Summary
Presenteren we een fluorogenic peptide decollete assay waarmee een snelle screening van de proteolytic activiteit van proteasen op peptiden die vertegenwoordigen de breukzijde van virale fusion peptiden. Deze methode kan ook worden gebruikt op elke andere aminozuur motief binnen een eiwit sequentie om te testen voor de protease-activiteit.
Abstract
Envelop-virussen zoals coronaviruses of influenza virus vereisen Proteolytische splitsing van hun fusieproteïne te kunnen infecteren de gastheercel. Vaak virussen vertonen van cel- en weefseltransplantaties tropisme en zijn aangepast aan de specifieke cel of een weefsel proteasen. Bovendien, deze virussen kunnen leiden tot mutaties of invoegingen in hun genoom tijdens replicatie die invloed kan hebben op het splijten, en aldus kan bijdragen tot aanpassingen naar een nieuwe host. Hier presenteren we een fluorogenic peptide decollete assay waarmee een snelle screening van peptiden nabootsen van de breukzijde van virale fusie-eiwitten. De techniek is zeer flexibel en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de proteolytic activiteit van een enkele protease op vele verschillende ondergronden, en daarnaast ook hierdoor exploratie van de activiteit van meerdere proteasen op één of meer peptide substraten. In deze studie gebruikten we het nabootsen van de motieven van de site splijten van het coronavirus spike eiwit peptiden. Wij testten menselijke en kameel afgeleid Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) om aan te tonen dat een- en tweepersoonskamers vervangingen in de breukzijde kunnen wijzigen van de activiteit van furin en decollete efficiëntie drastisch te veranderen. Wij ook gebruikt deze methode in combinatie met bio-informatica aan het testen van furin decollete activiteit van feline coronavirus spike eiwitten uit verschillende serotypes en stammen. Deze peptide gebaseerde methode is minder arbeid- en tijd intensief dan conventionele methoden voor de analyse van proteolytic activiteit voor virussen en resultaten kunnen worden verkregen binnen een enkele dag.
Introduction
Virale fusion met het celmembraan host is een cruciale stap in de levenscyclus van envelop-virussen en inwerkingtreding van de cel en de replicatie van het virus vergemakkelijkt. Virussen bezitten meestal een gespecialiseerde proteïne (of eiwitten) die bindt aan receptoren op de celmembraan van de host en activeert het virus-cel membraan fusion1. Virale fusion eiwitten zijn gegroepeerd in drie klassen (I-III)1. Een aantal virussen die momenteel een grote zorg voor de volksgezondheid, zoals influenza-virus (namens een langdurige zoönotische opkomst van vogels) en Middle East Respiratory Syndrome-coronavirus (MERS-CoV) (die een recente zoönotische opkomst van kamelen), gebruik maken van de zogenaamde klasse I fusion proteïnen, waarvoor proteolytic processing door gastheer proteasen, om te oefenen hun activiteit fusogenic2. Evenzo, feline coronavirus (FCoV), die een koploper onder de ziekten bedreiging voor wilde en binnenlandse katten is, ook beschikken over een klasse ik fusieproteïne. Klasse I virale fusion eiwitten worden meestal gesynthetiseerd als een voorloper van de uncleaved, en in het algemeen bestaan uit twee domeinen die verantwoordelijk zijn voor de receptor bindend en triggering de fusion gebeurtenis respectievelijk. Tot op heden is de influenza hemagglutinine (HA) de beste begrepen fusieproteïne en tal van studies hebben haar mechanistische rol in host cel ingang en fusion3beschreven. In dit geval splitsing van de fusieproteïne treedt op bij een bepaalde volgorde of de breukzijde binnen HA en in combinatie met pH-afhankelijke conformationele wijzigingen, resultaten in het blootstelling van de virale fusion peptide1,2.
