Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58901
Automatic Translation
*1, *1, 1, *1, *1
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster
* These authors contributed equally

Summary

Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".

Abstract

תאי אנדותל של הנימים שרירי השלד (microvascular אנדותל תאי שריר, MMEC) לבנות את המכשול בין זרם הדם שרירי השלד ויסות חילופי נוזלים, חומרים מזינים, כמו גם את התגובה החיסונית נגד זיהומיות סוכנים על ידי שליטה נדידת תאים חיסוניים. עבור פונקציות אלה, MMEC יוצרים פונקציונלי "יחידה myovascular" (MVU), עם סוגי תאים נוספים, כגון fibroblasts, pericytes, תאי שריר השלד. כתוצאה מכך, תפקוד MMEC ולכן MVU את תורמת למגוון עצום של myopathies. אולם, מנגנוני הרגולציה של MMEC על בריאות ומחלה נותרו מספיק מובן, הבהרה שלהם מקדים טיפולים פרטניים יותר myopathies. בידוד של חקירה מעמיקה של פונקציות MMEC העיקרי בהקשר של MVU עשוי להקל על הבנה טובה יותר של תהליכים אלה.

מאמר זה מספק פרוטוקול כדי לבודד MMEC מאתר העיקרי של שריר השלד מאת דיסוציאציה מכני, אנזימטי כולל טיהור והשלבים תחזוקה תרבות.

Introduction

דרך מחזור הדם, תאים ואיברים, מסופקים עם חמצן, מצעים, מולקולות אחרות הדרושות. מחלף זה מתרחש בנימים, בכלי הדם הקטנים. נימים נוצרות על ידי שכבת תאי אנדותל הפנימי (EC) שלמות אשר נשאר תנאי לביצוע מוצלח ההסדרה של הומאוסטזיס שריר בין המרחב קרישה תוך-כלית, interstitial. כדי להבטיח מעבר סלקטיבי של גורמים מסיסים ותאים, EC מהוות של טפט מחוברים על ידי חזק צמתי adherens 1. מלבד תפקידה כמחסום חומרים מזינים או מוצרים מטבולית, EC לווסת את גיוס לויקוציטים בתהליכים דלקתיים. נזק דלקת או רקמה מוביל למעלה-רגולציה של מולקולות אדהזיה על פני EC ו ייצור של נוגדנים הקלת ליקוציט המצורף, גלגול לתוך רקמת המטרה 2. כתוצאה מכך, EC אנושות מעורבים בוויסות תהליכים דלקתיים כגון ההגנה נגד פתוגנים או רקמות תיקון.

תפקוד EC הוא ישירות הקשורים עם מחלות לב וכלי דם, אי ספיקת כליות כרונית, פקקת ורידים חמורה הפתוגן זיהומים. יתר על כן, EC כמעט תמיד מעורבים מחלת חיסון עצמי ייחודיים כגון סוכרת או טרשת נפוצה 3. הפונקציה מחסום בין זרם הדם ואיברים ולכן נשלטת על ידי המרצד מתואמת סוגי תאים שונים. בתאי שריר השלד microvascular אנדותל (MMEC) יחד עם תאי שריר, fibroblasts ו pericytes יוצרות יחידה פונקציונלית, יחידת"myovascular" (MVU). לכן, תפקוד MVU עשוי לשחק תפקיד קריטי הפתופיזיולוגיה של myopathies. אולם, הבנה עמוקה יותר של מנגנונים רגולטוריים אלה עדיין נעדר, כיום מונע זיהוי מטרות חדשות, בדחיפות, טיפולי myopathies.

כדי לחקור את המנגנונים הפיזיולוגיים ואת pathophysiological מורכבים, מודלים בעלי חיים משמשים. עם זאת, מודלים במבחנה מציעים היתרון להתמקד על נושא מעניין על ידי למעט מגוון גורמים מבלבלים. לחקור תהליכי הפריה זה הכרחי בידוד תאי יסוד טהור בר -קיימא. בניגוד שורות תאים, התאים הראשי שבודדו מבעלי הטרנסגניים מאפשרים לחקור את ההשלכות של שינויים גנטיים במבחנה.

. הנה, שיטה לבודד את ראשי MMEC מאתר מתואר באמצעות דיסוציאציה מכני, אנזימטי ואחריו מגנטי תא מופעל מיון טכניקות (MCS) לטיהור. למטרה זו, משמשים beads מגנטי נגד סמני פני שטח מסוים. טסיות תא אנדותל אדהזיה מולקולה-1 (PECAM1, CD31), מתבטאת בעיקר על EC והוא יכול לשמש כדי להעשיר את סוג התא. כדי להצדיק טוהר גבוהה תא, תאים ממוצא hematopoietic יוצאו על ידי בחירה שלילי עבור סוג קולטן טירוזין phosphatase חלבון C (PTPRC, CD45). בהמשך, מוצגים פקדים איכות, טיפוח של MMEC מאתר ראשי, יישומים פוטנציאליים, מגבלות, כמו גם שיקולים מיוחדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים שאושרו על-ידי הרשויות המקומיות, שנערכו על-פי חוק רווחת בעלי חיים גרמני (84-02.05.20.13.097).

1. כללי הערות על ניסויים בבעלי חיים

  1. לבצע כל עכבר ניסויים בהתאם לקווים המנחים של טיפול בבעלי חיים מוסדיים המתאימים ולהשתמש הוועדה.
  2. לשמור על עכברים בתנאים מתוקננים, בהתאם להנחיות בינלאומיות כגון הפדרציה עבור עמותות המדע חיות מעבדה (FELASA).
    הערה: באופן כללי ניתן להשתמש בטכניקה זו בידוד עבור עכברים עצמאית של גיל, מין או הרקע הגנטי. כדי לקבל מספר מספיק של התא, שבוע 4 – 10 זכרים הם המועדפת, כי תכונות ביולוגיות יכול להשתנות עם הגיל והמין.

