Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique

Summary

Les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques (CEMG) forme la paroi des capillaires musculaires et réglementer les deux, échange de fluides/molécules et la migration des cellules (système immunitaires) entre le sang et les tissus musculaires. Isolement des primaire murine CEMG, comme décrit ici, permet des études in vitro complètes de l’unité « myovascular ».

Abstract

Les cellules endothéliales des capillaires du muscle squelettique (cellules endothéliales microvasculaires musculaires, CEMG) mettre en place la barrière entre la circulation sanguine et les muscles squelettiques régissant l’échange de fluides et de nutriments ainsi que la réponse immunitaire contre infectieuses agents en contrôlant la migration des cellules immunitaires. Pour ces fonctions, le CEMG forment une fonctionnelle « myovascular unit » (MVU), avec d’autres types de cellules, telles que les fibroblastes, les péricytes et les cellules musculaires squelettiques. Par conséquent, un dysfonctionnement du CEMG et, par conséquent, le MVU contribue à une grande variété de myopathies. Cependant, les mécanismes régulateurs du CEMG en santé et la maladie restent insuffisamment compris et leur élucidation précède des traitements plus spécifiques pour les myopathies. L’isolement et une enquête approfondie des principales fonctions de CEMG dans le contexte de la MVU pourraient permettre une meilleure compréhension de ces processus.

Cet article fournit un protocole visant à isoler les primaire CEMG murin du muscle squelettique par dissociation mécanique et enzymatique, y compris la purification et les mesures de maintien de la culture.

Introduction

Via la circulation sanguine, les cellules et les organes sont fournis avec l’oxygène, de substrats et d’autres molécules nécessaires. Cet échange se déroule dans les capillaires, les vaisseaux plus petits. Capillaires forment une couche intérieure de cellules endothéliales (EC) dont l’intégrité est une condition préalable au règlement réussi d’homéostasie musculaire entre l’espace intravasculaire et interstitiel. Afin d’assurer une transition sélective des cellules et des facteurs solubles, EC constituent une monocouche reliés entre eux par serrés et de jonctions adherens ¹. Outre son rôle de barrière pour les nutriments ou les produits métaboliques, EC régissent le recrutement des leucocytes dans le processus inflammatoire. Dommages d’inflammation ou d’un tissu conduit à une régulation des molécules d’adhérence sur la surface de l’EC et la production des chimiokines facilitant l’attachement de leucocytes et de la transmigration dans les tissus de cible ². Par conséquent, EC sont gravement impliqués dans la régulation des processus inflammatoires telles que la défense contre les agents pathogènes ou de la réparation des tissus.

Un dysfonctionnement de l’EC est directement associée à des maladies vasculaires, insuffisance rénale chronique, les infections graves pathogène thrombose veineuse. En outre, EC sont pratiquement toujours impliqués dans certains organes auto-immunité telles que diabète ou une sclérose en plaques ³. La fonction de barrière entre la circulation sanguine et les organes est donc contrôlée par une interaction concertée des différents types de cellules. Dans les muscle squelettique cellules endothéliales microvasculaires (CEMG) ainsi que de cellules musculaires, fibroblastes et péricytes forment une unité fonctionnelle, l’unité « myovascular » (MVU). Par conséquent, un dysfonctionnement de la MVU pourrait jouer un rôle essentiel dans la physiopathologie des myopathies. Toutefois, une meilleure compréhension de ces mécanismes de régulation est toujours porté disparue et s’oppose actuellement à l’identification d’objectifs nouveaux, urgentes, thérapeutiques dans les myopathies.

Afin d’étudier les mécanismes physiologiques et physiopathologiques complexes, des modèles animaux sont couramment utilisés. Cependant, en vitro modèles offrent l’avantage de se concentrer sur le sujet d’intérêt en excluant une variété de facteurs de confusion. Pour étudier les processus in vitro, il est nécessaire d’isoler les cellules primaires pures et viables. Contrairement aux lignées cellulaires, piles isolées d’animaux transgéniques permettent d’enquêter sur les conséquences des modifications génétiques in vitro.

Ici, une méthode pour isoler le CEMG murine primaire est décrite à l’aide de dissociation mécanique et enzymatique suivie magnétique cellulaire activé techniques (MCS) pour la purification de tri. À cette fin, des billes magnétiques contre des marqueurs de surface spécifiques sont utilisés. Plaquettes cellules endothéliales molécule d’adhésion-1 (PECAM1, CD31) est principalement exprimée sur le EC et peut être utilisé pour enrichir ce type de cellule. Pour justifier une pureté élevée de cellules, les cellules d’origine hématopoïétique sont exclues par une sélection négative pour la protéine tyrosine phosphatase du récepteur de type C (PTPRC, CD45). En outre, les contrôles de qualité, culture du primaire CEMG murine, applications potentielles et limitations ainsi que des considérations particulières sont présentés.

Protocol

Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par les autorités locales et menées conformément à la loi allemande de protection animale (84-02.05.20.13.097).

1. Généralités sur l’expérimentation animale

1. Effectuer toutes les expériences de souris conformément aux directives de la protection des animaux institutionnelle respectif et utiliser le comité.
2. Gardez la souris dans des conditions normalisées et conformément aux directives internationales telles que la Fédération pour Laboratory Animal Science Associations (FELASA).
   Remarque : En général cette technique d’isolation peut servir pour les souris indépendamment de l’âge, le sexe ou bagage génétique. Pour obtenir un nombre suffisant de cellules, semaine 4 – 10 vieux mâles sont préférés, propriétés biologiques pouvant varier avec l’âge et le sexe.

2. préparation des Solutions, des médias et revêtement

1. Préparer la solution de digestion (DS) en mélangeant 2,2 mL de Dulbecco´s Eagle modifié (DMEM) avec 200 μL collagènase-a et 45 μL Désoxyribonucléase (DNase).
2. Préparer 500 mL de milieu (ECM) de la cellule endothéliale en mélangeant 450 mL de DMEM avec 50 mL de FCS (environ 10 %), 0,25 mL bFGF de facteur de croissance basique des fibroblastes (20 μg/mL ; environ 0,05 %) et 5 mL de pénicilline-streptomycine (environ 1 %). Effectuer la filtration stérile dans un tube de verre (diamètre des pores du filtre : 0,2 μm). Par la suite conserver la solution à 4 ° C.
3. Enduire les plaques de culture cellulaire tel que décrit ci-dessous.
   1. Pour la culture de fraîchement isolée Carter primaire de MEC murine toute la surface avec 1 mL par puits d’un 6 bien plaque de culture cellulaire avec une solution d’enrobage gélatine base vitesse (voir Table des matières) conformément aux instructions du fabricant pour 3 à 5 min à chambre température (RT).
   2. Aspirer et jetez la solution de revêtement. Rincer chaque puits avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile 2 mL (PBS), pH 7.1 – 7,5 en deux étapes de lavage consécutives.
   3. Aspirer et jeter les PBS. Remplir les puits avec volume de 1 mL d’ECM.

3. isolement de cellules endothéliales microvasculaires de Muscle Murine primaire (CEMG)

1. Euthanasier un adulte de 4 à 12 semaines homme souris par dislocation cervicale sans aucune anesthésie. L’objectif consiste à séparer rapidement de la moelle épinière du cerveau afin de fournir à l’animal une mort rapide et indolore.
2. Couper les extrémités.
   1. Utiliser une chirurgie pointue/arrondie (pointe de 42 mm, droite) et sharp sharp/ciseaux (pointe de 23 mm, droite), une quinte (dentelé, 2 x 1,25 mm x 12 cm) et une courbe (dentelé, 1,3 mm x 1 mm x 13 cm) pinces.
   2. Désinfecter tous les instruments chirurgicaux avec l’éthanol à 70 %.
   3. Placez l’animal sur son dos, mouiller les pieds avec l’éthanol à 70 %. Couper la jambe toute en coupant à l’articulation de la hanche avec le ciseaux chirurgicaux pointue/arrondie. Placer les extrémités dans une boîte de Petri de cellules fermées (35 x 10 mm).
      Remarque : Par la suite effectuer chaque étape sous une hotte à flux laminaire stérile et travailler avec des instruments stérilisés.
3. Isoler le tissu musculaire (préférentiellement utiliser le musculus quadriceps fémoral ou musculus triceps suraux de deux jambes).
   1. Couper la peau ouverte de la hanche à la pointe du pied en utilisant un ciseau pointue/pointue et pince courbée. Maintenir l’orteil ou du coussinet plantaire avec la pince droite. Décollez la peau avec la pince courbée de l’orteil à la hanche.
   2. Isoler le musculus quadriceps fémoral en coupant le tendon du genou et de rompre le muscle le long du fémur à la hanche. Isoler le musculus triceps suraux en sectionnant le tendon d’Achille. Ci-après, couper le long du tibia au creux poplité et retirer le muscle.
      Remarque : Si gros vaisseaux (femoralis a., a. jambier antérieur, a. muscle tibial postérieur, a. fibulaire) est visibles dans les muscles isolés, supprimer des navires pour éviter la contamination par l’endothélium macrovasculaires.
   3. Pour enlever les gros vaisseaux, tenez la partie du muscle ne contenant ne pas de gros navires avec une pince courbée et la couper à côté du navire. Pour ce protocole, 1 g ou moins égale aux quadriceps fémoral et triceps suraux le tissu musculaire est recommandé.
   4. Ajouter 2 445 µL DS (à l’étape 2.1) dans une boîte de Petri de cellule (35 x 10 mm) et de déterminer le poids.
   5. Transférer tous les morceaux de muscle à ce plat de culture cellulaire contenant le µL 2445 DS et déterminer le poids. La différence de ces deux valeurs mesurées fournit la masse sèche du tissu musculaire qui ne doit pas dépasser 1 g.
   6. Couper le tissu musculaire tout en petits morceaux (cubes de ≤2 mm, environ 100 pièces) en utilisant le ciseaux pointue/pointue.
4. Dissocier les tissus musculaires.
   Remarque : cette étape prend environ 120 min.
   1. Suspension de muscle/DS magasin à 37 ° C (incubateur avec 5 % de CO₂) pendant 1,5 h. mélanger la suspension soigneusement toutes les 20 min pendant environ 5 min à l’aide d’une seringue d’insuline de 1 mL.
   2. Transférer la suspension à un 70 μm en nylon cellule crépine placée sur un tube de 50 mL et recueillir le débit à travers. Lavez le tamis cellulaire avec 8 mL de DMEM et recueillir le débit à travers.
   3. Jeter la suspension cellulaire de crépine et centrifuger pendant 10 min à 300 x g à 20 ° C. Retirer délicatement le surnageant.
      Attention : pellet est facile à perdre.
   4. Resuspendre le culot dans 1 mL d’un tampon de lyse de chlorure d’Ammonium-Potassium (ACK) (voir ci-joint la Table des matières) pour provoquer la lyse des globules rouges et incuber pendant 30 s à RT. ajouter 9 mL DMEM + 10 % FCS de cesser la suspension de cellules de réaction et le transfert à un t 15 mL ube.
5. Appauvrissent CD45⁺ cellules suivant les instructions du fabricant CD45 microbilles. Pour toutes les étapes suivantes du CD45⁺ épuisement utiliser tampon MCS (voir ci-joint la Table des matières).
   Remarque : cette étape prend environ 60 min.
   1. Déterminer le nombre de cellules en utilisant une cellule Neubauer chambre de comptage (attendre environ 5 x 10⁶ cellules / g de tissu musculaire).
   2. Suspension de centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Ôtez complètement surnageant et resuspendre le culot dans 90 µL de tampon de MCS (10 cellules de⁷ ou moins). Ajouter 10 μL de microbilles de CD45 (10 cellules de⁷ ou moins).
   3. Mélanger la suspension cellulaire et incuber pendant 15 min au réfrigérateur à 4 – 8 ° C.
   4. Ajouter 1mL de tampon MCS (10 cellules de⁷ ou moins). Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Retirez le surnageant complètement et remettre en suspension des cellules dans le tampon MCS 500 μL.
   5. Pour la séparation des cellules magnétiques utilisent une longue colonne magnétique (LMC) avec un volume de réservoir de 8 mL et une capacité de jusqu'à 2 x 10⁹ cellules total. Positionner le CAT dans le champ magnétique du séparateur.
   6. Rincer avec 3 mL de tampon MCS dans le réservoir de la LMC. Après le rinçage, placer un tube conique de 15 mL sous la colonne pour recueillir l’écoulement à travers. Appliquer la suspension de germes entiers (500 µL) sur la colonne et laisser complètement couler à travers.
   7. Laver la colonne trois fois en ajoutant 3 mL de tampon MCS dans le réservoir et attendez que le réservoir de column´s est vide avant d’effectuer la prochaine étape de lavage.
   8. Recueillir les cellules non marquées en passant la colonne utilisent pour les autres étapes de séparation (représentant le CD45 fraction^– ). Marqués de cellules (représentant le CD45⁺ fraction) accumulée dans la colonne peut être mis au rebut.
6. S’accumulent CD31⁺ cellules suivant CD31 microbilles du fabricant. Pour toutes les étapes suivantes du CD31⁺ accumulation utiliser le tampon MCS.
   Remarque : cette étape prend environ 60 min.
   1. Déterminer le nombre de cellules en utilisant une cellule Neubauer chambre de comptage (attendre environ 4 x 10⁶ cellules / g de tissu musculaire).
   2. Centrifugeuse a obtenu suspension cellulaire sans étiquette de l’étape 3.5 pendant 10 min à 300 x g à 4 ° C.
   3. Retirez complètement le surnageant. Resuspendre le culot dans un tampon MCS 90 μL et ajouter 10 μL de microbilles CD31 (10 cellules total de⁷ ou moins). Mélanger l’ensemble suspension et incuber pendant 15 minutes au réfrigérateur à 4 – 8 ° C.
   4. Ajouter 1mL de tampon de MCS et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Décoller le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 500 µL de tampon MCS.
   5. Pour la séparation de la cellule magnétique utiliser une colonne magnétique moyenne (MMC) avec un volume de réservoir de 3,5 mL et une capacité de jusqu'à 2 x 10⁸ cellules total.
   6. Placez la console MMC dans le champ magnétique du séparateur. Rincer la console MMC avec 500 µL de tampon MCS. Après le rinçage, placer un tube conique de 15 mL sous la colonne pour recueillir l’écoulement à travers.
   7. Appliquer la suspension de germes entiers (500 µL) sur la colonne et laisser complètement couler à travers.
   8. Laver la colonne trois fois en ajoutant 500 µL de tampon MCS et attendez que le réservoir de la colonne est vide avant d’effectuer la prochaine étape de lavage. Les cellules non étiquetées en passant de la colonne représentent le CD45^– CD31 fraction^– . Les stocker pour les contrôles de la qualité.
   9. Retirer la colonne du séparateur et placez-le sur un tube de prélèvement adapté (tube de 15 mL). Pipette 2 mL MCS de tampon sur la colonne. Rincer immédiatement les cellules magnétiquement étiquetées en appuyant fermement sur le piston dans la colonne. Cette CD45^– CD31⁺ fraction représente l’EC de murin primaire enrichi.
   10. Suspension cellulaire centrifuger pendant 5 min à 350 x g à 20 ° C. Supprimer complètement les surnageant et remettre en suspension les cellules (prévoir environ 0,6 x 10⁶ cellules / g de tissu musculaire) dans 1 mL ECM (voir l’étape 2.2). Transfert (0,5 à 0,7 x 10⁶ cellules) à un seul puits d’une plaque de revêtement 6 puits culture (de l’étape 2.3) contenant 1 mL de ECM.
7. Pour la culture, incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur stérile. Actualiser l’ECM chaque deux ou trois jours.

4. primaire CEMG Murine Purification

1. Effectuer un deuxième cycle de CD31⁺ accumulation, suivant les instructions du fabricant (CD31 microbilles protocole de la souris, reportez-vous à l’étape 3.6.).
   1. Détacher les cellules avec une solution de trypsine/EDTA lorsqu’ils sont au confluent de 80 à 90 % (en général après 7 jours). Pour ce faire, rincer chaque puits avec 2 mL de PBS stérile, en deux étapes de lavage consécutives. Utiliser la solution de trypsine/EDTA 800 μL par puits 6 et incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur stérile pendant 3 à 5 min. arrêt de l’activité enzymatique à l’aide de 1200 μL DMEM contenant au moins 10 % FCS.
   2. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 350 x g à 20 ° C.
   3. Effectuer la deuxième étape CD31-MCS pour augmenter la pureté (selon les instructions de manufacturer´s de microbilles CD31 ; voir 3.6.).
   4. Observer la cellule confluence via lumineux champ ou à l’aide de la microscopie à contraste de phase standard un
      20 x grossissement et ouverture numérique de l’objectif de 0,35. Voir la Figure 1.
      Remarque : Les cellules peuvent être utilisés pour des expériences respectives ou maintenues en culture par passage. Utiliser des cellules pour les expériences sans tarder dans les passages inférieurs. Il n’est pas recommandé d’utiliser des cellules après passage
      8 – 10.

5. contrôle de la qualité

1. Effectuer cytométrie du CEMG murine primaire après la deuxième CD31-MCS-étape.
   1. Préparer un tube de FACS en ajoutant 1 mL de tampon de cytométrie en flux (FC) débit (voir ci-joint la Table des matières).
   2. Détacher les cellules avec une solution de trypsine/EDTA lorsqu’ils sont à 100 % confluence (habituellement après 14 jours). Pour ce faire, rincer chaque puits avec 2 mL de PBS stérile, en deux étapes de lavage consécutives. Utiliser la solution de trypsine/EDTA 800 μL par puits 6 et incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur stérile pendant 3 à 5 min. arrêt de l’activité enzymatique à l’aide de 1200 μL DMEM contenant 10 % FCS.
   3. Déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un Neubauer comptage cellules de chambre et ajouter un minimum de 1 x 10⁵ cellules dans le tube de FACS préparé.
   4. Suspension de cellules de centrifugation pendant 10 min à 300 x g à 4 ° C. Effectuer les deux étapes de lavage en enlevant le surnageant, resuspendant des cellules dans le tampon de 1 mL FC et centrifugation pendant 10 min à 300 x g à 4 ° C.
   5. Préparer un mélange de coloration en ajoutant anti-souris anticorps CD31-FITC (1/100) et anti-souris CD45-PE (1/100) avec un tampon FC.
   6. Remettre en suspension les cellules de 100 μL de mélange dans les tubes de FACS de coloration. Incuber 30 min à 4 ° C. Ajouter 1 mL de tampon FC. Suspension cellulaire centrifuger pendant 5 min à 300 x g à 4 ° C. Soigneusement, éliminer le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 200 μl de tampon FC.
   7. Cellules de mesure dans un cytomètre en flux conformément à la stratégie de blocage est indiqué sur la Figure. 2 A.
2. Vous pouvez également exécuter immunofluorescence coloration du CEMG murine primaire après la deuxième CD31-MCS-étape.
   1. Enrober les lamelles couvre-objet.
      1. Transférer un stérile de 13 mm de diamètre autour de lamelle de verre dans un puits d’une plaque 24 puits. Manteau lamelle couvre-objet en ajoutant 300 µL de solution de revêtement vitesse / puits. Incuber pendant 3 à 5 min à température ambiante (RT).
      2. Aspirer et jetez la solution de revêtement. Rincer chaque puits avec 2 mL de PBS stérile en deux étapes de lavage consécutives. Aspirer et jeter les PBS.
      3. Semences 1 x 10⁵ cellules dans 1 mL ECM sur la lamelle couvre-objet couché et incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur stérile jusqu'à ce que les cellules sont 99 % anastomosé.
   2. Effectuer la fixation et coloration par immunofluorescence.
      1. Retirez le support de l’ECM des cellules cultivées de 5.2.1.3.
      2. Difficulté des cellules cultivées en ajoutant paraformaldéhyde à 4 % 300 µL (PFA) avec un pH de 7.4 / puits, pendant 10 min à 4° C.
         Mise en garde : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin.
      3. Effectuer les 3 étapes de lavage en ajoutant 1 mL de PBS / puits et éliminer le surnageant après 5 min à température ambiante.
      4. Préparer un blocage solution contenant 5 % de BSA, 0,2 % sérum de chèvre Triton-X et 1 % dans du PBS.
      5. Ajouter 300 µL de solution de blocage à chaque puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
      6. Retirez le surnageant et ajouter 200 µL / puits d’anticorps anti-PECAM-1 (CD31) (1 : 200) à 5 % de BSA, 1 % de sérum de chèvre dans du PBS et incuber une nuit à 4 ° C.
      7. Effectuer 3 lavage des étapes en ajoutant 1 mL de PBS / puits et supprimant surnageant après 5 min à ta à chaque étape.
      8. Préparer une solution d’anticorps secondaire contenant des anticorps d’IgG de anti-rat Cy3-conjugués (1/500) dans 1 % de BSA et PBS. Ajouter 300 µL / puits de la solution d’anticorps secondaire et incuber pendant 1 heure à ta dans l’obscurité.
      9. Effectuer 3 lavage des étapes en ajoutant 1 mL de PBS / puits et supprimant surnageant après 5 min à ta à chaque étape.
   3. Retirez le couvre-objet en verre ronde soigneusement avec une pince et transférez-la sur une lame de microscope. Ajouter une quantité appropriée de montage moyen DAPI contenant sur la couche de cellules et rangez soigneusement une lamelle couvre-objet sur elle (voir ci-joint Table des matières).
   4. Observer des cellules avec un microscope à fluorescence approprié équipé d’une source de lumière de fluorescence (120 W) et deux ensembles de filtre : un filtre d’excitation/émission sertie de 550/25 nm et longueurs d’onde de 605/70 nm pour détecter Cy3 540/562 nm.
   5. Utilisez un deuxième filtre défini avec une longueur d’onde d’excitation/émission de 365/50 nm et 445/50 nm pour détecter le DAPI 350/440 nm. Utiliser un grossissement de x 40 et 80 % d’intensité de 14,5 mW/cm² pour DAPI avec une durée d’acquisition de 30 m pour la détection de Cy3 utiliser 80 % 67,5 mW/cm² d’une durée d’acquisition de 60 ms.
3. Effectuer la PCR quantitative.
   1. Isolement d’ADN messagère.
      1. Suivez les procédures standards utilisant un réactif de thiocyanate-phénol (AGTP) de guanidinium acide pour isoler des ARNm. Utiliser un minimum de 0,5 x 10⁶ cellules de CD45^– CD31^– (voir l’étape 3.6.8), CD45^– CD31⁺ (voir l’étape 3.6.9) fractions et cultivé primaire murine CEMG (4.1.3)
      2. Suspension de cellules de centrifugation pendant 10 min à 300 x g à 20 ° C. Enlever complètement le surnageant. Resuspendre le culot dans 500 µL de la suspension AGTP réactif et le transfert de cellules dans un tube à essais 2 mL. Incuber 5 min à température ambiante.
      3. Ajouter 100 µL de chloroforme et agiter vigoureusement pendant 15 s. incuber pendant 3 min à température ambiante.
      4. Suspension de centrifuger pendant 15 min à 12 000 x g à 4 ° C.
      5. Décoller la supérieure phase aqueuse (contenant l’ARN) soigneusement et transvaser dans un tube de réaction de 1,5 mL. Ajouter 250 µL d’isopropanol et incuber pendant 10 min à température ambiante.
      6. Exécuter une étape de centrifugation à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
      7. Décoller le surnageant et ajouter 1 mL d’éthanol 75 % avec soin. Centrifuger à 7 500 x g pendant 5 min à 4 ° C.
         Remarque : Pellet est facile à perdre.
      8. Retirez complètement le surnageant. Sécher le culot sur l’air pendant 5 à 10 min.
         Remarque : l’éthanol doit être enlevée mais ne sèche pas trop.
      9. Dissoudre les granulés dans 30 µL d’eau contenant le diéthylpyrocarbonate traité dans et chauffer pendant 10 min à 55 ° C.
         Remarque : Pureté et la concentration d’ARN peuvent être mesurées par un photomètre-spectrale.
   2. Effectuer la synthèse de cDNA (reverse transcriptase PCR).
      1. Préparer un mastermix contenant : 10 µL de tampon de PCR (x 5), 2,5 µL desoxyribonucleosid-triphosphate (dNTP (10 mM)), mélange aléatoire de 0,5 µL d’apprêt monocaténaire (0,2 µg / µL), 1 µL d’inhibiteur de RNase (40 U / µL, 0,4 reverse transcriptase (200 U/µL) et 5,6 µL de diethylpyrocarbonat de l’eau traitée (voir ci-joint Table des matières).
      2. Diluer 500 ng RNA dans 30 µL diéthylpyrocarbonate traité eau dans 0,2 mL PCR tubes et ajoutez l’ensemble mastermix 20 µL.
      3. Utiliser un cycler PCR effectuant suivant étapes : 10 min 25 ° C, 30 min 50 ° C, 5 min 85 ° C et maintenez à 4 ° C.
4. Effectuer la PCR Quantitative (qPCR).
   Remarque : Effectuer qPCR d’échantillons en doublons ou réanalysés.
5. Utiliser l’apprêt avec deux fluorescence différents colorants. Apprêt avec une absorption de 495 nm et une émission de 517 nm pour le gène d’intérêt.
6. Pour la détection de l’expression de gène de marqueur de cellules satellites, utiliser des amorces pour les protéines appariées boîte 7 (Pax7) et M-cadhérine (Cdh15) (voir ci-joint la Table des matières).
7. Pour la détection de l’expression du gène marqueur endothélial, utiliser des amorces pour claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) et zonula occludens-1 (Tjp1 ou ZO1) (voir les Table des matières).
8. Comme gène de référence pour 18 s ARNr, utiliser un apprêt avec absorption de 538 nm et une émission de longueur d’onde de 554 nm.
9. Préparer un mastermix qPCR pour chaque gène d’intérêt avec l’amorce respectif. Mastermix contient : 10µl qPCR tampon (x 2), 1 µL d’apprêt pour le gène d’intérêt (10 µM), 1 µL d’apprêt pour 18 s rRNA et 4 µL de nucléase eau libre.
10. Ajouter 16 µL de la mastermix dans un seul puits d’une plaque 96 puits de réaction. Ajouter 4 µL d’ADNc (obtenu à l’étape 5.3.2.) par cupule contenant la mastermix.
11. Utiliser un cycler PCR en temps réel, effectuer suivant étapes : tenue de scène avec 50 ° C pendant 2 min et 95 ° C pendant 10 mn stade de cyclisme avec 40 cycles de 95 ° C 15 s et 60 ° C pendant 1 min.

Representative Results

Un jour après l’isolement, primaire CEMG murin et résiduelle autres cellules forment des conglomérats et adhèrent au fond des récipients de culture (jour 1 dela Figure 1 a ). Du jour 7, cellules plates et allongées peuvent être observés. Toutefois, la contamination des autres, pour la plupart des cellules de sphéroïde, est encore visible (Figure 1 a jour 7). Ainsi, un nouveau cycle de CD31 positive sélection via MCS est nécessaire. Ci-après, primaire murine CEMG prolifèrent à une densité d’environ 80 à 90 %. À la confluence, ils forment généralement une monocouche de non-cumul des cellules longitudinalement alignées (Figure 1 a jour 14). La prolifération s’arrête à la confluence en raison de l’inhibition de contact. Après 14 jours environ 5-10 x 10 cellules de⁵ peut être utilisé en complément d’enquête.

Contrôle de qualité par cytométrie en utilisant viabilité fixable colorant FVD780 (pour colorer des cellules mortes), PECAM1 (CD31) et PTPRC (CD45, comme marqueur des cellules d’origine hématopoïétique) présentaient des valeurs pour la viabilité et la pureté allant d’environ 70 % pour les cellules immédiatement après l’isolement (Figure 2 a). Les cellules cultivées après un autre CD31 sélection positive via MCS, a montré satisfaisant les valeurs de pureté aussi bien en ce qui concerne la viabilité allant jusqu'à 95 % chacun (Figure 2 b).

Pour évaluer la précision de la sélection étapes, obtenus des cellules ont été davantage étudiés pour l’expression du gène de la protéine de boîte appariés gènes marqueur cellules satellites musculaires 7 (Pax7) et M-cadhérine (Cdh15) au niveau de l’ARNm par PCR quantitative (qPCR). CEMG murine primaire (pmMMEC) et des cellules musculaires murine primaires différenciée (pmMC) ont été utilisés comme contrôle positif et négatif, respectivement. Cellules musculaires murins ont été achetées dans le commerce. Comme prévu, seulement le CD45^– CD31^– fraction mais aussi de la pmMC exprimée Pax7 et Cdh15, alors que CD45^– CD31⁺ et le CEMG murine primaire étaient négatifs pour ces marqueurs (Figure 2).

CE provenant des capillaires dans l’endomysium de muscle squelettique jonction serrée express protéines ^4,5. À l’aide de qPCR, l’expression de claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) et zonula occludens-1 (Tjp1 ou ZO1) de confluente CEMG murine primaire après le MCS CD31 deuxième étape a été évaluée. PmMC ont été utilisés comme témoins (Figure 2D). CEMG murine primaire exprimée des niveaux élevés de Cld5, Ocln et Tjp1, alors que pmMC montrent seulement faible expression de Tjp1. En outre, immunofluorescence souillant comme contrôle de qualité confirmé expression à la surface de l’endothélium spécifiques PECAM1 marché en primaire CEMG murin (Figure 2E).

Figure 1 : morphologie des primaire murine CEMG. (A) image représentative de la culture primaire CEMG murin par microscopie à contraste de phase de jours 1 à 14. D1 = jour 1, d7 = jour 7, d14 = J14. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : contrôle de la qualité des primaire murine CEMG. Blocage de stratégie pour cytométrie de primaire CEMG murine immédiatement après l’isolement (A) et le 15e jour (B) (I) à l’aide de FSC/SSC, (II) FVD780 et (iii) CD45, CD31 (IIIb) (lignes de pointillés = contrôle d’isotype). (C) Expression niveau Pax7 et M-cadhérine (Cdh15) en CD45^– CD31^-, CD45^– CD31⁺ fractions après l’isolement des MCS ainsi que dans le primaire CEMG murin (pmMMEC) et les cellules musculaires murine primaires (pmMC ). Niveaux d’expression sont affichés sous forme de valeurs de_t ΔC (échantillon - ARNr 18 s), ND = non déterminé. (D) Expression niveau des protéines de jonction serrée claudin-5 (Cldn5), occludin (Ocln) ou zonula occludens-1 (Tjp1 ou ZO-1) de pmMMEC et de la pmMC, montré en tant que valeurs de_t ΔC. (E) par Immunofluorescence souillant pour PECAM1 en cultivés primaires murines CEMG 24h après la deuxième sélection positive CD31 (rouge). Nucléaire de coloration avec support de montage contenant du DAPI (bleu) ; gauche = anti-PECAM1/DAPI, droite : négatif contrôle/DAPI. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les cellules endothéliales microvasculaires fournissent des fonctions de barrière dans tous les tissus et leurs résultats de dysfonctionnement dans les maladies des organes connexes ³. En outre, des études spécifiques d’organes de EC microvasculaire pourraient ouvrir la voie pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par conséquent, une meilleure compréhension de la fonction d’EC microvasculaire dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est d’un grand intérêt scientifique. Modulation de l’interaction de leucocytes/endothélium est utilisée avec succès pour traiter les patients de la sclérose en plaques avec le natalizumab, un anticorps qui empêche l’adhérence des lymphocytes et, partant, de transmigration ⁶. Cependant, diverses myopathies, y compris les sous-types inflammatoires encore ne sont que peu traitables à ce jour. Par conséquent, élucidation des propriétés EC spécifiquement dans le muscle squelettique l’endothélium pourrait contribuer à étendre les traitements offerts à la myopathie ou provoquent de nouvelles approches thérapeutiques.

Des lignées de cellules endothéliales immortalisées (IECL) ont été mis en place et utilisées pour plusieurs modèles in vitro. Ces lignées cellulaires offrent certains avantages par rapport aux primaire microvasculaire EC en raison d’immortalisation et prolifération rapide. En outre, les cellules en culture primaires peuvent subissent une sénescence et perdre ou changer leur morphologie ou une fonction physiologique après quelques temps ou passages. Cependant, IECL seulement maintenir certaines propriétés des cellules endothéliales et ne peut pas ressembler à la variété de différentes transmises par les organes primaires microvasculaire EC. À noter, ils sont rarement issus des muscles squelettiques. A ce jour, seulement une seule publication décrit une ligne de cellules endothéliales microvasculaires squelettiques humaines nommée TSM15 ⁵. En revanche, murin microvasculaire EC n’ont pas été décrits jusqu'à présent. Enfin, les cellules primaires d’animaux transgéniques offrent la possibilité d’étudier les modifications génétiques in vitro. Cependant, les cultures de cellules primaires détiennent également certains pièges. Tout d’abord, contamination par des cellules sans intérêt peut interférer avec la validité des résultats expérimentaux. Par conséquent, la précision de plusieurs étapes de sélection et d’une grande pureté de cellules isolées doivent être garantis. Suspension cellulaire après dissociation du tissu musculaire contient des érythrocytes et types différents de cellules mononucléées telles que les cellules immunitaires, les cellules satellites, péricytes, fibroblastes et les cellules endothéliales ⁷. Par conséquent, fractions cellulaires après l’étape CD31 MCS ont été testées pour marqueurs exclusivement exprimés par les cellules satellites musculaires. Comme attendu CD45^– CD31^– fraction et cellules musculaires primaires ont montré l’expression Pax-7 et Cdh15 , tandis que CD45^– CD31⁺ et cultivée CEMG murine primaire étaient négatifs pour ces marqueurs après un deuxième CD31 Étape MCS. En outre, un contrôle de la qualité des cellules isolées ou de cultures est inévitablement pour garantir des expériences fiables et reproductibles. Il existe plusieurs méthodes pour le contrôle de la qualité du CEMG murine primaire : outre la microscopie des propriétés morphologiques, cytométrie en flux, salissures PCR et immunofluorescence pour marqueurs caractéristiques de EC (p. ex., CD31, Sca-1) peut être utilisé. Évaluation de la pureté du CEMG murine primaire fraîchement isolée était seulement environ 60-70 %, alors qu’une viabilité d’environ 70 % a pu être décelée. Microscopie de ces cellules montre partiellement des conglomérats de cellule, qui peuvent être constitué de cellules contaminantes telles que les fibroblastes ou péricytes annexées à ce. Après 7 jours, principalement les cellules plates et allongées et ellipsoïde peut être observée. Cependant, deux passages de MCS CD31 entraîné pureté et leur viabilité élevée. Les approches alternatives pour augmenter la pureté comme milieux contenant la puromycine a échoué en primaire CEMG murine tout en étant efficace dans murin du cerveau microvasculaire EC ⁸.

Puisque ce microvasculaire provenant des capillaires expriment des protéines des jonctions serrées, l’expression des gènes de Cld5, Ocln et Tjp1 en primaire CEMG murine comparativement à différenciés de cellules musculaires a été examinée. Comme prévu, toutes les molécules de jonction serrée ont été détectés chez primaire CEMG murine. En comparaison, cellules musculaires ont démontré que faible expression de Tjp1, alors qu’aucune expression de Cld5 et Ocln a ne pu être déterminée. Des modèles d’expressions similaires précédemment recueillies dans le muscle squelettique ensemble murin. Ici, une expression génique et protéique au niveau pourrait être détectée pour Tjp1 mais ne pas pour occludin ⁹. Outre les caractéristiques fonctionnelles telles que la résistance transendothéliale pouvaient être mesurés.

Le protocole décrit ci-après comporte seulement l’isolement de ce microvasculaire à partir du tissu musculaire murine. Toutefois, il pourrait être transféré à diverses autres espèces comme par exemple qu'un protocole similaire a été publié pour rat que ce microvasculaire provenant de coussinets adipeux épididymaires. Ici, CD31 sélection positive via MCS a été précédée par centrifugation en gradient de densité ¹⁰. Des approches similaires ont réussi à isoler EC macrovasculaires du rat artères fémorales ¹¹. Une méthode récemment publiée pour isoler EC microvasculaire du tissu cardiaque et pulmonaire utilise CD31 et endogline (CD105) comme antigènes pour cellule magnétique tri ¹². Cependant, la pureté de l’EC ne pourrait pas encore être augmentée supplémentaires par séparation magnétique perle CD105. Une autre possibilité d’isoler et de purifier le CEMG murine primaire est multicolor fluorescence activé cellule triant (FACS). Une population distincte de Sca-1⁺, CD31⁺, CD34 CD45 et^{tamiser –} cellules de muscles murines a pu être isolés et a été caractérisé comme primaires murines CEMG ¹³. Un avantage de cette méthode est une population pure d’EC qui peut être directement utilisée ou mis en culture pour d’autres expériences (à noter que, dans notre expérience FACS entraîne, a augmenté la mort cellulaire en raison de fortes contraintes de cellule). Cellules plus, morts ou conglomérats de différents types cellulaires peuvent réduire considérablement le nombre de cellules isolées de FACS. En outre, il est rapporté que primaire CEMG murine isolé par FACS ont été sans succès cultivés dans des conditions de culture communément utilisés de 21 % O₂ et de 5 % de CO₂. Ici, le niveau d’oxygène doit être ajusté à 5 % pour la culture suffisante ¹³. Par ailleurs, la technique de FACS est plus complexe, beaucoup de temps et les conditions infrastructurelles coûtent chers.

Le musculus quadriceps fémoral et le musculus triceps suraux des souris mâles, à l’âge de 4 à 12 semaines sont plus aptes au sectionnement de MEC murine primaire car ils sont facilement accessibles et assez grande pour isolation suffisante du nombre de cellules (5-10 x 10⁵ par gramme de muscle). Donc, il doit s’assurer que les conditions sont comparables à des expériences indépendantes. Comme décrit ci-dessus, les cellules primaires peuvent subir la sénescence. Par conséquent, utiliser des cellules pour des expériences respectives sans tarder dans les passages inférieurs. Après passage 8 – 10 primaires murines CEMG changer leur morphologie, montrent des taux de prolifération lente et perdent leur inhibition de contact comme des signes de dédifférenciation et sénescence.

Il y a encore quelques notes pour le dépannage de ce protocole. Travail stérile est essentielle pour éviter les contaminations. Contrôles de qualité sont nécessaires pour la pureté de moniteur et de la viabilité des cellules isolées. Les matériaux utilisés dans le présent protocole doivent être stockés et appliqués conformément aux instructions du fabricant. Supplémentaires, âge et sexe des animaux utilisés, ainsi que différents groupes musculaires susceptibles d’influencer la qualité et la comparabilité des cellules isolées dans les expériences.

Le protocole décrit doit être considéré comme méthode de plate-forme d’isoler primaire EC microvasculaire des muscles squelettiques. Les cellules isolées peuvent être utilisés pour plusieurs applications pour nous éclairer davantage en fonction de la barrière hémato-muscle. Cellules ne conviennent pas pour des protéines et des études d’expression RNA tant que les tests fonctionnels (y compris les études de transmigration et adhérence). Toutefois, ce protocole a été optimisé pour les études qui portent sur les processus inflammatoires et d'où les légères modifications pourraient être nécessaires en ce qui concerne les domaines de recherche différents.

Pour modéliser les interactions cellulaires complexes spatiales et fonctionnelles dans le MVU, CEMG murine primaire peut être cultivée dans des systèmes plus complexes de la culture de cellule 3D ainsi que d’autres types de cellules. Prospective, il devrait être également possible de générer organoïdes MVU tel qu’il a été décrit pour les autres tissus avant ¹⁴. Toutefois, réussite de l’isolement du CEMG murine primaire est inévitable pour viser à cette prochaine étape.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25200-056	ready to use
ACK buffer			150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)	Biolegend	102506	Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)	Biolegend	103106	Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A4503
CD31 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-097-418
CD45 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301
Collagenase-Dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates	Corning	3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody	dianova	712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)	Thermo Fisher	P36935
Desoxyribonuclease	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water	Thermo Fisher	AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate	Thermo Fisher	31966-021	warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM)	Thermo Fisher	R0192	1 mL
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
FACS tubes	Sarstedt	551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer	Corning	352350
FC buffer			0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780	Thermo Fisher	65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix)	Braun	9161708V
large magnetiv columns (LS columns)	Miltenyi Biotec	130-042-401	for CD45-MACS-step
MCS buffer			0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column)	Miltenyi Biotec	130-042-201	for CD31-MACS-step
Nuclease free water	Thermo Fisher	R0581
PBS	Sigma Aldrich		Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742	in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse	SantaCruz	Sc-52713	100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
primary murine muscle cells	celprogen	66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin)	Thermo Fisher	Mm00483191_m1	FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5)	Thermo Fisher	Mm00727012_s1	FAM labeled
Primer Ocln (occludin)	Thermo Fisher	Mm00500912_m1	FAM labeled
Primer Pax-7	Thermo Fisher	Mm01354484_m1	FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)	Thermo Fisher	Mm00493699_m1	FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)	Thermo Fisher	4310893E	VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)	Thermo Fisher	K0231	2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer	Thermo Fisher	SO142	Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL)	Thermo Fisher	EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp)	Fine Science Tools	14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)	Fine Science Tools	14001-13
Speed Coating solution	PeloBiotech	PB-LU-000-0002-00