Summary
骨骼肌微血管内皮细胞 (mmec) 塑造了肌肉毛细血管的内壁, 并调节两者, 流体分子的交换和 (免疫) 细胞在肌肉组织和血液之间的迁移。分离原生小鼠 mmeec, 如下所述, 使 "我的血管单位" 能够进行全面的体外调查。
Abstract
骨骼肌毛细血管内皮细胞 (肌肉微血管内皮细胞, mmec) 在调节液体和营养物质的交流以及对感染的免疫反应之间建立了障碍通过控制免疫细胞迁移的代理。对于这些功能, mmec 形成一个功能性的 "肌血管单位" (mvu), 具有更多的细胞类型, 如成纤维细胞、周细胞和骨骼肌细胞。因此, mmec 的功能障碍, 因此 mvu 有助于各种各样的肌病。然而, mmec 在健康和疾病方面的监管机制仍然没有得到充分的了解, 它们的阐明先于治疗肌病的更具体的方法。在 mvu 的背景下对主要 mmec 功能进行隔离和深入调查, 可能有助于更好地了解这些过程。
本文提供了一种通过机械和酶解分离分离骨骼肌原生小鼠 mmec 的方案, 包括纯化和培养维持步骤。
Introduction
通过血液, 细胞和器官提供氧气、底物和其他必要的分子。这种交换发生在毛细血管中, 是最小的船只。毛细血管是由内皮细胞 (ec) 内层形成的, 其完整性仍然是成功调节血管内和间质间隙之间肌肉稳态的先决条件。为了确保可溶性因子和细胞的选择性过渡, ec 构成了一个单层连接的紧密和粘附连接 1. 除了作为营养或代谢产物的屏障的作用外, ec 还调节炎症过程中白细胞的吸收。炎症或组织损伤导致 ec 表面粘附分子的上调, 并产生促进白细胞附着和转移到目标组织2的趋化因子.因此, ec 严格参与炎症过程的调节, 如防御病原体或组织修复。
ec 功能障碍与血管疾病、慢性肾功能衰竭、静脉血栓形成严重的病原体感染直接相关。此外, ec 几乎总是参与器官特异性自身免疫, 如糖尿病或多发性硬化症3。因此, 血液和器官之间的屏障功能是由不同细胞类型的协同相互作用控制的。在骨骼肌微血管内皮细胞 (mmec) 与肌肉细胞、成纤维细胞和周细胞形成一个功能单元, 即 "myovascular 单位" (mvu)。因此, mvu 功能障碍可能在肌病的病理生理学中起着至关重要的作用。然而, 对这些监管机制的更深入了解仍然缺失, 目前无法确定肌病中新的、急需的治疗目标。
为了研究复杂的生理和病理生理机制, 动物模型是常用的。然而,体外模型通过排除各种混淆因素, 提供了关注感兴趣的主题的优势。为了研究体外过程, 有必要分离出纯和有活力的原代细胞。与细胞系不同的是, 从转基因动物身上分离出的原代细胞能够研究体外基因修饰的后果。
本文介绍了一种利用机械和酶解分离的方法, 然后采用磁性活化细胞分选技术 (mcs) 进行纯化。为此, 使用了针对特定表面标记的磁珠。血小板内皮细胞粘附分子-1 (pecam1, cd31) 主要在 ec 上表达, 可用于丰富这种细胞类型。为了保证高细胞纯度, 对蛋白酪氨酸磷酸酶受体 c 型 (ptprc, cd45) 的否定选择排除了造血源细胞。此外, 还介绍了质量控制、原生小鼠 mmec 的培养、潜在的应用和局限性以及特殊注意事项。
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Protocol
所有动物实验都得到了地方当局的批准, 并根据德国《动物福利法》 (84-02.05.20.13.097) 进行。
1. 动物实验的一般意见
- 按照各自机构动物护理和使用委员会的指导方针进行所有老鼠实验。
- 根据实验动物科学协会联合会 (felasa) 等国际准则, 使小鼠处于标准化状态。