2. אופן ההכנה של פתרונות, מדיה, ציפוי

  1. להכין פתרון מערכת העיכול (DS) על ידי ערבוב 2.2 מ של Dulbecco´s ששינה נשר בינוני (DMEM) עם 200 μL Collagenase-Dispase ו- 45 μL Desoxyribonuclease (DNase).
  2. הכנת 500 מ"ל של תאי אנדותל בינוני (ECM) על ידי ערבוב 450 מ של DMEM עם 50 מל FCS (כ 10%), 0.25 mL בסיסי פיברובלסט גורם הגדילה bFGF (20 μg/mL; כ- 0.05%) 5 מ ל פניצילין-סטרפטומיצין (כ 1%). לבצע סינון סטרילי שפופרת זכוכית (קוטר של מסנן נקבוביות: 0.2 μm). לאחר מכן לאחסן את הפתרון ב 4 º C.
  3. מעיל תא תרבות לוחות כמתואר להלן.
    1. לטיפוח של טרי מבודד לכסות MEC העיקרי מאתר כל המשטח עם 1 מ"ל לכל טוב של 6 טוב תא תרבות צלחת עם פתרון ציפוי הג'לטין המבוסס על מהירות (ראה טבלה של חומרים) על פי הוראות היצרן למשך 3-5 דקות בחדר טמפרטורה (RT).
    2. האחות ולמחוק את ציפוי פתרון. לשטוף כל טוב עם פוספט סטרילי buffered 2 מ ל תמיסת מלח (PBS), pH 7.1-7.5 בשני שלבים עוקבים כביסה.
    3. האחות וזורקים PBS. למלא וולס עם נפח 1 מ"ל של ECM.

3. בידוד של תאי אנדותל Microvascular שריר מאתר ראשי (MMEC)

