Les cellules endothéliales microvasculaires des muscles squelettiques (CEMG) forme la paroi des capillaires musculaires et réglementer les deux, échange de fluides/molécules et la migration des cellules (système immunitaires) entre le sang et les tissus musculaires. Isolement des primaire murine CEMG, comme décrit ici, permet des études in vitro complètes de l’unité « myovascular ».
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Article de méthode
Isolement de cellules endothéliales microvasculaires primaires murines Muscle squelettique
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules endothéliales des capillaires du muscle squelettique (cellules endothéliales microvasculaires musculaires, CEMG) mettre en place la barrière entre la circulation sanguine et les muscles squelettiques régissant l’échange de fluides et de nutriments ainsi que la réponse immunitaire contre infectieuses agents en contrôlant la migration des cellules immunitaires. Pour ces fonctions, le CEMG forment une fonctionnelle « myovascular unit » (MVU), avec d’autres types de cellules, telles que les fibroblastes, les péricytes et les cellules musculaires squelettiques. Par conséquent, un dysfonctionnement du CEMG et, par conséquent, le MVU contribue à une grande variété de myopathies. Cependant, les mécanismes régulateurs du CEMG en santé et la maladie restent insuffisamment compris et leur élucidation précède des traitements plus spécifiques pour les myopathies. L’isolement et une enquête approfondie des principales fonctions de CEMG dans le contexte de la MVU pourraient permettre une meilleure compréhension de ces processus.
Cet article fournit un protocole visant à isoler les primaire CEMG murin du muscle squelettique par dissociation mécanique et enzymatique, y compris la purification et les mesures de maintien de la culture.
Introduction
Via la circulation sanguine, les cellules et les organes sont fournis avec l’oxygène, de substrats et d’autres molécules nécessaires. Cet échange se déroule dans les capillaires, les vaisseaux plus petits. Capillaires forment une couche intérieure de cellules endothéliales (EC) dont l’intégrité est une condition préalable au règlement réussi d’homéostasie musculaire entre l’espace intravasculaire et interstitiel. Afin d’assurer une transition sélective des cellules et des facteurs solubles, EC constituent une monocouche reliés entre eux par serrés et de jonctions adherens 1. Outre son rôle de barrière pour les nutriments ou les produit....
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Protocole
Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par les autorités locales et menées conformément à la loi allemande de protection animale (84-02.05.20.13.097).
1. Généralités sur l’expérimentation animale
- Effectuer toutes les expériences de souris conformément aux directives de la protection des animaux institutionnelle respectif et utiliser le comité.
- Gardez la souris dans des conditions normalisées et conformément aux directives internationales telles que la Fédération pour Laboratory Animal Science Associations (FELASA).
Remarque : En général cette technique d’isolation peut servir pour les....
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Résultats
Un jour après l’isolement, primaire CEMG murin et résiduelle autres cellules forment des conglomérats et adhèrent au fond des récipients de culture (jour 1 dela Figure 1 a ). Du jour 7, cellules plates et allongées peuvent être observés. Toutefois, la contamination des autres, pour la plupart des cellules de sphéroïde, est encore visible (Figure 1 a jour 7). Ainsi, un nouveau cycle de CD31 positive sélection via MCS est .......
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Discussion
Les cellules endothéliales microvasculaires fournissent des fonctions de barrière dans tous les tissus et leurs résultats de dysfonctionnement dans les maladies des organes connexes 3. En outre, des études spécifiques d’organes de EC microvasculaire pourraient ouvrir la voie pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par conséquent, une meilleure compréhension de la fonction d’EC microvasculaire dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est d’un grand intérêt scientifique. Modula.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la « Else Kröner-Fresenius-Stiftung » (2018_A03 tr), « Novateur Medizinische Forschung (FMI) Münster » (I-RU211811 à TR) et fondation de recherche allemande (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 et ME 3283/6-1 à SGM). Illustré d’images fournies par Heike Blum.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsine-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | prêt à l’emploi |
| Tampon | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA dans l’eau à un pH de 7,3 | ||
| Anti-souris CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Contrôle des isotypes : FITC Rat IgG2a, &kappa ; Isotype Ctrl |
| Anti-souris CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Contrôle des isotypes : PE Rat IgG2b, &kappa ; Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Facteur de croissance des fibroblastes de base |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 Souris MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 Souris MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagénase de V. alginolyticus, Dispase de B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjuguée anti-rat IgG | antibody dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (Réactif anti-décoloration ProLong Gold avec DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Désoxyribonucléase I du pancréas bovin |
| Eau traitée au diéthylpyrocarbonat | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, contenant un supplément de glutamine et du pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | se réchauffer jusqu’à 37 ° ; C avant utilisation |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Tubes FACS | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 &mu ; m Filtre cellulaire | Corning | 352350 | |
| Tampon | 0,1 % BSA, 0,2 % NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Sérum de veau fœtal | Sigma Aldrich | F6178 | Sérum de veau fœtal |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Pince (dentelée, droite, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Pince (dentelée, droite, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Seringue à insuline 100 Solo 1 mL (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| grandes colonnes magnétiques (colonnes LS) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | pour tampon |
| MCS | 0,5 % BSA, 2 mM EDTA dans PBS à un pH de 7,2 | ||
| Colonne magnétique moyenne (colonne MS) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pour CD31-MACS-step |
| Eau sans nucléases | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Saline tamponnée au phosphate, prête à l’emploi | |
| Tampon PCR (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | en kit avec la transcriptase inverse |
| Pecam1 rat &alpha ;-souris | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µ ; g/mL |
| Pénicilline-Streptomycine | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Cellules musculaires primaires murines | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadhérin)Thermo | Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labellisé |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labellisé |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | |
| Amorce Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | Amorce |
| Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM étiqueté |
| Primer 18s rRNA (contrôle endogène eucaryote) | Thermo Fisher | 4310893E | |
| Tampon qPCR marqué VIC (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL ; pour 200 réactions chacune |
| Mélange aléatoire d’amorce monocaténaire | Thermo Fisher | SO142 | Amorce hexamère aléatoire |
| Transcriptase inverse (200 U/&mu ; L) + tampon PCR (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Inhibiteur de la RNASE (40 U/&mu ; L) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Ciseaux (tranchant 23 mm, tranchant/tranchant) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Ciseaux (tranchant 42 mm, tranchant/émoussé) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
Références
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720(2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S.
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