Peptide van de fusie en de voorgaande protease erkenning volgorde zijn kritisch voor de pathogeniteit en de aanpassing van de gastheer van het virus. Wijzigingen in de protease erkenning volgorde kunnen wijzigen decollete aanzienlijk met potentieel dramatische gevolgen voor het virus en de host-4. Aan de ene kant kan het trekt decollete en dus de hele levenscyclus van het virus te elimineren. Maar aan de andere kant, een mutatie kan verhogen het substraat specificiteit voor een bepaalde protease en/of toestaan dat een "nieuwe" protease te klieven van het fusie-eiwit. Vervolgens kan dit ook het uitbreiden van de cel- en weefseltransplantaties tropisme zoals waargenomen, bijvoorbeeld met influenza virus subtypen5,6. Meestal lage pathogeniteit aviaire influenza (LPAI) virussen en meest menselijke influenzavirussen zijn beperkt tot de gastro-intestinale of respiratoire tractus vanwege de beperkte lokalisatie van de proteasen die hen activeren. Typisch, de fusion peptide van dergelijke eiwitten HA wordt voorafgegaan door een vier-amino acid reeks die bestaat uit 1-2 niet-opeenvolgende fundamentele aminozuren, die wordt herkend door trypsine-achtige serine proteasen zoals trypsine, matriptase of TMPRSS27, 8. Wanneer het virus verwerft invoegingen of mutaties die de breukzijde omzetten in een meerwaardige site, laat het furin te activeren van de HA en te kunnen leiden tot een veel meer ernstige systemische infectie6,9. Deze virussen zijn hierna aangeduid als hoge pathogeniteit virus van aviaire influenza (HPAI), gekenmerkt door H5N1 stammen.
In tegenstelling tot influenza HA hebben veel coronaviruses, zoals MERS-CoV, twee verschillende decollete sites binnen hun piek-eiwit. De S1/S2 site scheidt de N-terminale receptor bindend domein (S1) van het domein fusion C-terminal (S2), met een tweede breukzijde, genaamd S2', stroomafwaarts van de S1/S2 site, in de nabijheid van de fusion peptide10. Er werd gesuggereerd dat de sites zijn gekloofd opeenvolgend, bij S1/S2 gevolgd door S2'. In tegenstelling tot de meeste influenza virusstammen, het MERS-CoV S eiwitten S1/S2 en S2 HA' sites kunnen worden herkend door proteasen van de familie van de proprotein convertase (PC), zoals furin. Leden van deze familie klieven op gepaarde fundamentele residuen met het motief R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. In het algemeen worden de aminozuren stroomopwaarts van de breukzijde aangeduid als P1, P2, P3, enz. geteld vanaf de breukzijde en stroomafwaarts de aminozuren zijn aangewezen als P1', P2', P3', enz. 11. FCoV stammen kunnen laten een enkele of een dubbele breukzijde. Zoals MERS-CoV, sommige FCoV spanningen ook bezitten twee decollete sites (S1/S2 en S2') in hun S-eiwit. Dit kenmerk is echter exclusief serotype ik FCoVs (clade A). Daarentegen hebben leden van de groepering serotype II (clade B) slechts een enkele breukzijde (S2')2,12. Verschillende proteasen hebben gesuggereerd om te klieven FCoV decollete vindplaatsen, waaronder furin, trypsine-achtige proteasen en cathepsin. Er wordt geopperd dat de S-proteïne van darmen FCoV (ook bekend als katachtige darmen coronavirus of FECV) dreigt te worden gekloofd door furin op de site van S1/S2 en mutaties in deze site (zo goed als op S2') leidt tot veranderingen in protease eisen. Deze mutaties zijn geassocieerd met veranderingen in de tropisme en pathogeniteit van deze virussen, waardoor het virus tot systemische en macrofaag-tropic (ook bekend als feline infectueuze peritonitis virus of FIPV)13.
Virussen introduceren natuurlijk mutaties in hun genoom tijdens elke replicatiecyclus en vaak nieuwe subtypen en stammen van influenza, MERS-CoV en FCoV zijn beschreven14,15,16. Als onderdeel van een snelle evaluatie beoordelen het gevaar voor de volksgezondheid van opkomende virussen, is het essentieel om te onderzoeken van wijzigingen in de breukzijde en hoe beïnvloedt het aantal proteasen activeren van deze virussen. Hier beschrijven we een peptide gebaseerde bepaling waarmee een zeer snelle beoordeling van de invloed van de splitsing site veranderingen in MERS-CoV S eiwit op de specificiteit van het substraat van een bepaalde protease en snel verschillende proteasen om hun vermogen om het klieven van het scherm een gegeven of meerdere reeksen4. In een tweede reeks van experimenten gebruikten we de techniek om te bepalen van de furin decollete activiteit over verschillende FCoV serotypes en stammen.