  1. המתת חסד מבוגר אחד 4 – 12 שבועות העכבר הישן, הזכר על ידי נקע בצוואר הרחם ללא כל הרדמה. המטרה היא להפריד במהירות את חוט השדרה של המוח כדי לספק את החיה עם מוות מהיר וללא כאבים.
  2. לנתק את הגפיים.
    1. השתמש כירורגי חד/סיגריה (חוד החנית 42 מ"מ, ישר) וחד חד/מספריים (חוד החנית 23 מ מ, ישר), ישר (משונן, 2 מ מ x 1.25 מ מ x 12 ס מ), מעוקל (משונן, 1.3 מ מ x 1 מ מ x 13 ס מ) מלקחיים.
    2. לחטא את כל מכשירי ניתוח עם 70% אתנול.
    3. מקם את החיה על גבו, להרטיב את הרגליים עם 70% אתנול. לנתק את כל הרגל על ידי גזירה על מפרק הירך עם מספריים כירורגיים שארפ/בלאנט. מקם את קצות הגפיים לצלחת תרבות תאים סגורים (35 מ"מ x 10 מ"מ).
      הערה: מעכשיו לבצע בכל שלב תחת תא סטרילי למינארי ועבודה עם מכשירים מעוקר.
  3. לבודד רקמת השריר (מעדיפים להשתמש את הירך הארבע ראשי musculus או musculus הסובך השלש ראשי של שתי הרגליים).
    1. לחתוך את העור מהמותן לקצה הבוהן באמצעות מספריים חדות/חד ומלקחיים מעוקל. להחזיק את הבוהן או לו טביעות רגל עם המלקחיים ישר. לקלף את העור עם המלקחיים מעוקל של הבוהן באיזור המותן.
    2. לבודד את הירך הארבע ראשי musculus על ידי חיתוך הגיד של הברך ולנתק את השריר לאורך עצם הירך באיזור המותן. לבודד את musculus הסובך השלש ראשי באמצעות ניתוק גיד אכילס. בעתיד, לחתוך לאורך עצם השוקה הפוסות popliteal ולהסיר את השריר.
      הערה: אם כלי גדול (femoralis א, ע' השוקתי הקדמי, א השוקתי האחורי, השריר השוקיתי א) גלויים שרירים מבודדות, להסיר כלי כדי למנוע זיהום על-ידי macrovascular אנדותל.
    3. כדי להסיר כלי גדול, להחזיק את החלק של השריר אשר אינו מכיל כלי גדול עם מלקחיים מעוקל ולנתק אותו ליד הספינה. עבור פרוטוקול זה, מומלץ 1 g או פחות רקמת שריר שווה הירך הארבע ראשי והן הסובך השלש ראשי .
    4. הוספת µL 2,445 DS (מתוך שלב 2.1) לצלחת תרבות תא (35 מ"מ x 10 מ"מ) וקובעים את המשקל.
    5. להעביר את כל החלקים שריר זה מאכל התרבות התא המכיל את µL 2445 DS ולקבוע את המשקל. ההפרש בין שני הערכים נמדד מספק את משקל יבש של רקמת השריר, אשר לא יעלה על 1 g.
    6. חתוך את רקמת שריר שלם לחתיכות קטנות (≤2 מ מ קוביות, בערך 100 חתיכות) באמצעות את המספריים חדים/חד.
  4. לבטל את רקמת השריר.
    הערה:     שלב זה לוקח בערך 120 דקות.
    1. חנות ההשעיה שריר/DS ב 37 מעלות צלזיוס (חממה עם 5% CO2) עבור ה 1.5 מערבבים את המתלים בקפידה כל 20 דקות בערך 5 דקות באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל.
    2. להעביר את ההשעיה 70 μm ניילון תא מסננת על שפופרת 50 מ ל ולאסוף את הזרימה. לשטוף את מסננת תא עם 8 מ של DMEM ולאסוף את הזרימה.
    3. לבטל את ההשעיה מסננת, צנטריפוגה תא 10 דקות ב x 300 גרם ב 20 º C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע.
      התראה: צנפה קל לאבד.
    4. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של מאגר lysing אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) (ראה למכתב טבלה של חומרים) עבור פירוק של כדוריות דם אדומות דגירה 30 s-RT. להוסיף 9 מ ל DMEM + 10% FCS כדי לעצור את התגובה ואת העברת התליה תא ל t 15 מ"ל אובה.
  5. לרוקן CD45+ תאים ההוראות של היצרן גרגרי CD45. עבור כל השלבים הבאים של CD45+ דלדול להשתמש מאגר תקליטנים (ראה למכתב טבלה של חומרים).
    הערה:     שלב זה לוקח כ- 60 דקות.
    1. לקבוע את מספרי הטלפון הנייד באמצעות תא נויבאואר ספירת קאמרית (מצפה בערך 5 x 106 תאי רקמת שריר g).
    2. צנטריפוגה ההשעיה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C. תורידי את תגובת שיקוע לחלוטין, resuspend צנפה תא µL 90 MCS מאגר (לכל 107 תאים או פחות). להוסיף 10 μL של גרגרי CD45 (לכל 107 תאים או פחות).
    3. לערבב תא ההשעיה, תקופת דגירה של 15 דקות במקרר ב 4 – 8 ° c
    4. להוסיף מאגר תקליטנים 1 מ"ל (לכל 107 תאים או פחות). צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע לחלוטין, resuspend תאים במאגר MCS 500 μL.
    5. תא מגנטי לפרידה להשתמש בעמודת מגנטי גדול (LMC) עם נפח אגירה של 8 mL, קיבולת של עד 2 x 109 תאים הכולל. מקם את LMC בשדה המגנטי של ההפרדה.
    6. לשטוף עם 3 מ"ל של מאגר תקליטנים לתוך המאגר של LMC. לאחר השטיפה, הצב צינור חרוטי 15 מ"ל מתחת לעמודת כדי לאסוף את הזרימה. להחיל את המתלים התא כולו (500 µL) אל העמודה ולתת לו לחלוטין זרימה.
    7. לשטוף את העמודה שלוש פעמים על-ידי הוספת 3 מ"ל של מאגר תקליטנים לתוך המאגר והמתן עד המאגר column´s ריקה לפני ביצוע השלב הבא כביסה.
    8. לאסוף התאים ללא תווית עובר את העמודה לשימוש בהמשך ההפרדה צעדים (המייצג את CD45 שבר– ). שכותרתו תאים (המייצג את CD45+ שבר) שהצטברו בתוך העמודה יכול להיות מושלך.
  6. לצבור CD31+ תאים ההוראות הבאות CD31 גרגרי של היצרן. עבור כל השלבים הבאים של CD31+ הצטברות להשתמש מאגר תקליטנים.
    הערה:     שלב זה לוקח כ- 60 דקות.
    1. לקבוע את מספר הטלפון הנייד באמצעות תא נויבאואר ספירת קאמרית (מצפה בערך 4 x 106 תאי רקמת שריר g).
    2. צנטריפוגה המתקבל תא ללא תווית ההשעיה שלב 3.5 10 דקות ב x 300 גרם -4 מעלות צלזיוס.
    3. הסר את תגובת שיקוע לחלוטין. Resuspend בגדר במאגר MCS 90 μL ולהוסיף 10 μL של גרגרי CD31 (לכל 107 הכולל תאים או פחות). לערבב את כל המתלים, תקופת דגירה של 15 דקות במקרר ב 4 – 8 ° c
    4. להוסיף 1 מ"ל MCS מאגר צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C. . תוריד את תגובת שיקוע, resuspend תאים µL 500 מאגר תקליטנים.
    5. לצורך הקמת מכשול ההפרדה תא מגנטי להשתמש בעמודת מגנטיים בינוני (MMC) עם נפח אגירה של 3.5 מ ל, בעל קיבולת של עד 2 x 108 תאים הכולל.
    6. מקם את MMC בשדה המגנטי של ההפרדה. יש לשטוף את MMC עם 500 µL מאגר תקליטנים. לאחר השטיפה, הצב צינור חרוטי 15 מ"ל מתחת לעמודת כדי לאסוף את הזרימה.
    7. להחיל את המתלים התא כולו (500 µL) אל העמודה ולתת לו לחלוטין זרימה.
    8. לשטוף את העמודה שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 500 מאגר תקליטנים והמתן עד המאגר של העמודה ריקה לפני ביצוע השלב הבא כביסה. תאים ללא תווית עובר את העמודה מייצגים את CD45– CD31– שבר. לאחסן אותם עבור פקדים איכות נוספים.
    9. הסר העמודה המפריד ומניחים אותו על צינור אוסף מתאימים (הצינור 15 מ"ל). פיפטה 2 מ"ל מאגר תקליטנים אל העמודה. מיד לשטוף החוצה את התאים דיסקות שכותרתו בדחיפה בחוזקה על הבוכנה לתוך העמודה. זה CD45– CD31+ שבר מייצג את לכלכלת מאתר ראשי מועשר
    10. צנטריפוגה תא השעיה במשך 5 דקות ב x 350 גר' ב- 20 ° C. להסיר לחלוטין את תגובת שיקוע, resuspend תאים (מצפה 0.6 x 106 תאי רקמת שריר g) ב 1 מ"ל ECM (ראה שלב 2.2.). להעביר תאים (0.5-0.7 x 106 תאים) טוב יחיד של צלחת תרבות 6-ובכן מצופה (מתוך שלב 2.3) המכיל 1 מ ל ECM.
  7. לטיפוח-תרגול, דגירה תאים-37 ° C ו- 5% CO2 ב חממה סטרילי. לרענן את ה-ECM כל יומיים שלושה.

