Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58901
Automatic Translation
*1, *1, 1, *1, *1
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster
* These authors contributed equally

Summary

Mikrovasküler endotel hücreleri iskelet kas (MMEC) kas kılcal iç duvar şekil ve her ikisi de, düzenleyen sıvıları/molekülleri ve geçiş (bağışıklık) hücre arasında kas doku ve kan değişimi. Birincil fare MMEC, yalıtım burada açıklandığı gibi kapsamlı tüp bebek araştırmalar "myovascular birimi" sağlar.

Abstract

İskelet kas kılcal damarlar (kas mikrovasküler endotel hücreleri, MMEC) endotel hücrelerinin kan akışı ve iskelet kasları bulaşıcı karşı immün yanıt yanı sıra sıvı ve besin alışverişini düzenleyen arasındaki bariyeri oluşturmak ajanlar bağışıklık hücre geçiş kontrol ederek. Bu işlevler için MMEC şeklinde bir işlevsel "myovascular birimi" (MVU), fibroblastlar, perisitlerden ve iskelet kas hücreleri gibi daha fazla hücre tipleri ile. Sonuç olarak, bir işlev bozukluğu MMEC ve bu nedenle MVU myopathies geniş bir çeşitlilik katkıda bulunur. Ancak, MMEC düzenleyici mekanizmaları sağlık ve hastalığında yeterince anlaşılır kalır ve onların aydınlatma daha spesifik tedaviler myopathies için önce. Yalıtım ve MVU bağlamında birincil MMEC fonksiyonların derinlemesine soruşturma bu süreçlerin daha iyi bir anlayış dahakolaylaştırabilirdi.

Bu makalede birincil fare MMEC iskelet kas arıtma ve kültür bakım adımlar da dahil olmak üzere mekanik ve enzimatik ayrılma tarafından yalıtmak için bir protokol sağlar.

Introduction

Kan yolu ile hücre ve organların oksijen, yüzeyler ve gerekli diğer molekülleri ile sağlanır. Bu değişim kılcal damarlar, en küçük gemiler yer alır. Kılcal damarlar kas homeostazı intravasküler ve interstisyel alanı arasında başarılı düzenlenmesi için bir ön koşul olan bütünlüğü kalır bir iç endotel hücre (EC) tabaka meydana gelir. EC çözünür faktörler ve hücrelerin seçici bir geçiş sağlamak için bir tarafından sıkıca birbirine monolayer ve adherens kavşaklar 1oluşturmaktadır. Besin veya metabolik ürünler için engel olarak rolünü yanı sıra, EC düzenleyen lökosit inflamatuar süreçlerde alımı. İltihap veya doku hasarı için adezyon moleküllerinin bir up-yönetmelik EC yüzey ve lökosit eki ve Hicret hedef doku 2içine kolaylaştıran kemokinler üretimine yol açar. Sonuç olarak, EC eleştirel söz konusu olursa patojenleri ya da doku tamiri karşı savunma gibi iltihabi süreçleri düzenlenmesi.

EC disfonksiyon doğrudan olduğunu vasküler hastalıklar, kronik böbrek yetmezliği, Venöz tromboz ağır patojen enfeksiyonları ile ilişkili. Ayrıca, EC hemen hemen her zaman söz konusu olursa organ özgü otoimmünite diabetes mellitus veya multipl skleroz 3gibi. Kan akışı ve organları arasında bariyer fonksiyonu bu nedenle farklı hücre türleri uyumlu bir etkileşim tarafından kontrol edilir. İskelet kas mikrovasküler endotel hücrelerinde (MMEC) ile birlikte kas hücreleri, fibroblastlar ve perisitlerden fonksiyonel ünitesi, "myovascular ünitesi" formu (MVU). Bu nedenle, işlev bozukluğu MVU myopathies Patofizyoloji kritik bir rol oynamaktadır. Ancak, düzenleyici mekanizmaların daha derin bir anlayış hâlâ kayıp ve şu anda myopathies yeni, acilen gerekli, tedavi hedefleri tanımlaması engellemektedir.

Karmaşık fizyolojik ve patofizyolojik mekanizmaları araştırmak için hayvan modelleri yaygın olarak kullanılır. Ancak, vitro modelleri faiz konusunda çeşitli karıştırıcı etkenlere hariç tutarak odaklanmak için avantaj sunuyor. Süreçleri araştırmak için tüp bebek bu saf ve uygun Primer hücre izole etmek gereklidir. Aksine hücre hatları, Primer hücre Transjenik hayvanlar izole genetik değişiklikler tüp bebek sonuçlarını araştırmak için etkinleştirin.

Burada, birincil fare MMEC izole etmek için bir yöntem mekanik ve enzimatik ayrışma teknikleri (MCS) arıtma için sıralama manyetik aktif hücre ardından kod sayfası kullanılmıştır. Bu amaçla, manyetik boncuklar belirli yüzey işaretleyicileri karşı kullanılır. Trombosit endotel hücre adezyon molekülü-1 (PECAM1, CD31) EC sayılı esas olarak ifade edilir ve bu hücre tipi zenginleştirmek için kullanılabilir. Yüksek hücre saflık emri için hücreleri hematopoetik kökenli bir negatif seçim tarafından için protein tirozin fosfataz reseptör tip C (PTPRC, CD45) hariç tutulur. Ayrıca, kalite denetimleri, birincil fare MMEC, potansiyel uygulamalar ve sınırlamalar yanı sıra özel hususlar ekimi sunulmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri yerel makamlar tarafından onaylanmış ve Alman hayvan hakları yasası (84-02.05.20.13.097) göre yapılmıştır.

1. genel açıklamalar üzerinde hayvan deneyleri

  1. Tüm fare deneyleri ilgili Kurumsal hayvan bakımı yönergelere uygun olarak gerçekleştirmek ve komite kullanın.
  2. Fareler standart koşullar altında ve Federasyon laboratuvar hayvan bilim dernekler (FELASA) gibi uluslararası kurallara göre tutmak.
    Not: Genel olarak bu yalıtım teknik fareler yaş, cinsiyet ya da genetik geçmişi bağımsız için kullanılabilir. Biyolojik özellikleri yaş ve cinsiyet ile değişebilir çünkü yeterli bir cep numarası almak için 4 – 10 hafta eski tercih edilen, erkeklerdir.

2. çözüm, medya ve kaplama hazırlanması

  1. Sindirim çözüm (DS) 2,2 mL, Dulbecco´s modifiye kartal orta (DMEM) ile 200 μL karıştırılarak hazırlamak Collagenase-Dispase ve 45 μL Desoxyribonuclease (Dnaz).
  2. Endotel hücre orta (ECM) 500 mL 50 mL FCS ile DMEM (yaklaşık %10), 0.25 mL temel fibroblast büyüme faktörü bFGF (20 μg/mL; yaklaşık % 0.05) 450 mL karıştırarak hazırlayın ve 5 mL penisilin-streptomisin (yaklaşık % 1). Steril filtrasyonu bir cam tüp içinde gerçekleştirmek (filtre gözenek çapı: 0,2 mikron). Daha sonra çözüm 4 ° C'de depolayın
  3. Hücre kültür plakaları aşağıda açıklandığı gibi kat.
    1. Taze izole birincil fare MEC kapak ekimi için 1 mL 6 kuyu başı ile tüm yüzeyi de hücre kültür plaka göre jelatin hız kaplama solüsyonu ( Tablo malzemelerigörmek) Oda, 3-5 min için üreticinin yönergelerine uygun Sıcaklık (RT).
    2. Aspire edin ve kaplama çözüm atın. Her şey 2 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.1-7,5 iki ardışık çamaşır adımda ile yıkayın.
    3. Aspire edin ve PBS atın. Wells ECM hacmi 1 mL ile doldurmak.

3. yalıtım birincil fare kas mikrovasküler endotel hücre (MMEC)

