Summary
Ici, nous présentons une nouvelle technique microchirurgicale pour isoler des cellules souches neurales de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire.
Abstract
Les cellules souches neurales (CNS) sont multipotentes et peut donner lieu à trois types cellulaires majeurs du système nerveux central (CNS). La culture in vitro et l’expansion des CNS fournissent une source appropriée de cellules pour les chercheurs en neurosciences étudier la fonction des neurones et des cellules gliales ainsi que leurs interactions. Il existe plusieurs techniques signalés pour isoler des cellules souches neurales du cerveau mammifère adulte ou embryonnaire. Pendant l’opération microchirurgie pour isoler des CNS de différentes régions du SNC embryonnaire, il est très important réduire les dommages au cerveau des cellules pour obtenir le taux élevé de cellules souches vivantes et extensibles. Une technique possible pour la réduction du stress au cours de l’isolement de ces cellules du cerveau d’embryon de souris est la réduction du temps chirurgical. Ici, nous démontrons une technique mise au point pour l’isolement rapide de ces cellules de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire. Procédures chirurgicales incluent récolte d’embryons de souris13 E de l’utérus, coupant la fontanelle frontale de l’embryon avec une pointe d’aiguille tordue, extraire le cerveau du crâne, microdissection du cerveau isolé de récolter l’éminence ganglionnaire, dissociation du tissu récolté dans le milieu du NSC pour obtenir une suspension de cellules du même et enfin électrodéposition de cellules en suspension pour générer des neurospheres.
Introduction
Des cellules souches neurales (CNS) résident dans différentes régions du cerveau adulte et de l’embryon, et ils ont tendance à générer différents types de neurones et cellules gliales1. Les zones sous-ventriculaire dans le cerveau des mammifères adultes2 et éminence ganglionnaire dans le cerveau de l’embryon sont NSC riches régions3. Dans le développement du cerveau, l’éminence ganglionnaire fournit la plupart des interneurones corticaux et particulièrement GABAergique interneurones3. Il y a aussi des méthodes moins invasives pour la production de cellules souches neurales de cellules souches embryonnaires (CSE) ou utiliser des cellules souches pluripotentes induites (CISP) qui réduisent la demande de l’animal. Malgré le fait que générer des CNS d’ESCs ou CISP est possible4,5, il a ses avantages et inconvénients par rapport à l’isolement des cellules souches neurales de l’adulte ou l’embryon cerveau6,7, 8. Les protocoles pour induire la différenciation des ces et CISP vers phénotypes neurones sont toujours temps et coût de consommation et le taux de succès (70-80 % Nestin cellules positives)5 est plus faible comparativement à isolement direct des CNS le cerveau animal ( plus de 99 % Nestin cellules positives)9. En outre, les cellules souches perdent leur tendance de stabilité et de la différenciation génétique après plusieurs passages10,11. Même s’il existe d’autres nouveaux rapports sur la conversion directe de cellules somatiques en CNS, ces cellules sont génétiquement modifiées et ne sont pas facilement accessibles dans chaque laboratoire12. Par conséquent, il y a toujours une grande demande pour isoler des cellules souches neurales dans le cerveau de l’animal ; Il est possible de réduire la quantité d’utilisation de l’animale en améliorant les techniques chirurgicales. En réduisant le temps chirurgical et en améliorant les techniques, il est possible de garder les cellules des dommages et d’obtenir le taux le plus élevé des CNS de chaque animal.
Ici, nous présentons une technique simplifiée et reproductible pour l’isolement de cellules souches neuronales du cerveau de souris E13 embryons.
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Protocol
Toutes les chirurgies et les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité de l’éthique animale de l’Institut de Royan, Téhéran, Iran.
1. préparation des Instruments chirurgicaux, lavage tampon (HEPES-MEM), milieux de Culture cellulaire et plaques de Culture cellulaire
- Stériliser les instruments chirurgicaux (ciseaux, poignée de lame de bistouri Swann-Morton et forceps) par autoclavage en fonction sur les lignes directrices de stérilisation systématique.
- Préparer un volume suffisant de tampon HEPES-MEM (environ 100 mL est suffisant pour chaque souris gravides). Ajouter des concentrations élevées d’antibiotiques (pénicilline/streptomycine 10 %) dans la mémoire tampon HEPES-MEM. Cette concentration d’antibiotiques est nécessaire pour réduire le risque de contamination microbienne.
- Pour préparer un tampon HEPES-MEM, ajouter 0,5958 g de poudre HEPES dans 100 mL de MEM (milieu minimum essentiel) et bien mélanger. Ajuster le pH de 7,3 à 7,4 et filtrer le support filtre 0,22 µm.
- Faire NSC moyen moyen contenant des neurobasal (NB), additionné de 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, Supplément de x N2 100 1 % ou 1 % B27 supplément (sans vitamine A), 1 U/mL héparine, 1 % L-glutamine, acide aminé à 1 % non essentiels (NEAA), 1 % pénicilline/streptomycine, et 0,1 mM β-mercaptoéthanol.
2. animale chirurgie et Micro-Dissection
- Anesthésier une souris enceinte le 13e jour de gestation (ici, utiliser la souche de souris BALB/c âgés de 4 mois) par injection intrapéritonéale de kétamine-xylazine, 100 mg/kg et 10 mg/kg de poids corporel respectivement.
- Confirmer une anesthésie profonde en exerçant un stimulus douloureux (par exemple, pincer avec une pince) à pied de l’animal et lorsqu’il n’y a aucun réflexe de la douleur, l’animal de sacrifice par dislocation cervicale.
- Désinfectant et nettoyer la peau de l’abdomen en pulvérisant de l’éthanol à 70 %.
- Contrôle de la peau de l’abdomen et ensuite couper la peau et l’aponévrose sous-jacente avec des ciseaux pour découvrir la cavité abdominale et les cornes utérines.
- Enlever les cornes utérines contenant les embryons en ciseaux et de les transférer dans un tube conique de 50 mL contenant 25 mL de tampon HEPES-MEM froid.
- Placer le tube conique sous la hotte à flux laminaire et ouvrir le bouchon sous le capot. Ressortir les cornes utérines de la tube et rincer 3 fois avec assez de volume de la mémoire tampon HEPES-MEM froid fraîche pour éliminer les débris et le sang.
- Transférer le tissu utérin dans une boîte de Pétri contenant 7 à 10 mL de tampon HEPES-MEM froid de 10 cm. Ouvrez les cornes utérines à l’aide de fins ciseaux et transfert embryons à une autre boite contenant 7 à 10 mL de tampon HEPES-MEM froid. Mettre ensuite le plat de 10 cm avec des embryons sous le microscope à dissection pour l’opération micro-dissection.
- Plier la pointe d’une aiguille de seringue 25-27 G en poussant sa pointe sur une poignée de lame de bistouri en acier. Pliez la pointe de l’aiguille jusqu'à ce que la pointe est pliée à un angle de 70-90°. Vérifier la pointe de l’aiguille sous le microscope à dissection de voir le coude à la pointe de l’aiguille.
NOTE : Bien entendu, les embryons ont une position latérale dans le plat. - Sans changer leur position, tenir le cou et le corps de l’embryon avec une pince fine, puis insérez la partie pliée de la pointe de l’aiguille dans la fontanelle frontale de la tête de l’embryon. Il y aurait des petits saignements ou un caillot de sang là.
- Déplacer l’extrémité de l’aiguille superficiellement. Tandis que la partie pliée est à l’intérieur de la courbure vers le front, puis vers l’arrière de la tête, assurez-vous de couper à travers la peau et le crâne et ne pas endommager le cerveau sous-jacent.
- Pousser la peau avec la pointe de l’aiguille latéralement pour découvrir le cerveau et insérez l’aiguille de la face latérale de la peau de la zone située sous le cerveau. Enlever le cerveau du crâne en le poussant à sortir du crâne disséqué.
- Stabilisez le cerveau à l’aide de la pince courbée et couper le cortex de chaque hémisphère, à l’aide de micro-ciseaux pour exposer l’éminence ganglionnaire.
- Tenez le cerveau et placez l’éminence ganglionnaire disséqué dans le tube à centrifuger 15 mL contenant des cellules souches neurales moyen. L’éminence ganglionnaire apparaît clairement avec ses parties médiane et latérales.
- Répétez cette procédure jusqu'à ce que tous les cerveaux ont été disséqués au micro.
- Couper l’éminence ganglionnaire disséqué en plaçant l’embout de la pipette contre le fond du tube. Pipetter la suspension haut et bas de 4 à 5 fois pour briser le tissu pour une suspension monocellulaire.
- Centrifuger la suspension à 110 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA.
- Incuber la suspension cellulaire dans un 37 ° C pendant 10 min et ajouter ensuite un volume équivalent d’inhibiteur trypsique du soja (25 µg/mL) pour arrêter l’activité de la trypsine. Pipetter la suspension cellulaire haut et bas pour s’assurer que la trypsine a été totalement inactivée.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 110 g x 5 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu complet de NSC et compter le nombre de cellules.
- Plaque des cellules (2 x 105 cellules/mL) au milieu de NSC dans la fiole de vitroplants de taille appropriée. Transférer 5 mL de T25, 20 mL de T75 et 40 mL et flacons T175.
Remarque : Neurospheres apparaîtra après culture de 3 jours à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Après 6-7 jours, les sphères doivent mesurer entre 150 à 200 µm de diamètre et seront prêts pour la sous-culture. En cultivant des CNS primaires 1 million après sept jours, le nombre de cellules passera à 3 millions.
3. trypsinisation et passage des Neurospheres
- À la sous-culture du neurospheres, transfert de neurospheres suspendue au milieu dans le tube à centrifuger, centrifuger à 110 x g pendant 5 min et ensuite jeter le surnageant. Ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA et incuber à 37° C pendant 10 min.
- Inactiver la trypsine utilisant inhibiteur trypsique du soja et pipette le neurospheres doucement jusqu'à et faire les simples cellules.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 110 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de milieu de NSC. Ces cellules sont prêtes pour la prochaine sous-culture ou la culture laminine et revêtu de Poly-L-Ornithine surfaces pour des expériences avancées.
- Pour la prochaine sous-culture, transfert CNS dans le nouveau ballon (suivre étape 2,8) et leur culture dans le milieu de la NSC. Pour l’induction de la culture de la différenciation neuronale CNS dans le milieu du NSC en l’absence de bFGF et EGF sur laminine et Poly-L-Ornithine enduit plaques (Figure 1 b).
- Pour le revêtement, entièrement recouvrir la surface de culture de cellule en ajoutant un volume suffisant de solution diluée de poly-L-ornithine (25 µg/mL) à la plaque de culture cellulaire et incuber à 37 ° C pendant 2 h.
- Aspirer la poly-L-ornithine et rincez les bien 2 x avec du PBS. Ajouter un volume suffisant de 5 µg/mL laminine pour complètement couvrir la surface de culture et incuber à 37 ° C pendant 2 h. aspirer la laminine avant ensemencement des cellules ou stocker plaque à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
4. flow Cytometry Assay
Remarque : L’expression des marqueurs spécifiques de la CNS, les neurones et les cellules gliales peut être mesurée par cytométrie de flux test13. Le protocole est basé sur Menon et al.,13 , avec des modifications mineures.
- Dissocier des neurospheres ou détacher CNS cultivées de plaques revêtues par trypsinisation pour rendre les cellules individuelles. Ajouter 500 µL de tampon de fixation (2 % paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS) à 100 µL de la suspension cellulaire (environ 1 million de cellules est pour colorer avec chacun des anticorps) et puis incuber les tubes à RT pendant 15 min.
- Cellules de lavage en ajoutant 1 mL de PBS au tube et centrifuger à 110 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire, laissant environ 100 µL dans le tube.
- Permeabilize des cellules avec Tween-20 (0,7 % Tween-20 dans du PBS) en ajoutant 500 µL de tampon de Tween-20 à 100 µL de suspension cellulaire. Incuber les tubes à RT pendant 15 minutes dans un agitateur orbital (100 tr/min).
- Répétez la centrifugation et le lavage de PBS. Retirer le liquide surnageant des tubes complètement, laissant seulement le culot. Ajouter 100 µL d’anticorps primaires dilués (lapin anti souris βtub-III, GFAP et Nestin anticorps à concentration de 1 : 200) dans un tampon de dilution contenant 1 % d’albumine sérique bovine, 10 % de sérum (sérum de chèvre) et 0,5 % Tween-20 dans du PBS et doucement triturer pour mélanger. Incuber les tubes à RT pendant 30 min dans un agitateur orbital.
- Laver les cellules une fois avec du PBS et retirer le liquide surnageant des tubes complètement, laissant seulement le culot.
- Ajouter 100 µL d’anticorps secondaire dilué (chèvre anti lapin FITC conjugué à une concentration de 1/500) dans du PBS pour le culot cellulaire et doucement triturer pour mélanger. Incuber les tubes à RT pendant 30 min sur un agitateur dans le noir.
- Laver les échantillons 2 x avec PBS et lavage puis une fois avec le tampon du flux. Centrifuger et remettre en suspension les cellules dans environ 150 µL de tampon de flux pour analyse cytomètre en flux.
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Representative Results
Micro-Dissection, l’isolement de cellules et Culture Neurosphère. Ici, nous avons présenté une méthode rapide et efficace pour la souris E13 cerveau microchirurgie et isolement des cellules souches neurales. Cet article montre qu’il est possible d’enlever tout le cerveau d’un crâne d’embryon de souris E13 à travers une rupture fine à fontanelle frontale. Avec cette méthode, le cerveau subit moins de dégâts et il est possible d’isoler des cellules provenant de différentes parties du cerveau. Les cellules récoltées pourraient générer des neurospheres en NSC en présence de bFGF et EGF, et ils sont 150 à 200 µm taille de diamètre après sept jours de culture (Figure 1 a). Neurospheres sont dissociés en utilisant 0.05 % trypsine/EDTA pour les rendre cellules individuelles et leur culture sur la vaisselle laminine/Poly-L-Ornithine-enduit en l’absence de bFGF et EGF a montré qu’elles s’étendent des neurites comme branches et montrent une morphologie neuronale après 7-10 jours (Figure 1 b).
Flow Cytometry Assay résulte. Comme le montre la Figure 2 a, 95±3.16 % des cellules constituant les neurospheres étaient Nestin positif, ce qui est un marqueur connu de CNS (Figure 2 a). Essais sur la seule cellule cultivées CNS à l’aide de la β-tubuline-III et anticorps GFAP a montré qu’en cultivant des cellules sur les surfaces revêtues, la plupart des CNS permet de différencier la plupart aux neurones (94±2.67 %) et moins pour les cellules gliales (5±2.46 %).
Figure 1 : Des images représentatives du primaire E13 souris embryon des cellules souches neurales. A. cultivés neurospheres après 7 jours. B. différenciation des cellules souches neurales aux neurones matures après culture de 7 jours sur Laminin/Poly-L-ornithine enduit plats dans le milieu du NSC en l’absence de bFGF et EGF. Barres d’échelle représentent 20 µm à A et 50 µm de B. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les populations de cellules positives Nestin (A), βtubulin-III (B) et GFAP (C) ont été vérifiées par dosage de cytométrie en flux. A. la plupart des cellules (95±3.16 %), construction de la neurospheres était Nestin positive. B. test sur adhésif cultivées CNS sur plaques de laminine/Poly-L-Ornithine enduit en l’absence de l’EGF et bFGF a révélé que % 94±3.67 des cellules ont été βtubulin-III positif et 5±2.46 % exprimés GFAP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
À l’aide d’une source de cellules souches neuronales est très important pour les chercheurs en neurosciences. Des cellules souches neurales pourraient être récoltés de différentes zones du cerveau de l’embryon et qu’ils peuvent générer des types spécifiques de neurones et les cellules gliales. Il existe plusieurs méthodes pour l’induction de la différenciation des cellules souches neurales de les amener à générer des neurones matures et les cellules gliales. Il y a de nombreux rapports indiquant que dans des conditions de culture spécifique et régiments de facteur trophique, ils pourraient générer des neurones14, oligodendrocytes15,16 et17astrocytesin vitro. Selon les données de la littérature, éminence ganglionnaire constitue une bonne source de cellules souches neuronales ayant le potentiel de générer différents types de neurones inhibiteurs et excitateurs tels que les types de19 18 et dopaminergique GABAergique. Par conséquent, basé sur la tendance naturelle des ces CNS pour génération de taux plus élevé de neurones GABAergiques, ils fournissent une source convenable d’études sur les neurones inhibiteurs.
Dans cet article, nous avons amélioré la technique de microdissection de cerveau pour retirer tout le cerveau du crâne E13 souris embryon tout en exerçant moins de dommages aux tissus cérébraux. Pour obtenir le taux le plus élevé des CNS de cerveau animal, il est recommandé de réduire la durée de temps chirurgical et d’exécuter les points essentiels tels que la température ambiante et des conditions stériles.
Il y a certaines étapes critiques pour la réussite de cette procédure. La chirurgie animale et la dissection utérine doivent se faire aussi rapidement que possible et dans une pièce propre. Lumière UV permet de nettoyer la salle avant la chirurgie, si elles sont disponibles. Pour réduire le risque de contamination, transférer les cornes utérines dans le tube conique contenant 25 mL de tampon HEPES-MEM froid et refermer le bouchon. N’utilisez pas une boîte de Pétri lors de cette étape, car il manque un bouchon à vis. Le tube permet d’éviter les fuites moyen du bouchon et contribue à faire tremper les cornes utérines dans un tampon HEPES-MEM. Mettre le tube utérin sous la hotte laminaire et avant de transférer l’utérus dans une boîte de Pétri, rincer utérine au moins 3 x avec tampon HEPES-MEM froid. Cette étape a effectivement réduit le risque de contamination microbienne.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’Institut de Royan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
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