4. ראשי MMEC מאתר טיהור

  1. לבצע מחזור שני של CD31+ הצטברות, ההוראות של היצרן (גרגרי CD31 העכבר פרוטוקול; ראה שלב 3.6.).
    1. ניתוק תאים עם פתרון טריפסין/EDTA כאשר הם במצב זרימה 80-90% (בדרך כלל לאחר 7 ימים). בשביל זה, יש לשטוף כל טוב עם PBS סטרילי 2 מ"ל, בשני שלבים עוקבים כביסה. להשתמש בפתרון טריפסין/EDTA μL 800 לכל 6-ובכן, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב חממה סטרילי עבור 3-5 דקות להפסיק פעילות אנזימטי באמצעות 1200 μL DMEM מכיל מינימום של 10% FCS.
    2. Centrifuge התליה תא עבור 5 דקות ב x 350 גר' ב- 20 ° C.
    3. ביצוע השלב השני CD31-MCS להגדיל את הטוהר (לפי ההוראות manufacturer´s גרגרי CD31; ראה 3.6.).
    4. אם צוינו תא זרימה דרך שדה בהיר או שלב-ניגודיות סטנדרטי באמצעות מיקרוסקופ
      20 x הגדלה ו- 0.35 עדשה מפתח נומרי. ראה איור 1.
      הערה: ניתן להשתמש עבור ניסויים בהתאמה תאים או שמרה בתרבות passaging. השתמש תאים עבור ניסויים מיד מעברים נמוך יותר. לא מומלץ להשתמש תאים לאחר המעבר
      8-10.

5. בקרת איכות

  1. לבצע cytometry זרימה של ראשי MMEC מאתר לאחר CD31-MCS-השלב השני.
    1. הכן צינור FACS על-ידי הוספת 1 מ"ל לזרום cytometry (FC) מאגר (ראה למכתב טבלה של חומרים).
    2. ניתוק תאים עם פתרון טריפסין/EDTA כאשר הם במצב 100% הנהרות (בדרך כלל לאחר 14 ימים). בשביל זה, יש לשטוף כל טוב עם PBS סטרילי 2 מ"ל, בשני שלבים עוקבים כביסה. להשתמש בפתרון טריפסין/EDTA μL 800 לכל 6-ובכן, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב חממה סטרילי עבור 3-5 דקות להפסיק פעילות אנזימטי באמצעות 1200 μL DMEM המכיל 10% FCS.
    3. לקבוע את מספר הטלפון הנייד באמצעות נויבאואר ספירת תאים קאמרית ולהוסיף מינימום של עונה 1 פרק 105 תאים אל הצינור FACS מוכן.
    4. צנטריפוגה תא השעיה במשך 10 דקות ב x 300 גרם -4 מעלות צלזיוס. לבצע שני צעדים הכביסה על ידי הסרת את תגובת שיקוע, resuspending תאים במאגר 1 מ"ל FC צריך שתוציאו 10 דקות ב x 300 גרם -4 מעלות צלזיוס.
    5. להכין תערובת צביעת על-ידי הוספת אנטי עכבר נוגדן CD31-FITC (1: 100) ועכבר נגד CD45-PE (1: 100) עם מאגר FC.
    6. Resuspend תאים μL 100 של צביעת לערבב את החצוצרות שלה FACS. תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C. להוסיף 1 מ"ל של מאגר FC. צנטריפוגה תא השעיה במשך 5 דקות ב x 300 גרם -4 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאים μL 200 FC המאגר.
    7. למדוד בתאי קהל מעריצים cytometer זרימה שהאסטרטגיה המגביל מוצג באיור. 2A.
  2. לחלופין, לבצע immunofluorescence מכתים של ראשי MMEC מאתר לאחר CD31-MCS-השלב השני.
    1. המעיל coverslips.
      1. העברה בקוטר 13 מ מ סטרילי עגול מזכוכית coverslip לבאר של צלחת טוב 24 שעות ביממה. מעיל coverslip על-ידי הוספת µL 300 של מהירות פתרון ציפוי לכל טוב. תקופת דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      2. האחות ולמחוק את ציפוי פתרון. לשטוף כל טוב עם 2 מ"ל PBS סטרילי בשני שלבים עוקבים כביסה. האחות וזורקים PBS.
      3. זרע עונה 1 פרק 105 תאים ב- 1 מ"ל ECM-coverslip מצופה, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בחממה סטרילי עד שהתאים הם 99% confluent.
    2. לבצע קיבוע immunofluorescence מכתים.
      1. הסר את המדיום ECM של תאים מעובדים 5.2.1.3.
      2. לתקן תאים בתרבית על-ידי הוספת µL 300 4% paraformaldehyde (PFA) עם ה-pH של 7.4 לכל טוב, 10 דקות ב 4 º C.
        התראה: כדורגלן הוא רעיל, יש לטפל בזהירות.
      3. לבצע 3 שלבים כביסה על-ידי הוספת 1 מ"ל PBS לכל היטב ולהסיר את תגובת שיקוע לאחר 5 דקות ב- RT.
      4. הכן של חסימה פתרון המכילה 5% BSA, 0.2% טריטון-X ו- 1% עז סרום ב- PBS.
      5. להוסיף 300 µL של פתרון החוסמת מכל קידוח, תקופת דגירה של h 1-RT.
      6. הסר את תגובת שיקוע להוסיף µL 200 לאדם טוב של נוגדן anti-PECAM-1 (CD31) (1:200) ב- BSA 5%, 1% סרום עז ב- PBS, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      7. לבצע שטיפה צעדים על-ידי הוספת 1 מ"ל PBS לכל טוב והסרה supernatant לאחר 5 דקות ב RT בכל שלב 3.
      8. להכין פתרון נוגדנים משניים המכיל Cy3 מצומדת נוגדנים IgG אנטי חולדה (שבערך) 1% BSA, PBS. הוסף µL 300 לאדם טוב של הפתרון נוגדנים משניים, תקופת דגירה של h 1 ב RT בחושך.
      9. לבצע שטיפה צעדים על-ידי הוספת 1 מ"ל PBS לכל טוב והסרה supernatant לאחר 5 דקות ב RT בכל שלב 3.
    3. להוציא את coverslips זכוכית עגול דקה בזהירות עם מלקחיים והעבר אותו לשקופית מיקרוסקופ. הוסף כמות מספקת של הרכבה בינונית דאפי המכיל ברובד תא ' בזהירות לשים זכוכית מכסה עליו (ראה סגור טבלה של חומרים).
    4. צופים תאים עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות המתאים מצויד עם מקור אור זריחה (120 W) ולסנן שני סטים: מסנן עירור/פליטה סט עם 550/25 ננומטר, אורכי גל nm 605/70 לזהות Cy3 540/562 ננומטר.
    5. השתמש במסנן השני יצא עם אורך גל עירור/פליטה של 365/50 ננומטר, 445/50 ננומטר לזהות דאפי 350/440 ננומטר. להשתמש הגדלה של 40 x ולהשתמש בעוצמת 80% 14.5 mW/cm2 דאפי עם משך רכישות של גב' 30 גילוי של Cy3 80% של mW/cm 67.52 עם משך רכישות של 60 ms.
  3. לבצע PCR כמותי.
    1. בידוד של mRNA.
      1. בצע את נהלי שימוש של ריאגנט thiocyanate-פנול (AGTP) guanidinium חומצה כדי לבודד mRNA. שימוש מינימלי של 0.5 x 10 תאים6 מ- CD45– CD31– (ראה שלב 3.6.8), CD45– CD31+ (ראה צעד 3.6.9). שברים ומספרים MMEC מאתר ראשי מעובדים (4.1.3)
      2. צנטריפוגה תא השעיה במשך 10 דקות ב x 300 גרם ב 20 º C. . תוריד את תגובת שיקוע לחלוטין. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL של השעיה תא ריאגנט והעברה AGTP לתוך צינור תגובה 2 מ"ל. תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.
      3. להוסיף 100 µL של כלורופורם ומנערים נמרצות במשך 15 ס' Incubate למשך 3 דקות ב- RT.
      4. צנטריפוגה השעיה למשך 15 דקות x 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
      5. תוריד העליון מימית השלב (מכיל רנ א) בקפידה ולהעביר לתוך צינור התגובה 1.5 mL. להוסיף 250 µL של אלכוהול איזופרופיל ולאחר תקופת דגירה של 10 דקות ב- RT.
      6. לבצע צעד צנטריפוגה ב 12,000 x g 10 דקות ב 4 º C.
      7. . תוריד את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של 75% אתנול בקפידה. צנטריפוגה ב 7,500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C.
        הערה: צניפה קל לאבד.
      8. הסר את תגובת שיקוע לחלוטין. תן בגדר להתייבש באוויר למשך 5 – 10 דקות.
        הערה: אתנול צריך להיות מוסר אבל לא יבשה מדי.
      9. להמיס גלולה µL המכיל מים diethylpyrocarbonate שטופלו ב 30, חום למשך 10 דקות-55 מעלות צלזיוס.
        הערה: ריכוז ה-RNA וטוהר נמדד על ידי ספקטרלי-photometer.
    2. לבצע סינתזה cDNA (טרנסקריפטאז PCR).
      1. להכין mastermix המכיל: 10 µL של מאגר ה-PCR (5 x), 2, 5 µL desoxyribonucleosid-טריפוספט (dNTP (10 מ מ)), 0.5 µL תערובת אקראי של פריימר חד גדילי (0.2 µg / µL), µL 1 של RNase מעכב (40 U / µL, 0.4 הפוך transcriptase (200 U µL) ו- 5.6 µL של diethylpyrocarbonat מים מטופלים (ראה למכתב טבלה של חומרים).
      2. לדלל RNA ng 500 במים diethylpyrocarbonate שטופלו µL 30 ב- 0.2 מ ל PCR צינורות ולהוסיף את כל mastermix 20 µL.
      3. השתמש הצנטרפוגה PCR של ביצוע בעקבות צעדים: 10 דקות 25 ° C, 30 דקות 50 ° C, 5 דקות 85 ° C ו להחזיק על 4 מעלות צלזיוס.
  4. לבצע PCR כמותי (qPCR).
    הערה: ביצוע qPCR דוגמאות של כפילויות או triplicates.
  5. השתמש תחל עם שני צבעי זריחה שונים. פריימר עם בליעת 495 ננומטר, של פליטה של 517 nm עבור הגן עניין.
  6. עבור זיהוי סמן התא בלוויין גנים, השתמש תחל תיבת לזווג החלבונים 7 (Pax7) ו- M-קדהרין (Cdh15) (ראה למכתב טבלה של חומרים).
  7. עבור זיהוי גנים סמן תא אנדותל, השתמש תחל claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) ו- zonula occludens-1 (Tjp1 או ZO1) (ראה למכתב טבלה של חומרים).
  8. כמו ג'ין הפניה עבור 18s rRNA, להשתמש פריימר לספיגת 538 nm ו של פליטה של גל nm 554.
  9. להכין mastermix qPCR של גנים כל עניין עם מן המפתח בהתאמה. Mastermix מכיל: מאגר qPCR 10µl (2x), µL 1 של פריימר עבור ג'ין עניין (10 מיקרומטר), µL 1 של פריימר עבור 18s rRNA ו- 4 µL של נוקלאז ללא מים.
  10. להוסיף 16 µL של mastermix טוב יחיד של צלחת 96-ובכן התגובה. להוסיף 4 µL של cDNA (המתקבל שלב 5.3.2.) לכל טוב המכיל את mastermix.
  11. השתמש הצנטרפוגה PCR בזמן אמת של ביצוע בעקבות צעדים: מחזיק במה עם 50 º C למשך 2 דקות ו- 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות רכיבה על אופניים הבמה עם 40 מחזורי של 95 ° C 15 s ו- 60 ° C 1 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יום אחד לאחר בידוד, MMEC מאתר ראשי, ממסר תאים אחרים טופס וקונצרנים, לדבוק התחתון של תרבות מנות (איור 1A יום 1). יום 7 ואילך ניתן לצפות תאים שטוח וארוך. זיהום של אחרים, בעיקר ספרואיד תאים, עם זאת, עדיין גלויים (איור 1A יום 7). לכן, עוד מחזור של CD31 חיובי בחירת דרך MCS נדרש. בעתיד, MMEC מאתר הראשי להתרבות על צפיפות של-80-90%. על הנהרות הם יוצרים בדרך כלל חד שכבתי שאינם חופפים של תאים longitudinally מיושר (איור 1A יום 14). התפשטות עוצר על הנהרות עקב מגע-בלימת. לאחר 14 ימים על 5 – 10 x 105 תאים יכולים לשמש לחקירה נוספת.