  1. Bir yetişkin ötenazi 4-12 hafta yaşlı, erkek fare ile herhangi bir anestezi olmadan servikal çıkığı. Hızlı bir şekilde--dan böylece hayvan ile hızlı ve acısız bir ölüm sağlamak için beyin omurilik ayırmak için amaçtır.
  2. Ekstremitelerde sever.
    1. Cerrahi keskin/künt (kesme kenarı 42 mm, düz) kullanın ve keskin/keskin (kesme kenarı 23 mm, düz) Çalışma platformları, kent (tırtıklı, 2 mm x 1,25 mm x 12 cm) ve bir eğri (tırtıklı, 1.3 mm x 1 mm x 13 cm) forseps.
    2. % 70 etanol ile tüm cerrahi aletler dezenfekte.
    3. Hayvan sırtında konumlandırın, bacaklar % 70 etanol ile nemlendirin. Tüm bacak, Kalça eklemi keskin/blunt Cerrahi makas ile keserek sever. Ekstremitelerde bir kapalı hücre kültür tabak (35 mm x 10 mm) yerleştirin.
      Not: Şu andan itibaren her adımda bir steril laminar akış başlık altında gerçekleştirmek ve sterilize edilmiş aletlerde iş.
  3. Kas dokusu izole (tercihen musculus kuadriseps kemiği veya musculus triceps surae her iki bacakta üzerinden kullanın).
    1. Deriyi kalça ayak ucunu açık bir keskin/keskin makas ve eğri forseps kullanarak kesme. Ayak veya footpad düz Forseps ile tutun. Kalça için ayak üzerinden forseps eğri ile derisini soyma.
    2. Musculus kuadriseps kemiği diz tendon keserek ayırmak ve kas kalça için uyluk boyunca sever. Musculus triceps surae Aşil tendonu kesilmesinin tarafından izole et. Bundan sonra popliteal fossa tibia kesmek ve kas kaldırın.
      Not: Büyük gemilerin (A. femoralis, A. tibialis anterior, A. tibialis posterior, A. fibularis) kasları izole görünür, damarları tekrarlamışlar endotel tarafından kirlenmesini önlemek için kaldırın.
    3. Büyük gemilerin kaldırmak için büyük gemilerin kavisli bir Forseps ile içermeyen kas bölümünü tutan ve geminin yanında kesmek. Bu iletişim kuralı için 1 g veya daha az kas dokusu kuadriseps kemiği ve triceps surae eşit önerilir.
    4. Bir hücre kültür çanak (35 mm x 10 mm) (Kimden adım 2.1) 2,445 µL DS ekleyin ve ağırlığı belirlemek.
    5. 2445 µL DS içeren bu hücre kültür yemek için kas taşlarını aktarmak ve ağırlığı belirlemek. Her iki ölçüm değerleri fark kuru ağırlığı 1 g'ü kas dokusunun sağlar.
    6. Tüm kas dokusu keskin/keskin makas kullanarak (≤2 mm küpleri, yaklaşık 100 adet) küçük parçalar halinde kes.
  4. Kas dokusu ayırmak.
    Not:     bu adım yaklaşık 120 dakika sürer.
    1. 37 ° C'de % 5 CO2(kuluçka) 1,5 h. için mağaza kas/DS süspansiyon süspansiyon dikkatle her 20 dk 1 mL insülin kullanarak yaklaşık 5 min için karıştırın.
    2. Aracılığıyla akış toplamak ve süspansiyon 70 mikron naylon hücre süzgeç bir 50 mL tüp yerleştirilir transfer. Hücre süzgeç DMEM 8 mL ile yıkama ve aracılığıyla akış toplamak.
    3. Hücre süzgeç ve santrifüj süspansiyon 300 x g 20 ° C'de 10 dakika için atmak Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın.
      Dikkat: Pelet kaybetmek kolay.
    4. Hücre Pelet amonyum klorür potasyum (ACK) lysing arabelleği 1 mL resuspend (içine Malzeme tablobkz:) kırmızı kan hücre lizis için ve kuluçkaya 30 RT. eklemek 9 mL DMEM s + % 10 FCS 15 mL t tepki ve transfer hücre süspansiyon durdurmak için UBE.
  5. CD45 tüketmek+ hücreleri CD45 lastikteki üreticisinin yönergeleri izleyin. CD45 tüm aşağıdaki adımları için+ tükenmesi MCS arabellek kullanın (bkz. içine malzeme tablo).
    Not:     bu adım yaklaşık 60 dakika sürer.
    1. Odası sayma Neubauer hücre kullanarak cep numaraları belirlemek (g kas dokusu başına yaklaşık 5 x 106 hücre beklemek).
    2. Santrifüj süspansiyon 300 x g 4 ° C'de 10 dk de Tamamen süpernatant geçirmek ve hücre Pelet 90 µL MCS arabellek (107 hücreleri veya daha az) içinde resuspend. CD45 lastikteki (107 hücreleri veya daha az) 10 μL ekleyin.
    3. Hücre süspansiyon mix ve buzdolabında 4-8 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
    4. 1 mL MCS arabellek (107 hücreleri veya daha az) ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g , santrifüj Süpernatant tamamen kaldırmak ve 500 μL MCS arabellek hücrelerde resuspend.
    5. Manyetik hücre ayrılması için 8 mL rezervuar hacmi ve 2 x 109 toplam hücre kapasitesi ile büyük bir manyetik sütun (IMC) kullanın. LMC ayırıcı manyetik alanına getirin.
    6. MCS arabellek ile 3 mL LMC göle durulayın. Sonra durulama, 15 mL konik tüp ile akış toplamak için sütununun altında yerleştirin. Bütün hücre süspansiyon (500 µL) sütuna uygulamak ve tamamen akış izin verin.
    7. Göle 3 mL MCS arabelleği ekleyerek sütun üç kez yıkama ve column´s rezervuar sonraki çamaşır adım gerçekleştirmeden önce boş olana kadar bekleyin.
    8. Toplamak sütunu geçen etiketlenmemiş hücreleri daha fazla ayırma adımları için kullanın (CD45 temsil eden- kesir). Hücreleri etiketli (CD45 temsil eden+ kesir) içinde birikmiş sütunu atılır.
  6. CD31 birikir+ hücreleri aşağıdaki CD31 lastikteki prosedürü yerine getirin. CD31 tüm aşağıdaki adımları için+ birikimi MCS arabellek kullanın.
    Not:     bu adım yaklaşık 60 dakika sürer.
    1. Odası sayma Neubauer hücre kullanarak cep numarasını belirlemek (g kas dokusu başına yaklaşık 4 x 106 hücre beklemek).
    2. Santrifüj etiketlenmemiş hücre süspansiyon adım 3.5 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için elde edilen
    3. Süpernatant tamamen kaldırın. Pelet 90 μL MCS arabellekte resuspend ve 10 μL CD31 lastikteki (107 toplam hücreleri veya daha az) ekleyin. Bütün süspansiyon mix ve buzdolabında 4-8 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
    4. 1 mL MCS tampon ve santrifüj 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için ekleyin Süpernatant almak ve MCS arabelleği 500 µL hücrelerde resuspend.
    5. Manyetik hücre ayrılması için 3,5 mL rezervuar hacmi ve 2 x 108 toplam hücre kapasitesi ile orta manyetik sütun (MMC) kullanın.
    6. MMC ayırıcı manyetik alanına getirin. MMC 500 µL MCS arabelleği ile yıkayın. Sonra durulama, 15 mL konik tüp ile akış toplamak için sütununun altında yerleştirin.
    7. Bütün hücre süspansiyon (500 µL) sütuna uygulamak ve tamamen akış izin verin.
    8. Sütun 500 µL MCS arabelleği ekleyerek üç kez yıkama ve sonraki çamaşır adım gerçekleştirmeden önce sütunun rezervuar boşalana kadar bekleyin. Sütun geçen etiketlenmemiş hücreleri gösteren CD45- CD31- kesir. Onları daha fazla kalite kontrolleri için saklayın.
    9. Sütun ayırıcı kaldırmak ve bir uygun toplama tüp (15 mL tüp) yerleştirin. Bir pipet 2 mL MCS arabellek sütuna. Hemen manyetik olarak etiketli hücreleri sıkıca sütuna pistonu iterek sifonu çek. Bu CD45- CD31+ kesir temsil eden zenginleştirilmiş birincil fare EC
    10. Santrifüj hücre süspansiyon 350 x g 20 ° C'de, 5 min için Süpernatant tamamen kaldırmak ve 1 mL ECM (0,6 x 10 g kas dokusu başına6 hücre bekliyoruz) hücrelerde resuspend (bkz. Adım 2.2.). Hücreler (0.5-0.7 x 106 hücreleri) kaplamalı 6-şey kültür plaka tek bir şey için (Adım 2.3) Aktarım ECM 1 mL içeren.
  7. Tarım için hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 steril bir kuluçka kuluçkaya. ECM her iki üç günde yenileyin.

4. birincil fare MMEC arıtma

  1. CD31 ikinci bir döngü gerçekleştirmek+ birikimi, üreticinin yönergeleri izleyin (CD31 lastikteki fare Protokolü; Bkz. Adım 3.6.).
    1. (Genellikle 7 gün sonra) 80-%90 izdiham olduklarında hücreleri tripsin/EDTA çözüm ile bağlantısını kesin. Bunun için her şey iki ardışık çamaşır adımda 2 mL steril PBS ile yıkayın. 6-şey başına 800 μL tripsin/EDTA çözüm kullanın ve 37 ° C ve % 5 CO2 3-5 dk. Stop enzimatik aktivite için steril bir kuluçka kuluçkaya 1200 μL en az % 10 FCS içeren DMEM kullanarak.
    2. Hücre süspansiyon vasıl 350 x g 20 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi
    3. Saflık (CD31 lastikteki manufacturer´s yönergeleri için according; 3,6 bakın.) artırmak için ikinci CD31 MCS adımı gerçekleştirin.
    4. Hücre izdiham yolu ile parlak alan veya çift faz kontrast mikroskobu kullanarak gözlemlemek bir
      20 x büyütme ve sayısal 0,35 lens diyaframı. Bkz: şekil 1.
      Not: Hücreleri ilgili deneyler için kullanılan ya da kültür passaging tarafından tutulur. Hücreleri hemen alt geçit olarak deneyler için kullanın. Sonra geçiş hücreleri kullanmak için tavsiye edilmez
      8 – 10.

5. kalite kontrol

  1. Akış Sitometresi birincil fare MMEC, ikinci CD31-MCS-adım sonra gerçekleştirin.
    1. 1 mL Akış Sitometresi (FC) arabellek ekleyerek bir FACS tüp hazırlayın (içine Malzeme tablobakınız).
    2. Ne zaman onlar are %100 izdiham (genellikle 14 gün sonra) hücreleri tripsin/EDTA çözüm ile bağlantısını kesin. Bunun için her şey iki ardışık çamaşır adımda 2 mL steril PBS ile yıkayın. 6-şey başına 800 μL tripsin/EDTA çözüm kullanın ve 37 ° C ve % 5 CO2 3-5 dk. Stop enzimatik aktivite için steril bir kuluçka 1200 μL kullanarak kuluçkaya % 10 FCS içeren DMEM.
    3. Hücre sayımı odası ve en az 1 x 105 hücre için hazırlanan FACS tüp eklemek bir Neubauer kullanarak cep numarasını belirleyin.
    4. Santrifüj hücre süspansiyon vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika Süpernatant kaldırarak, 1 mL FC arabelleğe hücrelerde resuspending ve 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için centrifuging iki çamaşır adımı gerçekleştirin
    5. Anti-fare CD31-FITC antikor (1: 100) ve anti-fare CD45-PE (1: 100) FC Arabellek ile ekleyerek boyama bir karışım hazırlayın.
    6. FACS tüpler karışımda boyama 100 μL hücrelerde resuspend. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya FC arabelleğe 1 mL ekleyin. Santrifüj hücre süspansiyon vasıl 300 x g 4 ° C'de 5 min için Dikkatle süpernatant kaldırmak ve FC arabelleği 200 μL hücrelerde resuspend.
    7. Perdeleme strateji şekilde gösterildiği bir Akış Sitometresi aşağıdaki hücrelerde ölçmek. 2A.
  2. Alternatif olarak ayirt birincil fare MMEC ikinci CD31-MCS-adım sonra boyama gerçekleştirmek.
    1. Kat coverslips.
      1. Steril 13 mm çapında yuvarlak cam coverslip 24 iyi plaka bir kuyunun içine aktarın. Coverslip hız kaplama çözüm iyi başına 300 µL ekleyerek kat. 3-5 dk, oda sıcaklığında (RT) için kuluçkaya.
      2. Aspire edin ve kaplama çözüm atın. Her şey iki ardışık çamaşır adımda 2 mL steril PBS ile yıkayın. Aspire edin ve PBS atın.
      3. Tohum 1 x 105 1 ml ECM kaplı coverslip üzerinde hücreleri ve hücre % 99 birleşmesi kadar 37 ° C ve % 5 CO2 steril bir kuluçka kuluçkaya.
    2. Fiksasyon ve ayirt boyama gerçekleştirmek.
      1. ECM orta ekili hücre 5.2.1.3 kaldırın.
      2. Kültürlü hücreleri ile pH 7.4 şey, 4 ° C'de 10 dakika başına 300 µL % 4 paraformaldehyde (PFA) ekleyerek düzeltmek
        Uyarı: İngiltere'de yılın toksik ve bakımı ile ele alınması gerekir.
      3. 1 mL PBS iyi başına ekleyerek 3 çamaşır adımlarını gerçekleştirin ve RT., 5 dk sonra süpernatant kaldırmak
      4. Hazırlamak bir engelleme çözüm içeren % 5 BSA, PBS % 0,2 Triton-X ve % 1 keçi serum.
      5. Her şey için 300 µL engelleme çözüm ekleyin ve RT. 1 h için kuluçkaya
      6. Süpernatant kaldırmak ve bir anti-PECAM-1 (CD31) antikor (1: 200) kuyu başına 200 µL % 5 BSA, % 1 keçi serum PBS içinde ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
      7. 3 adımları iyi başına 1 mL PBS ekleyerek veya kaldırarak her adımda RT, 5 dk sonra süpernatant yıkama gerçekleştirin.
      8. % 1 BSA ve PBS Cy3 Birleşik Anti-sıçan IgG antikor (1:500) içeren bir ikincil antikor çözüm hazırlamak. İkincil antikor çözüm kuyu başına 300 µL ekleyin ve karanlıkta RT, 1 h için kuluçkaya.
      9. 3 adımları iyi başına 1 mL PBS ekleyerek veya kaldırarak her adımda RT, 5 dk sonra süpernatant yıkama gerçekleştirin.
    3. Yuvarlak cam coverslips dikkatle Forseps ile almak ve mikroskopi slayt aktarın. Orta içeren DAPI hücre katmanı üzerinde montaj uygun bir miktar eklemek ve dikkatli bir cam üzerinde (kapalı Tablo reçetesigörmek) koymak.
    4. Hücreleri Floresan ışık kaynağı (120 W) ile donatılmış bir uygun Floresans mikroskobu ile gözlemlemek ve iki kümeleri filtre: bir uyarma/emisyon filtresi ayarla 550/25 ile nm ve 605/70 nm dalga boyu Cy3 540/562 nm algılamak için.
    5. 365/50 bir uyarma/emisyon dalga boyu ile ayarla ikinci filtre kullanmak nm ve 445/50 nm DAPI 350/440 nm algılamak için. 40 x büyütme ve % 80 şiddette, DAPI için 14,5 mW/cm2 30 Bayan Cy3 algılanması için bir satın alma süresi 60 ms bir satın alma süresi ile 67,5 mW/cm%2 80'i kullanır.
  3. Kantitatif PCR gerçekleştirin.
    1. MRNA izolasyonu.
      1. Standart prosedürler mRNA yalıtmak için bir asit guanidinium thiocyanate-fenol (AGTP) Reaktif kullanarak izleyin. X 106 CD45 hücrelerden en az 0,5 kullanmak- CD31- (bkz. Adım 3.6.8) CD45- CD31+ (bkz. Adım 3.6.9.) kesirler ve ekili birincil fare MMEC (4.1.3)
      2. Santrifüj hücre süspansiyon vasıl 300 x g 20 ° C'de 10 dakika Tamamen süpernatant geçirmek. Hücre Pelet AGTP reaktif ve transfer hücre süspansiyon 500 µL içinde 2 mL tepki tüp içine resuspend. Dik, 5 min için kuluçkaya
      3. Kloroform 100 µL ekleyin ve shake şiddetle RT. adlı 3 dk 15 s. Incubate için
      4. Santrifüj süspansiyon, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika
      5. (RNA içeren) üst sulu faz dikkatlice ve 1,5 mL tepki tüp içine aktarın. İsopropanol 250 µL ekleyin ve 10 dk RT. az için kuluçkaya
      6. 4 ° C'de 10 dakika için 12.000 x g Santrifüjü adımda gerçekleştirmek
      7. Süpernatant almak ve 1 mL % 75 etanol dikkatle ekleyin. 4 ° C'de 5 min için 7.500 x g , santrifüj
        Not: Pelet kaybetmek kolaydır.
      8. Süpernatant tamamen kaldırın. 5 – 10 dakika yayında kuru Pelet izin.
        Not: etanol ihtiyacı var ama kaldırılacak çok fazla kuru değil.
      9. Pelet 30 µL tedavi diethylpyrocarbonate içeren su ve ısı 55 ° C'de 10 dakika içinde erimesi
        Not: RNA konsantrasyon ve saflık bir tayf-Foto ölçüler tarafından ölçülebilir.
    2. CDNA sentezi (ters transkriptaz PCR) gerçekleştirin.
      1. İçeren bir mastermix hazırlamak: 10 µL PCR arabellek (5 x), 2,5 µL desoxyribonucleosid-trifosfat (dNTP (10 mM)), 0,5 µL rasgele karışım tek iplikçikli astar (0.2 µg / µL), 1 µL RNase inhibitörü (40 U / µL, 0,4 ters transkriptaz (200 U/µL) ve 5.6 µL diethylpyrocarbonat tedavi su (bkz: kapalı malzemeler tablo).
      2. 500 ng RNA suda 30 µL tedavi diethylpyrocarbonate 0.2 mL PCR tüpleri ve tüm 20 µL mastermix ekleyin sulandırmak.
      3. PCR cycler adımları kullanın: 10 dk 25 ° C, 30 dk 50 ° C, 5 dk 85 ° C ve 4 ° C'de tutun
  4. Kantitatif PCR (qPCR) gerçekleştirin.
    Not: QPCR örneklerin çoğaltmaları veya triplicates yerine getirmek.
  5. Astar iki farklı floresan boyalar ile kullanın. Astar ile 495 bir emilimini nm ve Salma 517 nm gen ilgi için.
  6. Eşli kutu protein 7 için astar (Pax7) ve M-cadherin (Cdh15) uydu hücre marker gen ekspresyonu tespiti için kullanın (bkz. içine Malzeme tablo).
  7. Astar claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) ve zonula occludens-1 (Tjp1 veya ZO1) endotel hücre marker gen ekspresyonu algılaması için kullanabilir (bkz: kapalı malzemeler tablo).
  8. 18s için referans gen olarak rRNA, kullanım astar 538 emilimini ile a nm ve Salma 554 nm dalga boyu.
  9. Her gen ilgili astar ile ilgi için bir qPCR mastermix hazırlayın. Mastermix içerir: 10µl qPCR arabellek (2 x), gen ilgi (10 µM), astar 1 µL 18s için astar 1 µL rRNA ve su Ücretsiz 4 µL nükleaz.
  10. Mastermix 16 µL 96-iyi tepki plaka tek bir şey için ekleyin. 4 µL de mastermix içeren başına cDNA (5.3.2 adımından sağlanır.) ekleyin.
  11. Bir gerçek zamanlı PCR cycler adımları kullanın: 1 min için 10 dk. Bisiklete binme sahne 40 çevrimleri ile 95 ° C 15 s ve 60 ° C ile 50 ° C için 2 dk ve 95 ° C sahne tutarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir gün sonra yalıtım, birincil fare MMEC ve kalan diğer hücreleri ikinci büyük şirketler oluşturmak ve kültür yemekleri (şekil 1A gün 1) altına uygun. Günden sonra 7, düz ve uzun hücreleri görülebilir. Ancak, diğer, çoğunlukla küresel hücreleri, kirlenme hala görülür (şekil 1A gün 7). Böylece, başka bir döngüsü CD31 pozitif seçim yoluyla MCS gereklidir. Bundan sonra birincil fare MMEC bir yoğunluğu yaklaşık % 80-90 çoğalırlar. İzdiham onlar genellikle üst üste monolayer boyuna hizalanmış hücre (şekil 1A gün 14) oluştururlar. İzdiham nedeniyle iletişim-inhibisyon üzerine yayılması durur. Hakkında 14 gün sonra 5-10 x 105 hücreleri olabilir daha ileri araştırmalar için kullanılabilir.

Akış Sitometresi ile kalite kontrol tamir edilebilir canlılığı boya FVD780 (ölü hücreler için leke için), kullanarak PECAM1 (CD31) ve PTPRC (CD45, hücreleri hematopoetik kökenli için işaretleyici olarak) canlılık ve saflık yaklaşık %70 her hücre için değişen değerleri gösterdi hemen yalıtım sonra (şekil 2A). Hücreleri başka bir CD31 pozitif seçim yoluyla sonra ekili MCS, gösterdi kadar % 95'e her (şekil 2B) arasında değişen canlılığı gelince de saflık için değerleri tatmin edici.

Seçimi doğruluğunu değerlendirmek için adımları, hücreleri elde daha fazla kas uydu hücre işaretçisi genler Eşli kutu protein 7 gen ekspresyonu (Pax7) ve M-cadherin (Cdh15) için mRNA düzeyde kantitatif PCR (qPCR) tarafından araştırıldı. Birincil fare MMEC (pmMMEC) ve farklılaştırılmış birincil fare kas hücreleri (pmMC) sırasıyla negatif ve pozitif kontrol kullanılmıştır. Fare kas hücreleri ticari olarak satın alındı. Beklendiği gibi sadece CD45- CD31 ise- kesir yanı sıra pmMC Pax7 ve Cdh15, ifade CD45- CD31+ ve birincil fare MMEC negatif bu işaretleri (şekil 2C).

Kılcal endomysium iskelet kas hızlı sıkı kavşak proteinler 4,5EC türetilmiş. QPCR, claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) ve zonula occludens-1 (Tjp1 veya ZO1) / Konfluent birincil fare MMEC ifadeden sonra ikinci CD31 MCS kullanarak adım değerlendirilmiştir. PmMC denetimleri (şekil 2B) kullanılmıştır. PmMC yalnızca göster ise Tjp1düşük ifade birincil fare MMEC Cld5, Ocln ve Tjp1, yüksek düzeyde dile getirdi. Ayrıca, kalite kontrol boyama ayirt PECAM1 endotel özgü işaretleyicisinde birincil fare MMEC (şekil 2E) yüzey ifade doğruladı.

Figure 1
Şekil 1: birincil fare MMEC morfolojisi. (A)faz kontrast mikroskobu gün 1-14 tarafından kültürlü birincil fare MMEC temsilcisi görüntüsü. D1 = gün 1, d7 gün 7, d14 = = gün 14. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: birincil fare MMEC kalite kontrolü. Strateji kullanarak (I) FSC/SSC, (II) FVD780 ve (IIIa) CD45, (IIIB) CD31 akış sitometrik çözümlenmesi için birincil fare MMEC hemen sonra yalıtım(a)ve günde 15 (B) geçişi (kesikli çizgiler izotip kontrol =). (C) ifade düzey Pax7 ve M-Cadherin (Cdh15) CD45 içinde- CD31-, CD45- CD31+ kesirler MCS izolasyon de olduğu gibi birincil fare MMEC (pmMMEC) ve birincil fare kas hücreleri (pmMC sonra ). İfade düzeyleri ND ΔCt değerleri (örnek - 18S rRNA), olarak gösterilir kararlı = değil. (D) ifade sıkı kavşak proteinler claudin-5 (Cldn5), occludin (Ocln) veya zonula occludens-1 (Tjp1 veya ZO-1) pmMMEC ve pmMC, ΔCt değerleri olarak gösterilen düzey. (E) ayirt PECAM1 için (kırmızı) ekili birincil fare MMEC 24 h ikinci CD31 olumlu seçimden sonra boyama. Nükleer DAPI içeren (mavi) Montaj orta ile boyama; anti-PECAM1/DAPI, şu = yaptı: negatif kontrol/DAPI. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrovasküler endotel hücreleri bariyer işlevleri tüm dokularda ve ilişkili organları 3hastalığında disfonksiyon sonuçları sağlar. Ayrıca, organ özel çalışmalar mikrovasküler EC yeni tedavi stratejileri için önünü açabilir. Bu nedenle, mikrovasküler EC işlevi fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında daha derin bir anlayış büyük bilimsel ilgi. Modülasyon lökosit/endotel etkileşim başarıyla natalizumab, lenfosit yapışma önleyen bir antikor multipl skleroz tedavisinde kullanılan ve böylece hicret 6. Ancak, hala inflamatuar alt türlerini de dahil olmak üzere çeşitli myopathies sadece bugüne kadar kötü tedavi edilebilir kalır. Bu nedenle, aydınlatma EC özellikleri olarak kas iskelet endotel içinde myopathy veya yeni tedavi yaklaşımları sonucu mevcut tedaviler genişletmeye yardımcı olabilir.

Ölümsüzleştirdi endotel hücre hatları (IECL) kurulmuş ve birkaç tüp bebek modelleri için kullanılır. Bu hücre satırları əbadoləşdirmək ve hızlı yayılması nedeniyle birincil mikrovasküler EC göre bazı avantajlar sunuyor. Ayrıca, birincil kültürlü hücrelerin yaşlanma geçmesi ve kaybetmek veya onların morfolojisi ya da fizyolojik fonksiyon bazı zaman veya pasajlar sonra değiştiremezsiniz. Ancak, IECL sadece bazı endotel hücre özelliklerini koruyan ve farklı organ kaynaklı birincil mikrovasküler EC çeşitli benzer olamaz Not, onlar nadiren iskelet kasları türetilmiştir. Bugüne kadar sadece tek bir yayında TSM15 5adlı bir insan iskelet mikrovasküler endotel hücre satır açıklar. Buna ek olarak, fare mikrovasküler EC değil tarif edilmiş defa. Son olarak, Primer hücre transgenik hayvanlardan genetik değişiklikler içinde vitroçalışma fırsatı sağlar. Ancak, birincil hücre kültürlerinde de bazı tuzaklar tutun. İlk olarak, hiç ilgilendirmiyor hücreleri ile kirlenme deneysel bulgular geçerlilik süresiyle etkileyebilir. Bu nedenle, yüksek saflıkta izole hücre ve birkaç seçim adım doğruluğu garanti gerekir. Hücre süspansiyon sonra ayrılma kas dokusunun eritrositler ve bağışıklık hücreleri, uydu hücreleri, perisitlerden, fibroblastlar ve endotel hücreleri 7gibi farklı mononükleer hücre türleri içerir. Bu nedenle, hücre kesirler CD31 MCS adım sonra sadece kas uydu hücreleri tarafından ifade edilen işaretçileri için test edildi. Beklenen CD45 olarak- CD31- kesir ve birincil kas hücreleri gösterdi Pax-7 ve Cdh15 ifade, oysa CD45- CD31+ ve ekili birincil fare MMEC sonra ikinci bir CD31 bu işaretleri için negatif MCS adım. Ayrıca bir kalite kontrol izole veya kültürlü hücre kaçınılmaz olarak güvenilir ve tekrarlanabilir deneyler garanti etmektir. Birincil fare MMEC kalite kontrolü için çeşitli yöntemler kullanılabilir: mikroskobu morfolojik özelliklerinin yanı sıra Akış Sitometresi, PCR ve ayirt stainings karakteristik EC işaretleri (CD31, ani kalp durması-1)-ebilmek var olmak kullanılmış. Taze izole birincil fare MMEC değerlendirilmesi saflık sadece yaklaşık % 60-70, % 70'i bir canlılık tespit iken. Bu hücrelerinin mikroskopisi kısmen fibroblastlar veya EC için bağlı perisitlerden gibi bulaşıcı hücre oluşur hücre şirketler gösterir 7 gün sonra esas olarak düz ve uzun hücreleri ve küresel hücreleri görülebilir. Ancak, iki CD31 MCS pasajlar yüksek canlılık ve saflık sonuçlandı. Puromisindir içeren medya başarısız olarak saflık artırmak için alternatif yaklaşımlar içinde antikorundan etkili olurken birincil fare MMEC mikrovasküler EC 8beyin.

Mikrovasküler EC türetilmiş bu yana sıkı kavşak proteinler kılcal hızlı, gen ekspresyonu Cld5, Ocln ve Tjp1 kas hücreleri ayrıştırılan karşılaştırıldığında birincil fare MMEC içinde incelenmiş. Beklendiği gibi tüm sıkı kavşak molekülleri birincil fare MMEC tespit edildi. Herhangi bir ifade Cld5 ve Ocln tespit edilemedi, ancak buna karşılık, Tjp1, düşük ifade sadece kas hücreleri gösterdi. Benzer ifade desenleri daha önce bütün fare iskelet kas gösterdi. Burada, gen ve protein düzeyi üzerinde bir ifade Tjp1 için ama 9occludin değil için tespit edilemedi. Daha fazla transendothelial direnç gibi işlevsel özellikleri ölçülen.

Burada açıklanan protokol yalnızca fare kas dokusundan mikrovasküler EC izolasyonu bulunuyor. Ancak, bu örnek benzer bir protokol mikrovasküler EC epididimal yağ yastıkları türetilmiş fare için yayımlanan çeşitli diğer türler için transfer. Burada, CD31 pozitif seçim yoluyla MCS yoğunluk gradient Santrifüjü 10tarafından geliyordu. Benzer yaklaşımlar tekrarlamışlar EC izole sıçan femoral arterler 11başarılıydı. Kalp ve akciğer dokusunun mikrovasküler EC yalıtmak için kısa bir süre önce bir yöntem CD31 ve endoglin (CD105) antijenleri 12sıralama manyetik hücre için kullanır. Ancak, EC saflığı daha fazla ek CD105 manyetik boncuk ayrılık kullanarak artış değil. Yalıtmak ve birincil fare MMEC arındırmak için başka bir olasılık (FACS) sıralama çok renkli floresan aktif hücre olabilir. Ani kalp durması-1+, CD31 ayrı bir nüfusa+, CD34dim ve CD45 fare kas hücrelerinden- izole olabilir ve birincil fare MMEC 13karakterize edildi. Bu yöntemin bir avantajı doğrudan kullanılan veya daha fazla deneyler (bizim deneyim FACS götürmek-e doğru içinde hücre ölümü daha yüksek hücre stres nedeniyle artan unutmayın) için kültürlü bir saf EC nüfusu var. Ayrıca, ölü hücreleri veya farklı hücre tipleri nin ikinci büyük şirketler tarafından FACS izole hücre sayıları önemli ölçüde azaltabilir. Ayrıca, birincil fare MMEC FACS tarafından izole başarısız kültürlü olduğunu O %212 ve % 5 CO2sık kullanılan kültür koşulları bildirilmektedir. Burada, oksijen seviyesi için yeterli bir yetiştirme %135'i ayarlanması gerekiyordu. Ayrıca, FACS tekniktir daha karmaşık ve zaman alıcı ve altyapı önkoşulları pahalıdır.

Onlar kolayca erişilebilir ve yalıtım yeterli hücre sayı kadar büyük olarak musculus kuadriseps kemiği ve musculus triceps surae 4-12 hafta çağındaki erkek farelerin en birincil fare MEC yalıtım için uygundur (5-10 x 10-5 gram kas). Bu nedenle, koşulları bağımsız deneylerde karşılaştırılabilir sağlanması gerekir. Yukarıda açıklandığı gibi Primer hücre yaşlanma uygulayabilir. Bu yüzden, hücre alt geçit olarak derhal ilgili deneyler için kullanın. Geçiş sonra 8 – 10 birincil fare MMEC onların morfolojisi değiştirmek, yavaş yayılması oranları göstermek ve onların temas inhibisyonu için dedifferentiation ve yaşlanma belirtileri olarak kaybetmek.

Ayrıca bu iletişim kuralı için sorun giderme için bazı notlar vardır. Steril çalışma contaminations önlemek için önemlidir. Kalite kontrol monitör saflık ve canlılığı izole hücre için gereklidir. Bu protokolünde kullanılan malzemeler depolanan ve üretici yönergelerine göre uygulanır. Ek, yaş ve cinsiyet kullanılan hayvanların yanı sıra farklı kas grupları kalite ve karşılaştırılabilir deneylerde izole hücre etkisi.

Açıklanan Protokolü birincil mikrovasküler EC iskelet kaslarının yalıtmak için platform yöntemi olarak düşünülmelidir. İzole hücreler daha fazla kan-kas-bariyer fonksiyonu anlayışlar kazanmak için çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Hem protein ve RNA ifade çalışmaları yanı sıra işlevsel deneyleri (hicret ve yapışma çalışmaları da dahil olmak üzere) uygun hücrelerdir. Ancak, bu protokol inflamatuar süreçleri üzerinde odaklanan çalışmaları için optimize edildi ve bu nedenle hafif değişiklikler farklı araştırma konuları ile ilgili olarak gerekli olabilir.

MVU içinde karmaşık kayma ve fonksiyonel hücresel etkileşimlerin modeli için birincil fare MMEC ile birlikte diğer hücre tipleri daha karmaşık 3D hücre kültür sistemlerindeki ekili. Prospektif, Ayrıca bu diğer dokulara daha önce 14için açıklandığı gibi MVU organoids oluşturmak mümkün olacaktır. Ancak, birincil fare MMEC başarılı yalıtım bu sonraki adım matuf için kaçınılmazdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Acknowledgments

Bu eser "başka Kröner-Fresenius-Stiftung tarafından" desteklenmiştir (TR 2018_A03), "Yenilikçi Medizinische Forschung (IMF) Münster" (ı-RU211811 TR için) ve Alman Araştırma Vakfı (DFG, INST 2105/27-1, bana 3283/5-1 ve bana 3283/6-1'e SGM). Heike Blum tarafından sağlanan resimli görüntüler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Tags

Neuroscience sayı: 145 hücre izolasyon fare mikrovasküler endotel hücreleri iskelet kas hücreleri kan kas bariyer myovascular birimi myopathy
Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müntefering, T., Michels, A. P. … More

Müntefering, T., Michels, A. P. E., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter