Summary
Her introducerer vi en ny microsurgical teknik til isolering af neurale stamceller fra E13 mus embryo ganglionære eminence.
Abstract
Neurale stamceller (NSCs) er Multipotente og kan give anledning til de tre store celletyper i centralnervesystemet (CNS). In vitro kultur og udvidelse af NSCs giver en passende kilde til celler for neuroforskere at studere funktionen af neuroner og gliaceller sammen med deres interaktioner. Der er flere rapporteret teknikker til isolation af neurale stamceller fra voksne eller embryo pattedyr hjerner. Under den microsurgical drift at isolere NSCs fra forskellige regioner i den embryonale CNS, er det meget vigtigt at reducere skader på hjerneceller til at opnå det højeste forholdet mellem levende og udvidelige stamceller. En mulig teknik til stress reduktion under isolation af disse celler fra mus embryo hjernen er reduktion af kirurgisk tid. Her viser vi en udviklet teknik til hurtig isolation af disse celler fra E13 mus embryo ganglionære eminence. Kirurgiske procedurer omfatter høst E13 mus embryoner fra livmoderen, skære den frontale fontanelle af embryo med en bøjet nål tip, uddrager hjernen fra kraniet, microdissection af isolerede hjernen til at høste de ganglionære eminence, dissociation af den høstede væv i NSC medie til at få en enkelt cellesuspension, og endelig plating celler i suspension kultur til at generere neurospheres.
Introduction
Neurale stamceller (NSCs) er bosat i forskellige regioner af hjernen, voksen og embryo og de har en tendens til at generere forskellige typer for neuroner og glial celler1. De subventricular zoner i voksne pattedyr hjerne2 og ganglionære eminence i embryo hjernen er NSC rige regioner3. I udvikle hjernen leverer ganglionære eminence de fleste af de kortikale interneurons og især GABAergic interneurons3. Der er også mindre invasive metoder til neurale stamceller generation fra embryonale stamceller (økonomiske) eller induceret pluripotente stamceller (iPSCs) at reducerer efterspørgslen efter dyre brug. Til trods for at generere NSCs fra europæiske sektorråd eller iPSCs er muligt4,5, har det nogle fordele og ulemper i forhold til isolering af neurale stamceller fra voksne eller embryo hjernen6,7, 8. Protokoller for inducere differentiering af økonomiske og sociale råd og iPSCs mod neuronal fænotyper er altid tid og omkostninger, tidskrævende og satsen for succes (70-80% Nestin positive celler)5 er lavere sammenlignet med direkte isolation af NSCs fra dyrs hjerne ( mere end 99% Nestin positive celler)9. Derudover mister stamceller deres genetiske stabilitet og differentiering tendens efter flere passager10,11. Selv om der er andre nye rapporter om direkte omdannelse af somatiske celler til NSCs, disse celler er genetisk manipuleret og er ikke let tilgængelige i hver lab12. Derfor er der stadig en stor efterspørgsel efter isolering af neurale stamceller fra animalske hjernen; Det er muligt at reducere mængden af animalske forbrug ved at forbedre de kirurgiske teknikker. Ved at reducere den kirurgiske tid og forbedre teknikkerne, er det muligt at holde cellerne fra skader og opnå den højeste sats af NSCs fra de enkelte dyr.
Her, indfører vi en forenklet og reproducerbare teknik til isolation af neurale stamceller fra musen E13 embryo hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle operationer og procedurer på dyret blev godkendt af Dyreetik Udvalget af instituttets Royan, Teheran, Iran.
1. forberedelse af kirurgiske instrumenter, vask Buffer (HEPES-MEM), celle Kulturmedier og celle kultur plader
- Sterilisere de kirurgiske værktøjer (saks, skalpel kniv håndtag og pincet) ved autoklavering dem baseret på retningslinjerne for rutinemæssig sterilisation.
- Forberede et passende volumen af HEPES-MEM buffer (omkring 100 mL er nok til hver gravide mus). Tilføje høje koncentrationer af antibiotika (10% penicillin/streptomycin) til HEPES-MEM-bufferen. Denne koncentration af antibiotika er nødvendige for at mindske risikoen for mikrobiel kontaminering.
- For at forberede HEPES-MEM buffer, tilføje 0.5958 g HEPES pulver til 100 mL af MEM (minimum afgørende medium) og bland godt. PH indstilles til 7,3-7.4 og filtrere medium ved hjælp af et 0,22 µm filter.
- Gøre NSC medium indeholdende neurobasal medium (NB), suppleret med 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% 100 x N2 tillæg eller 1% B27 supplement (uden vitamin A), 1 U/mL Heparin, 1% L-glutamin, 1% ikke-essentiel aminosyre (NEAA), 1% Penicillin/streptomycin, og 0.1 mM β-mercaptoethanol.
2. animalske kirurgi og mikro-dissektion
- Bedøver en gravid mus på den 13th dag i drægtigheden (her, brug stamme BALB/c alderen 4 måneder) ved intraperitoneal injektion af ketamin-xylazin, 100 mg/kg og 10 mg/kg af kropsvægt henholdsvis.
- Bekræfte dyb anæstesi ved at udøve en smertefulde stimuli (fx knivspids med pincet) på dyrets fod og når der er ingen smerte refleks, ofrer dyret af cervikal dislokation.
- Ren og desinficerende huden på maven ved at spraye 70% ethanol.
- Kontrol huden over maven og derefter skære huden og de underliggende fascia med saks til at afdække i bughulen og uterin horn.
- Fjerne uterin horn der indeholder embryoner af saks og overføre dem til en 50 mL konisk tube med 25 mL af kolde HEPES-MEM buffer.
- Placer den koniske rør under laminar flow hood og åbne fælles landbrugspolitik under kølerhjelmen. Bringe de uterine horn fra rør og skyl 3 gange med nok volumen af den friske kold HEPES-MEM buffer til at fjerne snavs og blod.
- Overføre den uterine væv til en 10 cm petriskål indeholdende 7-10 mL af kolde HEPES-MEM buffer. Åbn de uterine horn ved hjælp af fine saks og overførsel embryoner til en ny parabol indeholdende 7-10 mL af kolde HEPES-MEM buffer. Nu sætte 10 cm parabol med embryoner under dissekere mikroskop for handlingen mikro-dissektion.
- Bøje spidsen af en 25-27 G sprøjte nål ved at skubbe sin spids på en stål skalpel kniv håndtag. Bøje spidsen af nålen, indtil spidsen er bøjet i en vinkel af 70-90°. Kontroller spidsen af nålen under dissekere mikroskop til at se i svinget på spidsen af nålen.
Bemærk: Naturligvis embryoner har en lateral position i fadet. - Uden at ændre deres holdning, holde den hals og krop af fosteret med fine pincet og derefter indsætte den bøjede del af nål-spids i den frontale fontanelle af fosteret hoved. Der ville være mindre blødninger eller en blodprop.
- Flyt needle-tip overfladisk. Mens den bøjede del inde bule mod panden og derefter mod bagsiden af hovedet, Sørg for at skære igennem huden og kraniet og ikke at skade den underliggende hjernen.
- Skubbe huden med nål tip lateralt til at afdække hjernen og indsætte nålen fra den laterale side af huden i området under hjernen. Fjerne hjernen fra kraniet ved at skubbe det til at komme ud fra dissekeret kraniet.
- Hold hjernen stabil, bruger buet pincet og skære cortex af hver halvkugle ved hjælp af mikro-saks til at udsætte den ganglionære eminence.
- Hold hjernen og placere den dissekeret ganglionære eminence i 15 mL-centrifugerør indeholdende neurale stamceller medium. Den ganglionære eminence er tydeligt vist med sin midterste og laterale dele.
- Gentag denne fremgangsmåde, indtil alle hjerner har været micro-dissekeret.
- Skær den dissekeret ganglionære eminence ved at placere pipette spidsen mod bunden af røret. Der afpipetteres suspension op og ned 4 til 5 gange til at bryde op væv til en enkelt cellesuspension.
- Der centrifugeres suspension på 110 x g i 5 min. Fjern supernatanten og genopslæmmes celler i 1 mL 0,05% trypsin-EDTA.
- Inkuber cellesuspension i et 37 ° C i 10 min, og derefter tilsættes en tilsvarende mængde af sojabønner trypsin inhibitor (25 µg/mL) at stoppe trypsin aktivitet. Der afpipetteres cellesuspension op og ned for at sikre, at trypsin har været helt inaktiveret.
- Der centrifugeres cellesuspension ved 110 x g 5 min. Fjern supernatanten og genopslæmmes celler i 1 mL af komplet NSC medium og tæller antallet af celler.
- Plade celler (2 x 105 celler/mL) på NSC medium i passende størrelse vævskultur kolbe. Overføre 5 mL til T25, 20 mL til T75 og 40 mL, T175 kolber.
Bemærk: Neurospheres vises efter 3 dages kultur ved 37 ° C i en fugtig kuvøse med 5% CO2. Efter 6-7 dage, kugler skal måle mellem 150-200 µm i diameter og vil være klar til subkultur. Ved at dyrke en million primære NSCs efter syv dage øges antallet af celler til 3-4 mio.
3. trypsinization og Passaging af Neurospheres
- Subkultur af neurospheres, overføre medium med suspenderede neurospheres til centrifugeglasset, centrifugeres ved 110 x g i 5 min og derefter supernatanten. Der tilsættes 1 mL 0,05% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37° C i 10 min.
- Inaktivere trypsin ved hjælp af sojabønner trypsin inhibitor og pipette neurospheres forsigtigt op og ned for at gøre dem enkelt celler.
- Centrifugeres cellesuspension ved 110 x g i 5 min, supernatanten og genopslæmmes celler i 1 mL af NSC medium. Disse celler er klar til næste subkultur eller kultur på Laminin og Poly-L-ornithin belagt overflader for avancerede eksperimenter.
- For den næste subkultur, overføre NSCs til den nye kolbe (Følg trin 2.8) og kultur dem i NSC medium. Induktion af neuronal differentiering kultur NSCs i NSC medium i mangel af bFGF og EGF på Laminin og Poly-L-ornithin overtrukne plader (figur 1B).
- For proceduren belægning fuldt pels celle kultur overflade ved at tilføje nok volumen af fortyndet poly-L-ornithin løsning (25 µg/mL) til celle kultur plade og inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
- Opsug poly-L-ornithin og skyl den godt 2 x med PBS. Tilføje nok volumen af 5 µg/mL laminin helt dække kultur areal og inkuberes ved 37 ° C i 2 h. aspirat laminin før plating celler eller gemme plade ved 4 ° C indtil det skal bruges.
4. flow flowcytometri Assay
Bemærk: Udtryk for specifikke markører for NSCs, neuroner og gliaceller kan måles ved flow flowcytometri assay13. Protokollen er baseret på Menon et al.,13 med mindre ændringer.
- Adskille neurospheres eller frigøre kulturperler NSCs fra overtrukne plader af trypsinization at gøre dem enkelt celler. Tilføje 500 µL af fiksering buffer (2% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS) til 100 µL af cellesuspension (omkring 1 million celler er nok til farvning med hver antistof), og derefter inkuberes rør på RT for 15 min.
- Vask celler ved at tilføje 1 mL PBS til tube og centrifugeres ved 110 x g i 5 min. supernatanten og resuspenderes celle, forlader ca 100 µL i røret.
- Permeabilize celler med Tween-20 (0,7% Tween-20 i PBS) ved at tilføje 500 µL af Tween-20 buffer til 100 µL af cellesuspension. Inkuber rør på RT for 15 min på en orbitalryster (100 rpm).
- Gentag centrifugeringen og PBS vask. Fjern supernatanten fra rørene fuldstændigt, efterlader kun pellet. Tilsættes 100 µL fortyndede primære antistoffer (kanin anti mus βtub-III, GFAP og Nestin antistoffer i 1:200 koncentration) i fortynding buffer indeholdende 1% bovint serumalbumin, 10% serum (ged serum) og 0,5% Tween-20 i PBS og forsigtigt triturate at blande. Inkuber rør på RT for 30 minutter på en orbitalryster.
- Cellerne vaskes en gang med PBS og Fjern supernatanten fra rørene fuldstændigt, efterlader kun pellet.
- Tilsæt 100 µL fortyndede sekundær antistof (ged anti-kanin FITC konjugeret på 1: 500 koncentration) i PBS til celle pellet og forsigtigt hakkede for at blande. Inkuber rør på RT for 30 min på en shaker i mørke.
- Vaske prøver 2 x med PBS og derefter vaskes en gang med flow buffer. Der centrifugeres og genopslæmmes celler i ca. 150 µL af flow buffer for flow forskellige analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikro-dissektion, celle Isolation og Neurosphere kultur. Her præsenterede vi en hurtig og effektiv metode for musen E13 hjernen mikrokirurgi og isolation af neurale stamceller. Denne artikel viser, at det er muligt at fjerne hele hjernen fra en E13 mus embryo kraniet gennem en fin brud i frontal fontanelle. Med denne metode, hjernen lider mindre skade og det er muligt at isolere celler fra forskellige dele af hjernen. De høstede celler kunne generere neurospheres i NSC medium bFGF og EGF, og de er 150-200 µm størrelse i diameter efter syv dage i kulturen (figur 1A). Neurospheres blev adskilt ved hjælp af 0,05% trypsin/EDTA for at gøre dem enkelt celler og deres kultur på Laminin/Poly-L-ornithin-belagt retter i mangel af bFGF og EGF viste at de neurite som grene og vise neuronal morfologi efter 7-10 dage (Figur 1B).
Flow flowcytometri Assay resultater. Som vist i figur 2A, 95±3.16% af de celler, der udgør neurospheres Nestin positivt, hvilket er et kendt mærke for NSCs (figur 2A). Assays på enkelt celle kulturperler NSCs ved hjælp af β-tubulin-III og GFAP antistoffer afslørede, at de fleste af NSCs ved at dyrke celler på bestrøget overflader, vil differentiere mest til neuroner (94±2.67%) og mindre til gliaceller (5±2.46%).
Figur 1 : Repræsentant billeder fra primære E13 mus embryo neurale stamceller. A. kulturperler neurospheres efter 7 dage. B. differentiering af neurale stamceller til at modne neuroner efter 7-dages kultur på Laminin/Poly-L-ornithin belagt retter i NSC medium i mangel af bFGF og EGF. Skala søjler repræsenterer 20 µm i A og 50 µm i B. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Populationer af Nestin (A), βtubulin-III (B) og GFAP (C) positive celler blev kontrolleret af flow flowcytometri assay. A. de fleste af cellerne (95±3.16%) konstruere neurospheres Nestin positive. B. Assay på selvklæbende kulturperler NSCs på Laminin/Poly-L-ornithin overtrukne plader i mangel af EGF og bFGF viste, at 94±3.67% af celler blev βtubulin-III positive og 5±2.46% udtrykt GFAP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af en passende kilde til neurale stamceller er meget vigtigt for neuroforskere. Neurale stamceller kunne høstes fra forskellige områder af hjernen, embryo og de kan generere specifikke typer for neuroner og gliaceller. Der er flere metoder til induktion af differentiering af neurale stamceller at tilskynde dem til at generere modne neuroner og gliaceller. Der er talrige rapporter viser, at under specifikke dyrkningsbetingelserne og trofiske faktor regimenter, kunne de skabe neuroner14, oligodendrocytes15,16 og astrocytter17i vitro. Baseret på data fra litteratur, giver ganglionære eminence en god kilde til neurale stamceller med potentiale til at generere forskellige typer af hæmmende og excitatoriske neuroner som GABAergic18 og Dopaminerg19 typer. Derfor, baseret på den naturlige tendens til disse NSCs til generering af højere sats af GABAergic neuroner, de giver en passende kilde for studier på hæmmende neuroner.
I denne artikel forbedret vi hjernen microdissection teknik til at trække hele hjernen fra E13 mus embryo kraniet mens øve mindre skade på hjernevævet. For at opnå den højeste sats af NSCs fra dyrs hjerne, er det anbefalelsesværdigt at reducere varigheden af kirurgisk tid og udføre nøglepunkter som omgivende temperatur og sterile forhold.
Der er nogle vigtige trin til vellykket præstation af denne procedure. Animalske kirurgi og uterin dissektion skal ske så hurtigt som muligt og i et rent værelse. Bruge UV lys til at rense rummet før Operation hvis det er tilgængeligt. For at reducere forurening, overføre uterin horn til den koniske rør indeholdende 25 mL koldt HEPES-MEM buffer og lukke fælles landbrugspolitik. Brug ikke en petriskål i dette trin, da det mangler et skruelåg. Røret hjælper med at undgå medium lækage fra fælles landbrugspolitik og hjælper med at suge de uterine horn i HEPES-MEM buffer. Sætte æggelederen under laminar kølerhjelmen og før du overfører den uterine til en petriskål, skyl uterin mindst 3 x med kolde HEPES-MEM buffer. Dette trin reducerer effektivt risikoen for mikrobiel kontaminering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nogen interessekonflikt erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af instituttets Royan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2 Unit2D.6 (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neuroscience. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