בקרת איכות דרך cytometry זרימה באמצעות צבע הכדאיות ניתן לתיקון FVD780 (כדי להכתים עבור תאים מתים), PECAM1 (CD31), PTPRC (כמו סמן עבור תאים ממוצא hematopoietic, CD45) הראו ערכים עבור הכדאיות וטוהר הנע בסביבות 70% בכל התאים מיד לאחר הבידוד (איור 2 א). תאים מעובדות לאחר עוד CD31 הבחירה חיובית דרך MCS, הראה סיפוק ערכי טוהר גם לגבי הכדאיות הנעות עד 95% כל (איור 2B).

כדי להעריך את הדיוק של הבחירה צעדים, שהושג תאים נוספים נחקרו על ביטוי גנים של שריר בלוויין תא סמן גנים תיבת לזווג החלבון 7 (Pax7) ו- M-קדהרין (Cdh15) ברמת mRNA על ידי ה-PCR כמותי (qPCR). ראשי מאתר MMEC (pmMMEC), תאי שריר מאתר ראשי הבדיל (pmMC) שימשו שליטה שליליים או חיוביים, בהתאמה. תאי שריר מאתר נרכשו מסחרית. כצפוי, רק את CD45– CD31– שבר, כמו גם pmMC הביע Pax7 Cdh15, ואילו CD45– CD31+ MMEC מאתר ראשי היו שליליות אלה סמנים (איור 2C).

EC נגזר נימים ב endomysium של שרירי השלד אקספרס צמוד לצומת חלבונים 4,5. באמצעות qPCR, ביטוי claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) ו- zonula occludens-1 (Tjp1 או ZO1) של confluent MMEC מאתר הראשי לאחר MCS CD31 השני שלב ההערכה. PmMC שימשו פקדים (איור דו-ממדי). MMEC מאתר ראשי הביעו רמות גבוהות של Cld5, Ocln , Tjp1, ואילו pmMC הצג רק ביטוי נמוך של Tjp1. יתר על כן, immunofluorescence מכתים כמו בקרת איכות אישר ביטוי משטח של דה מרקר אנדותל ספציפי PECAM1 ב MMEC מאתר ראשי (2E איור).

Figure 1
איור 1: מורפולוגיה של ראשי מאתר MMEC. (א) תמונה ייצוגית של תרבותי MMEC מאתר העיקרי על ידי מיקרוסקופ ניגודיות שלב 1 עד 14 ימים. d1 = יום 1, d7 = יום 7, d14 = 14 יום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: בקרת איכות של MMEC מאתר ראשי- Gating אסטרטגיה לניתוח זרימת cytometric של ראשי MMEC מאתר מיד לאחר בידוד (A), וביום 15 (B) באמצעות (I) FSC/האס, (II) FVD780 ו- (iii א) CD45, CD31 (IIIb) (קווים מקווקווים = שליטה isotype). (ג) ביטוי ברמה של Pax7 ו- M-קדהרין (Cdh15) ב- CD45– CD31-, CD45– CD31+ שברים לאחר בידוד MCS גם ראשי מאתר MMEC (pmMMEC), תאי שריר מאתר ראשי (pmMC ). רמות הביטוי מוצגים כערכי ΔCt (דוגמה - 18S rRNA), n.d. = לא נחוש. (ד) ביטוי ברמה של צומת חזק חלבונים claudin-5 (Cldn5), occludin (Ocln) או zonula occludens-1 (Tjp1 או זואי-1) של pmMMEC ו pmMC, מוצגים כערכיt ΔC. Immunofluorescence (E) צביעת עבור PECAM1 (אדום) מעובדים העיקרי מאתר MMEC 24 h לאחר הבחירה חיובי CD31 השני. גרעיני מכתים המכילות דאפי (כחול) הרכבה בינונית; שמאלה = אנטי-PECAM1/דאפי, נכון: שלילי שליטה/דאפי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microvascular תאי אנדותל לספק פונקציות מכשול ברקמות כל התוצאות שלהם לקוי במחלה של האיברים הקשורים 3. יתר על כן, מחקרים ייחודיים של microvascular EC יכול לסלול את הדרך עבור אסטרטגיות טיפוליות חדשות. לכן, הבנה עמוקה יותר של microvascular EC תפקוד בתנאים פיזיולוגיים, הקשורים pathophysiological הוא עניין מדעי רב. אפנון של אינטראקציה ליקוציט/אנדותל משמש בהצלחה לטיפול בחולי טרשת נפוצה עם natalizumab, נוגדנים אשר מונע הידבקות לימפוציט וע י גלגול 6. עם זאת, myopathies שונות כולל את תת-סוגי דלקתיות עדיין נשארים רק טיפול לקוי עד כה. לכן, הבהרה של EC נכסים במיוחד שרירי השלד אנדותל יכול לעזור כדי להרחיב את הטיפולים מיופתיה או תוצאה של רומן גישות טיפוליות.

קווים מונצחים תא אנדותל (IECL) שהוקמו והותאמו המשמש מספר מודלים במבחנה. שורות תאים אלה מציעים כמה יתרונות לעומת ראשי microvascular EC עקב immortalization והתפשטות מהר. יתר על כן, תאים בתרבית הראשי יכול לעבור הזדקנות ביולוגית, לאבד או לשנות שלהם מורפולוגיה או תפקיד פיזיולוגי לאחר זמן או מעברים. עם זאת, IECL רק לשמור על מאפיינים מסוימים של תאי אנדותל ומזכירים לא מגוון שונה בעקיצות האיבר העיקרי microvascular לכלכלת ראוי לציין, שהם לעתים נדירות נגזרות שרירי השלד. עד כה, רק פרסום אחד מתאר את קו האנושי השלד תא אנדותל microvascular בשם TSM15 5. לעומת זאת, EC microvascular מאתר לא שתוארו עד כה. לבסוף, ראשי תאים מחיות הטרנסגניים מספקים הזדמנות ללמוד שינויים גנטיים בתוך חוץ גופית. עם זאת, תרביות תאים ראשי החזק גם החסרונות מסוימים. ראשית, זיהום עם תאים של עניין יכולים להפריע תוקפו של ממצאים ניסיוניים. לכן, את הדיוק של מספר שלבים הבחירה ואת טוהר גבוהה של תאים בודדים יש להבטיח. תא הבולם לאחר דיסוציאציה של רקמת השריר מכיל אריתרוציטים, סוגי התאים תאי כגון תאים חיסוניים, תאים הלוויין, pericytes, fibroblasts, תאי אנדותל 7. לכן, שברים תא לאחר השלב CD31 MCS נבדקו עבור סמני הביעו באופן בלעדי על ידי תאי שריר בלוויין. כמו CD45 הצפוי– CD31– שבר ותאי שריר ראשי הראה ביטוי פקס-7 ו- Cdh15 , ואילו CD45– CD31+ מעובד MMEC מאתר העיקרי היו שליליות עבור סמנים אלה לאחר CD31 השני שלב MCS. יתר על כן בקרת איכות של תאים מבודדים או תרבותי היא בהכרח כדי להבטיח ניסויים לשחזור ואמין. מספר שיטות לבקרת איכות של MMEC מאתר ראשי זמינים: מלבד מיקרוסקופ של מאפיינים מורפולוגיים, flow cytometry, ניתן להשתמש stainings PCR ו- immunofluorescence עבור מאפיין סמני EC (למשל CD31, Sca-1). טוהר הערכה של טרי מבודד MMEC מאתר העיקרי היה רק כ- 60-70%, ואילו הכדאיות של 70% יכול להתגלות. מיקרוסקופיה של תאים אלה מראה באופן חלקי התא וקונצרנים, אשר יכול להיות מורכב של תאים מזהמים כגון fibroblasts או pericytes מחובר לכלכלת לאחר 7 ימים בעיקר תאים שטוח וארוך ותאים ספרואיד יכול להיות שנצפו. עם זאת, שני קטעים CD31 MCS הביא גבוהה הכדאיות וטוהר. גישות אלטרנטיביות כדי להגדיל את טוהר כגון מדיה המכילים puromycin נכשלה ב- MMEC מאתר ראשי בעת היותו יעיל מאתר המוח microvascular EC 8.

מאז microvascular EC נגזר מן הנימים אקספרס צמוד לצומת חלבונים, ביטוי גנים של Cld5, Ocln , Tjp1 ב MMEC מאתר העיקרי לעומת הבדיל תאי שריר נבדקה. כצפוי צפויה כל צומת חזק מולקולות אותרו MMEC מאתר ראשי. לשם השוואה, תאי שריר הפגינו רק נמוך הביטוי של Tjp1, ואילו היתה אפשרות לקבוע שום הבעה של Cld5 ו- Ocln . דפוסי ביטוי דומה היו הפגינו בעבר מאתר כל שרירי השלד. כאן, ביטוי גנים וחלבונים רמה יכול להתגלות Tjp1 אבל לא occludin 9. ניתן למדוד עוד יותר פונקציונלי תכונות כגון עמידות transendothelial.

הפרוטוקול המתואר במסמך זה כולל רק את ניתוקה של EC microvascular של רקמת שריר מאתר. עם זאת, ייתכן להעביר למינים שונים אחרים לדוגמה שפרוטוקול דומה התפרסם העכברוש microvascular EC נגזר רפידות שומן epididymal. כאן, CD31 הבחירה חיובית דרך MCS קדמו צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות 10. גישות דומות היו מוצלחות במנותק EC macrovascular מן החולדה שמנקזים 11 שיטה שפורסמו לאחרונה כדי לבודד EC microvascular של רקמת הריאה והלב משתמש CD31 ו- endoglin (CD105) כמו אנטיגנים תא מגנטי מיון 12. עם זאת, הטוהר של EC יכול לא להיות הגבירו באמצעות הפרדה מגנטית חרוז CD105 נוספים. אפשרות אחרת כדי לבודד ולטהר MMEC מאתר העיקרי הוא תא פלורסצנטיות ססגוניות מופעל מיון (FACS). אוכלוסיה שונות של Sca-1+, CD31+, CD34לעמעום או CD45– תאים מן השרירים מאתר יכול להיות מבודד ולא התאפיינה כמו ראשי מאתר MMEC 13. היתרון בשיטה זו הוא אוכלוסיה EC טהור שניתן ישירות בשימוש או תרבותי לניסויים נוספים (שים לב לכך שלנו מוביל FACS ניסיון עלה מות תאים עקב מתח התא גבוה יותר). תאים נוספים, מת או וקונצרנים של סוגי תאים שונים להפחית באופן משמעותי את המספרים תא מבודד על ידי FACS. בנוסף, הוא דיווח כי ראשי MMEC מאתר מבודדת על ידי FACS היו ללא הצלחה תרבותי-תרבות נפוצים תנאים של 21% O2 ו- 5% CO2. . רמת החמצן היה יותאם ל- 5% עבור הטיפוח-תרגול מספיק 13. יתר על כן, הטכניקה FACS מורכבים יותר, זמן רב, התנאים המוקדמים והתשתיתית יקרים.

את הירך הארבע ראשי musculus את musculus הסובך השלש ראשי של עכברים זכרים בגילאי 4-12 שבועות הם המתאימים ביותר עבור בידוד של ראשי MEC מאתר כפי שהם נגישים בקלות, גדול מספיק עבור בידוד של מספרי הטלפון הנייד מספיקות (5-10 x 105 לכל גרם שריר). לכן, והקפדה כי התנאים הם דומות בניסויים עצמאית. כמתואר לעיל, ראשי תאים יכולים לעבור הזדקנות ביולוגית. לפיכך, להשתמש תאים המתאימים ניסויים מיד מעברים נמוך יותר. לאחר המעבר MMEC מאתר ראשי 8-10 לשנות את המורפולוגיה שלהם, להדגים המחירים התפשטות איטית, מאבדים שלהם סימן דיכוי כסימנים עבור dedifferentiation והזדקנות ביולוגית.

בהמשך ישנם כמה הערות לפתרון בעיות עבור פרוטוקול זה. עבודה סטרילית חיוני כדי להימנע contaminations. פקדים איכות נחוצים צג טוהר ואת הכדאיות של תאים בודדים. בשימוש בחומרים פרוטוקול זה חייב להיות מאוחסן ומוחלים על פי הוראות היצרן. נוספים, גיל ומין של חיות בשימוש, כמו גם קבוצות שרירים שונות עלולה להשפיע את האיכות ואת comparability של תאים מבודדים בניסויים.

הפרוטוקול המתואר להתייחס כשיטת פלטפורמה כדי לבודד EC microvascular העיקרי של שרירי השלד. תאים בודדים יכול לשמש עבור מספר יישומים כדי לקבל עוד יותר תובנות לגבי תפקוד שריר-מחסום-דם. תאים מתאימים הן חלבון ו RNA ביטוי מחקרים וכן מבחני פונקציונלי (כולל לימודי גלגול והצמדות). עם זאת, פרוטוקול זה היה אופטימיזציה עבור לימודי התמקדות תהליכים דלקתיים, ולכן שינויים קלים. ייתכן שיהיה צורך ביחס שטחי מחקר שונים.

המודל מורכבים המרחבי פונקציונלי באינטראקציה תאית בתוך MVU, MMEC מאתר ראשי יכול לטפח במערכות תרבות תלת התא מורכב יותר יחד עם סוגי תאים אחרים. פרוספקטיבי, זה גם צריך להיות אפשרי לייצר MVU organoids כמו זה תואר בשביל לרקמות אחרות לפני 14. עם זאת, הבידוד מוצלח של ראשי MMEC מאתר בלתי נמנע עבור מכוון זה הצעד הבא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי "אחר Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 ל יח), "חדשני Medizinische Forschung (קרן המטבע) מינסטר" (I-RU211811 כדי TR) וקרן מחקר גרמני (DFG, מוסד 2105/27-1, לי 3283/5-1 ולי 3283/6-1 כדי SGM). תמונות מאויר שסופקו על-ידי האיקה בלום.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Tags

מדעי המוח גיליון 145 לתא הבידוד מאתר microvascular תאי אנדותל תאי שריר השלד מחסום הדם שריר יחידת myovascular מיופתיה
בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müntefering, T., Michels, A. P. … More

Müntefering, T., Michels, A. P. E., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter