuffert som innehåller 1% bovint serumalbumin, 10% serum (Get serum) och 0,5% Tween-20 i PBS och försiktigt pulverisera att blanda. Inkubera rören på RT under 30 minuter i orbitalskak.
- Tvätta cellerna en gång med PBS och avlägsna supernatanten från rören helt, efterlämnade endast pelleten.
- Tillsätt 100 µL utspätt sekundär antikropp (get anti kanin FITC konjugerad vid koncentration av 1: 500) i PBS cellpelleten och försiktigt pulverisera för att blanda. Inkubera rören på RT i 30 min på en shaker i mörkret.
- Tvätta proverna 2 x med PBS och sedan tvätta en gång med flöde buffert. Centrifugera och Slamma upp cellerna i cirka 150 µL flöde buffert för flöde cytometer analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Micro-dissektion, Cell isolering och Neurosphere kultur. Här presenterade vi en snabb och effektiv metod för musen E13 hjärnan mikrokirurgi och isolering av neurala stamceller. Denna artikel visar att det är möjligt att ta bort hela hjärnan från en E13 mus embryo skallen genom en fin bristning i främre fontanell. Med den här metoden hjärnan tål mindre skada och det är möjligt att isolera cellerna från olika delar av hjärnan. De skördade cellerna skulle kunna generera neurospheres i NSC medium i närvaro av bFGF och EGF, och de är 150-200 µm storlek i diameter efter sju dagar i kultur (figur 1A). Neurospheres var separerade med 0,05% trypsin/EDTA för att göra dem enstaka celler och deras kultur på Laminin/Poly-L-Ornithine-coated rätter i avsaknad av bFGF och EGF visade att de förlänga neurite som grenar och Visa neuronala morfologi efter 7-10 dagar (Figur 1B).
Flöde flödescytometri analysens resultat. Som visas i figur 2A, 95±3.16% av cellerna som utgör neurospheres Nestin positiv, vilket är en känd markör för Karolina (figur 2A). Analyser på enstaka cell odlade Karolina med β-tubulin-III och Fredsgenomförande antikroppar avslöjade att genom att odla celler på belagda ytor, mest av Karolina kommer skilja mest till nervceller (94±2.67%) och mindre att gliacellerna (5±2.46%).
Figur 1 : Representativa bilder från primära E13 mus embryo neurala stamceller. A. odlade neurospheres efter 7 dagar. B. differentiering av neurala stamceller mogna nervceller efter 7 dagar kultur på Laminin/Poly-L-ornithine belagda rätter i NSC medium i avsaknad av bFGF och EGF. Skala staplarna representerar 20 µm i A och 50 µm i B. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Befolkningen i Nestin (A), βtubulin-III (B) och GFAP (C) positiva celler kontrollerades av flöde flödescytometri assay. A. de flesta av cellerna (95±3.16%) att bygga neurospheres Nestin positiva. B. analys på självhäftande odlade Karolina på Laminin/Poly-L-Ornithine belagda plåtar i avsaknad av EGF och bFGF avslöjade att 94±3.67% av cellerna var βtubulin-III positiva och 5±2.46% uttryckt Fredsgenomförande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Använda en lämplig källa av neurala stamceller är mycket viktigt för neuroforskare. Neurala stamceller kan skördas från olika områden av hjärnan som embryo och de kan generera specifika typer av neuron och gliaceller. I området i närheten finns det flera metoder för induktion av differentiering av neurala stamceller att förmå dem att generera mogna neuron och gliaceller. Det finns många rapporter som visar att de under specifika odlingsbetingelser och trofiska faktor regementen, kunde generera nervceller14, oligodendrocyter15,16 och astrocyter17i vitro. Ganglieblockerande eminens baserat på data från litteratur, och ger en bra källa av neurala stamceller med potential att generera olika typer av hämmande och excitatoriska nervceller som GABAergic18 och dopaminerga19 typer. Därför, baserat på den naturliga tendensen av dessa Karolina för generering av högre frekvens av GABAergic nervceller, de ger en lämplig källa för studier på inhibitoriska neuroner.
I denna artikel förbättrat vi hjärnan lokalt tekniken för att ta ut hela hjärnan från E13 mus embryo skallen samtidigt utöva mindre skador på hjärnvävnaden. För att få den högsta andelen Karolina från djurens hjärna, är det rekommendabelt att minska varaktigheten av kirurgisk tid och utföra de viktigaste punkterna som omgivande temperatur och sterila förhållanden.
Det finns några kritiska steg för framgångsrika resultat av proceduren. De djur kirurgi och uterin dissektion måste ske så snabbt som möjligt och i ett rent rum. Använda UV-ljus för att städa rummet före operation om tillgängligt. För att minska risken för kontaminering, överföra livmoderns horn till konisk röret som innehåller 25 mL kall HEPES-MEM buffert och Stäng locket. Använd inte en petriskål i det här steget eftersom det saknar ett skruvlock. Röret hjälper till att undvika medelstora läckage från den gemensamma jordbrukspolitiken och hjälper blöt uterin hornen i HEPES-MEM buffert. Sätta den livmoder-slangen under laminärt huven och innan du överför den livmoder till en petriskål, skölj uterin minst 3 x med kall HEPES-MEM buffert. Detta steg minskar effektivt risken för mikrobiell kontamination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Någon intressekonflikt förklarade.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Royan Institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2 Unit2D.6 (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neuroscience. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