De peptiden in deze test gebruikt worden gewijzigd met de fluorescentie resonance energy transfer (FRET) paar, 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) op de N-terminus en N-2,4-dinitrophenyl (DNP) op de C-terminus. Tijdens de test, MCA is enthousiast en stoot lichtenergie die door DNP is uitgeblust, zolang het paar in de buurt met elkaar zijn verbonden. Decollete optreedt, echter DNP is niet in staat om quench de uitstoot niet meer als het kan worden gelezen door de fluorescentie-afleesapparaat. De veranderingen in de fluorescentie wordt gemeten tijdens het experiment om te bepalen van de peptide decollete tarief, en voor de berekening van de snelheid waarmee de protease cleaves de specifieke peptide (ook bekend als Vmax)17.
Ten einde de peptiden, het gen van de respectieve fusieproteïne moet hebben zijn sequenced en/of ter beschikking gesteld in een database. De methode is echter minder arbeid-intensieve en dure dan conventionele methodes die gewoonlijk het klonen van de fusie-eiwit-gen in expressievectoren vereisen te drukken in zoogdiercellen analyseren het splijten. Van begin tot eind, kan dit duren enkele dagen tot enkele weken terwijl het testen van de peptide hier gepresenteerd kunnen worden gedaan binnen één dag zo spoedig peptiden en proteasen beschikbaar zijn. De installatie van de test duurt tussen de 5 en 30 minuten afhankelijk van het aantal monsters en de runtime in de fluorescentie-afleesapparaat is 1 h. analyse van de gegevens duurt maximaal 2 uur weer afhankelijk van de grootte van de steekproef.
Protocol
1. ontwerpen en voorbereiden van de peptiden
- De volgorde van de fusie-eiwit van belang van een openbare database zoals NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) of de virus pathogen database (https://www.viprbrc.org) te verwerven. Kiest de protease erkenning site voorafgaand aan de fusie peptide en 2-3 aminozuren bedrijven stroomopwaarts en stroomafwaarts van deze reeks.
- Bij het bestellen van de peptiden, deze bewerken met de FRET paar 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) op de N-terminus en N-2,4-dinitrophenyl (DNP) op de C-terminus.
Opmerking: Meerdere leveranciers bieden deze wijzigingen. Prijs en levertijd is afhankelijk van de leverancier van keuze. Alternatieve wijzigingen bestaan echter die verschillen in gevoeligheid en aanpassingen van de afleesapparaat in termen van golflengtes. - Resuspendeer de peptide overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikanten door pipetteren zachtjes op en neer. Bijvoorbeeld resuspendeer peptiden in 70% ethanol tot de uiteindelijke concentratie van 1 mM.
- Desgewenst voegt toe de buis met de peptide en het oplosmiddel in een ultrasoonapparaat bad, totdat het is volledig geresuspendeerde als de peptide doet niet zeer goed resuspendeer door pipetteren.
- Aliquot de peptide in lichte dempend of resistente buizen om te voorkomen dat de peptide bleken. Houd aliquoot maten klein om te voorkomen dat meerdere vorst/dooi cycli (bijvoorbeeld 100 µL). Winkel aliquots bij-20 ° C.
2. voorbereiding van de fluorescentie-afleesapparaat
- Zet de plaat lezer en wacht totdat de zelftest is voltooid.
- Open de besturingssysteemsoftware op de aangesloten computer en zorg ervoor dat het is verbonden met de afleesapparaat.
- Open de temperatuur instelling en ingesteld op 30 ° C (of de vereiste temperatuur voor optimale prestaties voor de protease).
- Klik op controle | Instrument Setup aan het opzetten van het experiment.
- Kies kinetische.
- Selecteer fluorescentie.
- Voer golflengten van excitatie en emissie: 330 nm en 390 nm respectievelijk.
- Automatische licht-donkerscheiding te deselecteren.
- Selecteer gemiddeld, normale gevoeligheid.
- Kies een runtime van 1 h voor de assay en selecteer een meting elke 60 s.
- Set 5 s mengen voordat de eerste meting en 3 s voor iedere meting
- Selecteer putten om te lezen en de test starten.
3. voorbereiding van de test
- Bereid de assay buffer door het berekenen van de juiste hoeveelheden voor elk ingrediënt en toe te voegen. Voor furin, maak buffer bestaande uit 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-mercaptoethanol, 5% Triton X-100. Voor trypsine fosfaatgebufferde gebruik standaard zoutoplossing (PBS).
Opmerking: Volumes van 10 mL of minder volstaan. Afhankelijk van de protease(s) gebruikt in de test varieert de buffer. - Chill de buffer op ijs.
- Plaats de assay-plaat op ijs met een dunne metalen plaat onder aan de koeling van de steun en stabiliteit. Gebruik een solid zwart polystyreen 96-wells-plaat met een vlakke bodem en niet-behandelde.
Opmerking: Het is essentieel om te zwarte platen gebruiken om te voorkomen dat TL "lekkage" uit aangrenzende putten. - Berekenen van de juiste hoeveelheid protease voor elke reactie op basis van eerdere publicaties of experimentele gegevens toe te voegen. Voor furin, gebruikt u 1 eenheid per reactie die overeenkomt met 0,5 µL. Gebruik voor trypsine, 0,5 µL van 160 nM TPCK trypsine.
- Per monster 3 technische replicatieonderzoeken per assay in een totaal volume van 100 µL per monster te bereiden.
Opmerking: Het was experimenteel geëvalueerd dat het niet een verschil maakt of de pipetteren wordt uitgevoerd onder normale lichtomstandigheden of gedimd licht. De peptiden moeten echter niet worden blootgesteld aan licht voor een langere periode van tijd. - Pipetteer de juiste hoeveelheid assay buffer (94,5 µL zoals beschreven in stap 3.1) in elk putje.
- De protease toevoegen aan elk putje. Gebruik voor zowel furin als TPCK trypsine, 0,5 µL per monster. Toevoegen aan 6 putjes (3 putten voor een blanco-controle) en 3 wells voor een peptide-besturingselement, 0,5 µL buffer in plaats van de respectieve protease.
- De peptide toevoegen om een eindconcentratie van 50 µM aan elk putje met uitzondering van de blanco-controle. In dit geval Pipetteer 5 µL peptide voorbereid zoals beschreven onder stap 1.3. Voeg toe 5 µL van buffer aan de blanco-controle in plaats van peptide.
Opmerking: Verschillende concentraties van de peptide werden aanvankelijk getest met de concentraties van de beschreven enzym om ervoor te zorgen dat de enzymen waren verzadigd. - Plaats de plaat in de fluorescentie-afleesapparaat en klikt u op start.
4. de gegevensanalyse
- Sla het bestand experiment.
- Klik op exporteren en het bestand exporteren als een .txt.
- Het txt-bestand importeren in een werkblad.
- Voor elke technische repliceren per monster, maakt u een grafiek plotten van de relatieve fluorescerende eenheden (RFU) op de y-as tegen de tijd op de x-as (aanvullende figuur 1).
- Selecteer het gegevensbereik waar de grafiek zich in een lineaire reeks en het dichtst bij het begin van de verhoging van fluorescentie bevindt.
- De geselecteerde gegevens in een tweede grafiek uitzetten en een lineaire trendlijn toevoegen.
- Selecteer in de opties van de trendlijn Vergelijking weergeven op grafiek. De vergelijking toont de Vmax.
- Bereken dat het gemiddelde Vmax voor elk monster uit de 3 technische repliceert.
- Herhaal het experiment tweemaal meer om te verkrijgen van 3 biologische replicatieonderzoeken.
- Bereken de standaarddeviatie op basis van de gegevens uit 3 onafhankelijke biologische repliceert.
Representative Results
In het eerste deel van deze studie, gebruikten we peptiden die de S2 vertegenwoordigen ' breukzijde van drie verschillende MERS-CoV S eiwitten: uit de prototypische EMC/2012 menselijke stam (Genbank AFS88936.1) en twee geselecteerd kameel afkomstige MERS-CoVs, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) en Mor215 (Genbank AVN89324.1) stammen, geïsoleerd in Egypte en Marokko, respectievelijk (tabel 1)16,18.
In vergelijking met de EMC/2012-stam, de HKU205-S2' breukzijde heeft twee mutaties in de P1 en P2' posities die kon potentieel effect hebben op haar erkenning furin en wijzigen de splitsingsproducten efficiëntie (tabel 1). Bovendien, we waren geïnteresseerd om te onderzoeken of en de invloed van elke individuele mutatie gevonden in de HKU205-stam op furin decollete. Wij, daarom twee peptiden waar de individuele substituties werden ingevoerd in de EMC/2012 peptide volgorde opgenomen (EMC/2012 mutA-S S2' en EMC/2012 mutS-ik S2') (tabel 1). Furin was in staat om het klieven van de EMC/2012 peptide efficiënt met een Vmax van 6,3 ± 1,2 RFU/min, terwijl we bijna geen decolleté gedetecteerd bij het gebruik van de S2' peptide van de HKU205 stam (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/min) (Figuur 1a). Bij het onderzoeken van de EMC/2012 mutA-S S2' peptide, vonden we dat het splijten werd sterk verminderd in vergelijking met de volgorde van de wild-type (Vmax 3.6 ± 1 RFU/min). Er was bijna geen splijten bij het testen van de EMC/2012 mutS-ik S2' peptide (Vmax 1.1 ± 0,9 RFU/min) (Figuur 1a).
MERS-CoV isolaten uit West-Afrika werden onlangs, gemeld dat fylogenetisch onderscheiden van MERS-CoV in het Arabisch schiereiland16 gevonden worden. Een van de recent beschreven isolaten is de Mor213-stam, die een leucine in plaats van een arginine in de P4-positie van de S2 draagt ' site (tabel 1), en die kon potentieel furin effect hebben op de erkenning en de efficiëntie van de splitsing wijzigen. Onze peptide assay bleek dat er slechts minimale splitsing van de Mor213-S2' site in vergelijking met de EMC/2012 site (Figuur 1b). De Vmax voor de Mor213 peptide is 1,0 ± 0,1.
Voor het tweede deel van deze studie, we gewend de dezelfde peptide assay evalueren furin-gemedieerde splijten van FCoV S eiwit decollete sites. We gebruikten peptiden nabootsen van de S1/S2 breukzijde van twee FCoV serotype ik virussen: FECV I en-4 (vanaf Whittaker lab) en FIPV ik zwart (Genbank AB088223.1). Ook gebruikten we peptiden nabootsen van de S2' site van deze virussen, evenals twee FCoV serotype II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) en FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) stammen (tabel 1). Meestal treedt furin decollete op wanneer fundamentele residuen (arginine en lysine) aanwezig in de P1 en P4 posities van de breukzijde zijn. Mutaties in de P1, P4 en P1' posities worden voorgesteld om te mengen met furin cleavability, daarom veranderen de protease-eisen van het eiwit. (Tabel 1). Furin splitsingsproducten werd waargenomen voor de prototypische S1/S2 peptide FECV I en-4 S1/S2 (Vmax 100.36 ± 7.61 RFU/min), maar niet in de gemuteerde S1/S2 peptide FIPV ik zwart S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1.29 RFU/min) (figuur 2A). Ook furin was in staat om het klieven van de prototypische S2' peptide FECV II 1683 S2' (Vmax 5.46 ± 0.97 RFU/min), maar niet de gemuteerde S2' peptiden FECV I en-4 S2' (Vmax 0.26 ± 0.11 RFU/min), FIPV ik zwart S2' (Vmax 0,30 ± 0.14 RFU/min) en FIPV II 1146 S2' (Vmax-0.36 ± 0.11 RFU / min) (figuur 2B). We gebruikten trypsine als positieve controle voor peptide decollete en we waargenomen trypsine decollete in alle de peptiden dat gebruikt (aanvullende figuur 2).
Tabel 1. Peptiden gebruikte en overeenkomstige aminozuur sequenties. De peptiden in de testen gebruikt bevatten het (7-methoxycoumarin-4-yl) acetyl/2,4-dinitrophenyl (MCA/DNP) FRET paar. De P4 en P1 decollete site geplaatst arginine (R) residuen, die worden herkend door furin, zijn vetgedrukt. Residuen in het rood overeen met mutaties in vergelijking met referentie sequenties.
Figuur 1 . Furin-gemedieerde Proteolytische splitsing van menselijke en kameel afkomstige MERS-CoV S2' sites fluorogenic peptiden. A. Furin decollete kwantitatieve analyse van menselijke MERS-CoV EMC/2012 S2' site en kameel afkomstige stam HKU205 (dubbele mutant), samen met één mutant varianten van EMC/2012 (mutA-S en mutS-ik). B. Furin decollete assay van menselijke MERS-CoV EMC/2012 S2' site en kameel afkomstige stam Mor213. Voor de panelen A en B, peptiden werden geïncubeerd met recombinant furin en de verhoging van fluorescentie als gevolg van proteolytic processing werd gemeten met behulp van een fluorescentiespectroscopie. De tests werden uitgevoerd in triplicates met resultaten die gemiddelden van Vmax uit drie onafhankelijke experimenten (n = 3). Foutbalken geven SD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Furin-gemedieerde Proteolytische splitsing van FCoV S1/S2 en S2' sites fluorogenic peptiden. A. Furin decollete assay van FECV I en-4 en FIPV ik zwart S1/S2 sites. Peptiden werden geïncubeerd met recombinant furin. B. Furin decollete assay voor FECV I en-4, FIPV ik zwart, FECV II 1683 en FIPV II 1146 S2' sites. De toename van de fluorescentie te wijten aan proteolytic processing werd gemeten met behulp van een fluorescentiespectroscopie. De tests werden uitgevoerd in triplicates met resultaten die gemiddelden van Vmax uit drie onafhankelijke experimenten (n = 3). Foutbalken geven SD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende tabel 1: Vmax waarden gebruikt voor Figuur 1 en Figuur 2. De Vmax waarden werden berekend op basis van grafieken zoals geïllustreerd in aanvullende Figuur 1 en zoals beschreven in sectie 4 Protocol. Klik hier om te downloaden van deze tabel.
Aanvullende Figuur 1: illustratie van onbewerkte gegevens afgeleid van de software van de lezer van de plaat. Verhoging van fluorescentie over tijd-grafieken die werden gebruikt voor de bepaling van de Vmax. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Aanvullende Figuur 2: trypsine-gemedieerde Proteolytische splitsing van FCoV S1/S2 en S2' sites fluorogenic peptiden. Trypsine decollete assay van FECV I en-4 en FIPV ik zwart S1/S2 sites en van FECV I en-4, FIPV ik zwart, FECV II 1683 en FIPV II 1146 S2' sites. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Discussion
Wij presenteren hier een fluorogenic peptide assay die voor een snelle screening van proteïne sequenties voor hun Proteolytische decolleté door proteasen zorgt. In ons eerste voorbeeld is gekozen voor verschillende decollete site motieven van het MERS-CoV spike (S) eiwit ter illustratie van een toepassing voor deze test. Verschillende virussen die klasse heb ik fusion eiwitten zoals MERS-CoV, SARS-CoV (Severe Acute Respiratory Syndrome) en influenza zijn grote bezorgdheid voor de volksgezondheid en nieuwe subtypen zijn voortdurend in ontwikkeling die een potentieel bezitten te steken soorten gehuld barrières van hun natuurlijke gastheren op mensen1,15,16. Isoleren van de virussen en het cultiveren van hen in het lab kunnen niet altijd haalbaar of vereist speciale laboratoria die niet beschikbaar zijn in elk onderzoeksfaciliteit. Vandaar, is er een behoefte aan methoden voor de beoordeling van het potentiële gevaar voor de volksgezondheid van opkomende virussen die kan worden uitgevoerd onder normale laboratoriumomstandigheden. Naast virussen gericht op mensen, sommige dieren virussen zoals FCoV ook bezitten dezelfde klasse I fusion eiwitten, daarom delen van de vergelijkbare kenmerken dan hun menselijke tegenhangers. Isoleren van deze virussen kunnen ook een uitdaging, waardoor het gebruik van innovatieve hulpmiddelen te bestuderen ze noodzakelijk zijn.
Een cruciale stap in de levenscyclus van de bovenvermelde virussen is cel hostingingang en fusion gemedieerd door Proteolytische verwerking van de respectieve fusieproteïne door host proteasen1,2. Een standaard manier om te onderzoeken van dit deel van de virale levenscyclus is kloon van het fusie-eiwit-gen in een vector van zoogdieren expressie, cellen van zoogdieren die toestemming geven voor eiwit expressie, incubeer of samen met de protease van belang, isoleren transfect transfect de eiwit en een westelijke vlek-analyses uit te voeren. Deze methode komt met verscheidene beperkingen: beschikbaarheid van viraal DNA/RNA voor het klonen, kosten voor de synthese van het gen als geen DNA of RNA beschikbaar is, beschikbaarheid van een antilichaam te detecteren de fusieproteïne en haar decolleté product(en), en het kan duren om verschillende weken totdat de gehele studie wordt uitgevoerd. Het wordt zelfs meer tijd, geld en arbeidsintensief als het belang van de studie is om te onderzoeken van verschillende mutaties in de breukzijde aangezien er plaats-geleide mutagenese. De fluorogenic peptide assay we hier beschrijven beschikt niet over deze beperkingen. De peptiden van belang kunnen worden ontworpen op basis van openbaar sequenties, er zijn verschillende leveranciers die bieden een breed scala van recombinante proteasen die relevant voor dit soort studies zijn en de bepaling met inbegrip van de analyse kan worden uitgevoerd binnen een één dag.
In ons voorbeeld, onderzochten we de furin-gemedieerde splitsing van de S2' protease erkenning site van het MERS-CoV S-proteïne is afgeleid van de mens en kamelen uit Egypte en Marokko. Zowel de menselijke EMC/2012 en de kameel HKU205 S2' sites bevatten een typische RXXR furin decollete motief. Echter, volgens het splijten van de PiTou 2.0 scoren algoritme de HKU205 S2' site is niet voorspeld te worden gekloofd door furin, die we experimenteel bevestigde19. De reden waarom HKU5 S2' niet wordt verwerkt door furin zou kunnen te wijten zijn aan de isoleucine in de P1' positie. Wanneer we twee peptiden die de individuele mutaties in de EMC/2012-S2 gedragen getest ' reeks, we waren in staat om te bevestigen dat de isoleucine in de P1' grotendeels intrekt decollete, overwegende dat de alanine tot serine vervangingsverschuivingen geleid tot verminderde decollete. De Mor213-S2' site bevat geen een furin decollete motief en was het niet verwonderlijk om op te sporen bijna geen decolleté. Wij ook onderzocht hoe furin cleaves de S1/S2 en de S2' protease erkenning sites van het FCoV S-eiwit. We waren in staat om te observeren furin splitsing van beide FECV peptiden (FECV I en-4 S1/S2 en S2 FECV II 1683'), terwijl waren niet gekloofd gemuteerde sequenties van FIPV virussen door de furin.
Bij het vergelijken van furin-gemedieerde splitsing van de EMC/2012-S2' peptide (figuur 1A) met de FECV I en-4 S1/2 peptiden (figuur 2A), vonden we dat er een benaderende 26-fold verschil in de Vmax was. Dit kan worden verklaard door het furin decollete motief in beide reeksen (tabel 1). Terwijl de minimale eis voor furin decollete een RXXR motief is, is een RXRR reeks veel gunstiger2. Daarom de EMC/2012 S2' gekloofd peptide, die een RSAR motief heeft, is met minder specificiteit ten opzichte van de FECV I en-4 S1/2-peptide waarin de breukzijde van een RSRR-furin (tabel 1).
Een belangrijke beperking van de bepaling is echter dat de peptiden niet met de tertiaire structuur van de proteïne die ze zijn meestal ingebed overeen komen in. Splitsing van de volledige lengte fusieproteïne blootstelt de fusion-peptide en triggers hosten cel post1. De interactie tussen protease en fusie-eiwit kan ook worden beïnvloed door de tertiaire structuur van de fusieproteïne terwijl we ervan uitgaan dat de peptiden min of meer lineair zijn. Vandaar, decollete gedetecteerd in de bepaling van de peptide mogelijk kunstmatige en kan niet overeen met de in vivo situatie. Dit werd gemeld voor de splitsing van de influenza H3N2 HA subtype door matriptase. Terwijl de splitsing van de H3N2 HA verschillende groepen beschreven door matriptase in peptide testen, het was ook te zien dat de incubatie van volledige lengte H3N2 HA eiwit- en matriptase in celkweek niet in een fusogenic HA eiwit4,20resulteren, 21. Er zijn andere voorbeelden waaruit blijkt dat de biologisch belangrijke verordening voor het Proteolytische splijten op het niveau van eiwit bevleesdheid is. Het is beschreven dat fusion eiwitten soms nood aan een serie vooraf fusion gebeurtenissen moeten zitten kundig voor bloot de splitsingsproducten-sites op de fusie. Het Semliki Forest virus fusieproteïne, bijvoorbeeld, vereist structurele herschikkingen tijdens een aantal prefusion evenementen om bloot haar fusieproteïne en het beschikbaar maken voor Proteolytische activering22. Daarom moeten de resultaten van een fluorogenic peptide assay worden gevalideerd door cell fusion testen of soortgelijke experimenten. De peptide-bepaling maakt echter nog steeds een snelle screening van verschillende protease/peptide combinaties en om te verminderen van de arbeid en de tijd van follow-up experimenten aangezien combinaties die geen decolleté vertonen zeer waarschijnlijk om te exposeren de hetzelfde resultaat in vivo.
Deze methode is gebleken efficiënt om te bestuderen van het splijten van aminozuur specifieke opeenvolgingen door furin. Nochtans, de toepassingen van de afmetingen van de techniek naar een beschikbare protease (bijvoorbeeld, cathepsins, proprotein convertase), waardoor het een handige methode om scherm peptide kandidaten voor protease decollete. Bovendien heeft het aangetoond dat deze bepaling kan ook worden gebruikt voor het testen van de werkzaamheid van proteaseinhibitors en vandaar een snelle en gebruiksvriendelijke tool om scherm eiwit remmers23 biedt.
De fluorogenic peptide decollete assay hier beschreven vormt een aanvulling op bioinformatic decollete scoren algoritmen, die het peptide splijten door een vastberaden protease voorspelt, gebaseerd op de aminozuur eigenschappen en de volgorde. Deze twee technieken, in combinatie met traditie westelijke bevlekken technieken kunnen worden gebruikt als een efficiënte methode om te studeren protease decollete in vitro.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering van onderzoek voor het project van de MERS gepresenteerd in dit manuscript werd verstrekt door de NIH grant R21 AI111085. De feline coronavirus-studie werd ondersteund door onderzoekssubsidies van Morris dier Stichting, Winn katachtige Foundation en de Cornell Feline Health Center. Wij ook bedank Malik Peiris voor het verstrekken van ons met de Mor213 reeks voordat het was toegankelijk voor het publiek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptides | Biomatik | N/A | |
| Furin | NEB | P8077S | |
| Trypsin, TPCK-treated | Sigma-Aldrich | 4352157-1KT | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | XPS | |
| SoftMax Pro 6.5.1 | Molecular Devices | N/A | |
| 96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) | Costar | 3915 | |
| Light damping tubes | Watson Lab | 131-915BL or 131-915BR | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Prism 7 | GraphPad | N/A |
References
- Harrison, S. C.
- Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. , (2014).
- Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion. Viruses. 4 (7), 1144-1168 (2012).
- Straus, M. R., Whittaker, G. R. A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site. PloS one. 12 (3), e0174827 (2017).
- Kawaoka, Y., Webster, R. G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (2), 324-328 (1988).
- Abdelwhab, E. S. M., et al. A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens. Journal of Virology. 90 (1), 400-411 (2016).
- Steinhauer, D. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 258 (1), 1-20 (1999).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. Pathogens and disease. 69 (2), 87-100 (2013).
- Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. Journal of Virology. 68 (9), 6074-6078 (1994).
- Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
- Polgar, L.
- Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species. mSphere. 3 (1), 1-8 (2018).
- Licitra, B. N., et al. Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 19 (7), 1066-1073 (2013).
- Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R.
- Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic? Vaccines. 3 (1), 172-185 (2015).
- Chu, D. K. W., et al. MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 1-6 (2018).
- Caprioli, R. M., Smith, L. Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 58 (6), 1080-1083 (1986).
- Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging microbes and infections. 5 (12), e126-e129 (2016).
- Tian, S., Huajun, W., Wu, J. Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases. Scientific Reports. 2, (2012).
- Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities. Journal of Virology. 86 (19), 10579-10586 (2012).
- Beaulieu, A., et al. Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway. Journal of virology. 30 (878), 4237-4251 (2013).
- Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus. Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 7189-7198 (2003).
- Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (2), 1070-1075 (2014).