请注意:一般来说, 这种隔离技术可用于不受年龄、性别或遗传背景影响的小鼠。为了获得足够的细胞数量, 最好是4-10周大的男性, 因为生物特性可能因年龄和性别而异。
2. 溶液、介质和涂层的制备
- 将2.2 毫升的 dulbecco 型改性鹰介质 (dmem) 与200μl 胶原酶和45μl 脱氧核糖核酸酶 (dnase) 混合制备消化液 (ds)。
- 将450毫升的 dmem 与 50 ml fcs (约 10%)、0.25 ml 基本成纤维细胞生长因子 bfgf (20μgml; 约 0.05%) 混合制备500毫升的内皮细胞培养基 (ecm)。和5毫升青霉素链霉素 (约 1%)。在玻璃管中进行无菌过滤 (过滤孔直径: 0.2μm)。然后将溶液存放在4°c。
-
外套细胞培养板, 如下所述。
- 根据制造商关于在房间内3-5分钟的说明, 用6孔细胞培养板的6井培养板的每井1毫升种植新鲜分离的原生小鼠 mL 覆盖整个表面, 并采用明胶基速度涂层溶液 (见材料表)温度 (rt)。
- 吸气和丢弃涂层溶液。用2毫升无菌磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 在两个连续的洗涤步骤中冲洗每口井, ph 值7.1-7.5。
- 吸气和丢弃 pbs。用1毫升的 ecm 体积填充井。
3. 原代小鼠肌肉微血管内皮细胞 (mmec) 的分离
- 安乐死一个成人4-12周大, 男性小鼠颈椎脱位没有任何麻醉。其目的是迅速将脊髓与大脑分离, 以便为动物提供快速、无痛的死亡。
- 割断四肢。
- 使用外科锐化 (切割边缘42毫米, 直) 和锐尖 (切削刃23毫米, 直) 剪刀, 直 (锯齿, 2 毫米 x 1.25 毫米 x 12 厘米) 和弯曲 (锯齿, 1.3 毫米 x 1 毫米 x 13 厘米) 钳子。
- 用70% 乙醇消毒所有手术器械。
- 将动物放在背上, 用 7 0% 的乙醇滋润腿部。用锐利的钝器手术剪刀割断髋关节的整个腿。将四肢放入封闭的细胞培养盘 (35 毫米 x 10 毫米)。
请注意:从现在开始, 在无菌层流罩下执行每一步, 并使用灭菌仪器。
- 孤立的肌肉组织 (优先使用股四头肌或三头肌从双腿)。
- 使用锋利的剪刀和弯曲的钳子将皮肤从臀部切开到脚趾尖。用直钳握住脚趾或脚垫。用从脚趾到臀部的弯曲钳子剥去皮肤。
- 通过切开膝盖上的肌腱, 将肌肉沿股骨切断到臀部, 从而隔离股肌股。通过切断跟腱分离三头肌。此后, 沿着胫骨切割到腹股沟窝, 切除肌肉。
请注意:如果在隔离的肌肉中可见大血管 (股骨a ,前部胫骨, 胫骨后部, a. fibularis), 则应清除血管以避免受大血管内皮的污染。 - 要清除大血管, 拿着不含有大血管的部分, 用弯曲的钳子将其切断在血管旁边。对于这个协议, 1 克或更少的肌肉组织等于股四头肌和三头肌苏雷建议。
- 在细胞培养盘 (35 毫米 x 10 毫米) 中加入 2, 445μl ds (从2.1 步开始), 并确定重量。
- 将所有肌肉块转移到这个含有 2445μl ds 的细胞培养盘, 并确定重量。两个测量值的差异提供了肌肉组织的干重, 不得超过1克。
- 使用锐利剪刀将整个肌肉组织切割成小块 (≤2毫米立方体, 约 100件)。
- 将肌肉组织分离。
注:此步骤大约需要120分钟。- 在 37°c (含 5% co 2 的孵化器) 下储存 muscle/DS悬浮液 1.5 h. 使用1毫升胰岛素注射器每20分钟仔细混合一次悬浮液约5分钟。
- 将悬浮液转移到放置在50毫升管上的70μm 尼龙电池过滤器上, 并收集流经。用8毫升的 dmem 清洗细胞过滤器, 并收集流经。
- 在20°c 的 300 x g 下, 将电池过滤器和离心机悬浮 10分钟。小心去除上清液。
注意:颗粒很容易丢失。 - 在1毫升的氨基氯化钾 (ack) 裂解缓冲液 (见所附材料表) 中重新悬浮细胞颗粒, 用于红血球裂解, 并在 rt 孵育 30秒. 添加 9 ml dmem + 10% fcs 以停止反应并将细胞悬浮液转移到15毫升乌贝。
- 按照 cd45 微珠制造商的指示消耗 cd45+细胞。对于 cd45+耗尽的所有以下步骤, 请使用 mcs 缓冲区 (见随附材料表)。
注:此步骤大约需要60分钟。- 使用 neubauer 细胞计数室确定细胞数量 (预计每克肌肉组织约 5 x10 6 个细胞)。
- 离心机悬浮液在 4°c 下以 300 x g 的速度10分钟。完全取出上清液, 并在 90μl mcs 缓冲液中重新悬浮细胞颗粒 (每 107个或更少)。加入10μl 的 cd45 微珠 (每 10个7个或更少的细胞)。
- 在4–8°c 的温度下, 将细胞悬浮液和孵育在冰箱中孵育15分钟。
- 添加 1ml mcs 缓冲液 (每 10个 7个或更少的细胞)。在4°C 以 300 x g 离心10分钟。完全取出上清液, 在 500μl mcs 缓冲液中重新悬浮细胞。
- 对于磁性电池分离, 使用储集层体积为8毫升、容量高达 2x 10 9个总细胞的大磁柱 (lmc)。将 lmc 放置在分离器的磁场中。
- 用3毫升的 mL 缓冲液冲洗到 lmc 储层中。冲洗后, 在柱下方放置一个15毫升的锥形管, 以收集流经。将整个细胞悬浮液 (500μl) 涂在柱上, 让它完全流经。
- 将 mL 缓冲液添加3毫升, 将柱清洗三次, 等到柱内储层为空, 然后再执行下一个清洗步骤。
- 收集通过列使用的未标记单元格, 用于进一步的分离步骤 (表示 cd45 分数).可以丢弃列中累积的标记单元格 (表示 cd45+分数)。
- 按照 cd31 微珠制造商的指示积累 cd31+细胞。对于 cd31+累积的所有以下步骤, 请使用 mcs 缓冲区。
注:此步骤大约需要60分钟。- 使用 neubauer 细胞计数室确定细胞数量 (每克肌肉组织约 4 x10 6个细胞)。
- 离心机在 300 x克的4°C 下从3.5 步获得未标记的细胞悬浮液10分钟。
- 完全取出上清液。在 90μl mcs 缓冲液中重新注入颗粒, 并添加10μl 的 cd31 微珠 (每 10个7个总细胞或更少)。在4–8°c 的温度下, 将整个悬浮液混合在冰箱中15分钟。
- 在4°c 下, 在 300 x g处添加 1ml mcs 缓冲液和离心机10分钟。在500μl 的 mcs 缓冲液中提取上清液并重新悬浮细胞。
- 对于磁性电池分离, 使用具有 3.5 ml 储集层体积和容量高达 2 x10 8个总细胞的中磁柱 (mmc)。
- 将 mmc 放置在分离器的磁场中。用500μl 的 mcs 缓冲液冲洗 mmc。冲洗后, 在柱下方放置一个15毫升的锥形管, 以收集流经。
- 将整个细胞悬浮液 (500μl) 涂在柱上, 让它完全流经。
- 通过添加500μl 的 mcs 缓冲液将色谱柱清洗三次, 并等到柱的储罐为空后再执行下一个清洗步骤。通过列的未标记单元格表示 cd45-cd31 分数 .存储它们以进行进一步的质量控制。
- 从分离器中取出柱, 并将其放置在合适的收集管 (15 ml 管) 上。移液器 2 ml mL 缓冲区到列。立即将磁贴的细胞冲洗干净, 将柱塞牢固地推入柱内。这个cd45-cd31 +分数代表了丰富的原生小鼠 ec。
- 在20°c 条件下, 在 350 x g的情况下离心细胞悬浮液5分钟。完全去除上清液, 并在 1 ml ecm 中重新悬浮细胞 (每克肌肉组织约 0.6 x10 6 个细胞) (见步骤 2.2)。将细胞 (0.5–0.7 x10 6 个细胞) 转移到含有1毫升 ecm 的6井培养板 (从步骤2.3 开始) 的单井中。
- 在培养过程中, 在无菌孵化器中培养37°c 和 5% co 2 的细胞。每两到三天刷新一次 ecm。
4. 原生小鼠 mmec 纯化
-
按照制造商的说明执行 cd31+积累的第二个周期 (cd31 微珠鼠标协议; 请参阅步骤 3.6.)。
- 当细胞在80–90% 的融合时 (通常在7天之后), 用 trypsin/edta 溶液分离细胞。为此, 用2毫升无菌 pbs 在两个连续的清洗步骤中冲洗每口井。每6口使用 800μl trypsin/edta 溶液, 在37°c 孵育, 在无菌孵化器中孵育 3-5分钟, 使用含有至少 10% fcs 的 1200μl dmem 停止酶活性。
- 在20°c 条件下, 在 350 x g的温度下离心细胞悬浮液5分钟。
- 执行第二个 cd31-mcs 步骤以提高纯度 (根据 cd31 微珠制造商的说明; 见 3.6.)。
- 通过明亮的场或标准的相位对比显微镜观察细胞融合。
20x 放大倍率和0.35 镜头数字光圈。请参见图 1。
请注意:细胞可以用于各自的实验, 也可以通过传代保存在培养中。在较低的段落中及时使用细胞进行实验。不建议在通过后使用细胞
8–10。
5. 质量控制
- 在第二次 cd31-mcs 步骤后, 对原生小鼠 mmec 进行流式细胞仪检查。
- 通过添加 1 ml 流式细胞术 (fc) 缓冲液 (见所附材料表) 准备流式细胞仪管。
- 当细胞在100% 汇合时 (通常在14天后), 用 Trypsin/EDTA 溶液分离细胞。为此, 用2毫升无菌 pbs 在两个连续的清洗步骤中冲洗每口井。每6口使用 800μl trypsin/edta 溶液, 在37°c 孵育, 在无菌孵化器中孵育 5%, 用含有 10% fcs 的 1200μl dmem 停止酶活性。
- 使用 neubauer 细胞计数室确定细胞数, 并在制备的 facs 管中添加至少 1 x10 5 个细胞。
- 在300xg 的温度下, 在 4°c 下离心细胞悬浮液10分钟。通过去除上清液、将细胞重新悬浮在 1 ml fc 缓冲液中并在4°c 时在 300 x g离心10分钟来完成两个清洗步骤。
- 通过添加抗小鼠 cd31-fitc 抗体 (1:100) 和带有 fc 缓冲液的抗小鼠 cd45-pe (1:100) 来准备染色组合。
- 在流式细胞仪管中的100μl 染色混合物中重新移植细胞。在4°c 下孵化30分钟。添加1毫升的 fc 缓冲区。离心细胞悬浮液在300xg 的 4°c 下悬浮5分钟。小心去除上清液, 在200μl 的 fc 缓冲液中重新悬浮细胞。
- 按照门控策略测量流式细胞仪中的细胞, 如图所示。2a。
- 在第二次 cd31-mcs 步骤后, 对原代小鼠 mmec 进行免疫荧光染色。
- 在被单上涂上。
- 将直径为13毫米的无菌圆形玻璃盖板转移到24井板的井中。每口添加300μl 的速度涂层溶液, 可涂布。在室温下 (rt) 孵化3-5分钟。
- 吸气和丢弃涂层溶液。用2毫升无菌 pbs 连续两个清洗步骤冲洗每口井。吸气和丢弃 pbs。
- 种子 1 x 10 5 细胞在1毫升 ecm 上的涂层覆盖液和孵育 5% co 2 在无菌孵化器中孵育, 直到细胞达到99% 的融合.
- 进行固定和免疫荧光染色。
- 从5.2.1.3 中去除培养细胞的 ecm 培养基。
- 通过添加 300μl 4% 甲醛 (pfa) 固定培养细胞, 每口井 ph 值为 7.4, 4°C 10分钟。
注意事项:pfa 有毒, 必须小心处理。 - 在 rt 处使用每口井添加1毫升 pbs, 并在5分钟后去除上清液, 从而执行3个清洗步骤。
- 在 pbs 中制备含有 5% bsa、0.2% triton-x 和1% 山羊血清的阻滞溶液。
- 在每口井中加入300μl 的封堵液, 并在 rt 孵育1小时。
- 去除上清液, 在 5% bsa 中加入抗 pecam-1 (cd31) 抗体 (1:200) 的每口井 200μl, 在 pbs 中添加1% 山羊血清, 在4°c 孵育过夜。
- 在 rt 执行5分钟后, 在 rt 中添加 1 ml pbs, 并在每个步骤中取出上清液, 从而执行3个清洗步骤。
- 在 1% bsa 和 pbs 中制备含有 cy3 共轭抗大鼠 igg 抗体 (1:500) 的二级抗体溶液。在黑暗中, 每井加入 300μl, 在 rt 孵育1小时。
- 在 rt 执行5分钟后, 在 rt 中添加 1 ml pbs, 并在每个步骤中取出上清液, 从而执行3个清洗步骤。
- 用钳子小心地取出圆形玻璃盖板, 并将其转移到显微镜下的滑梯上。在电池层上添加含有 dapi 的适当安装介质, 并小心地在其上放置一个盖板玻璃 (见所附材料表)。
- 用配备荧光光源 (120 w) 和两个滤片集的适当荧光显微镜观察细胞: 一套具有 550/25 纳米和6057纳米波长的发射滤光片, 用于检测 cy3 550/25 nm。
- 使用第二个发射波长为 36550 nm 和 445/50 nm 的过滤器来检测 dapi 350/440 nm。对 dapi 使用40x 和80% 强度的放大倍率 14.5 mwcm 2, 采集持续时间为30毫秒. 用于检测 cy3, 使用80% 的 67.5 mwcm 2, 采集持续时间为60毫秒。
- 在被单上涂上。
- 执行定量 pcr。
- mrna 的分离。
- 遵循标准程序, 使用酸性鸟苷硫氰酸苯酚 (agtp) 试剂分离 mrna。使用 cd45-cd31- (步骤 3.6.8 )、cd45-cd31+ (见步骤 3.6.9) 组分和培养的原生小鼠 mec (4.1.3) 中至少 0.5 x 10 6 个细胞
- 在20°c 条件下, 在 300 x g的情况下离心细胞悬浮液10分钟。把上清液完全脱下来。将细胞颗粒在500μl 的 agtp 试剂中重新悬浮, 并将细胞悬浮液转移到2毫升的反应管中。在 rt 孵化5分钟。
- 加入100μl 氯仿, 用力摇 15分钟, 在 rt 煮3分钟。
- 离心机悬浮 15分钟, 12, 000 x 克在 4°C.
- 小心地取出上水相 (含 rna), 转移到 1.5 ml 的反应管中。加入250μl 异丙醇, 在 rt 孵育10分钟。
- 在4°c 下, 以 12, 000 x g的速度进行10分钟的离心步骤。
- 取下上清液, 小心加入1% 的乙醇。在4°c 条件下, 以 7500 x g 离心5分钟。
请注意:颗粒很容易丢失。 - 完全取出上清液。让颗粒在空气中干燥5-10分钟。
注:乙醇需要去除, 但不要干燥太多。 - 在30μl 二乙基碳酸盐处理水中溶解颗粒, 在55°c 下加热10分钟。
请注意:rna 浓度和纯度可以用光谱分光光度法测量。
- 进行 cdna 合成 (逆转录酶 pcr)。
- 制备含有: 10μl pcr 缓冲液 (5x)、2、5μl 脱氧化基苯二甲酸-三磷酸 (dntp (10mm)), 0.5μl 单链底漆 (0.2μg/μl) 的随机混合物, rase 抑制剂 1μl (40 u/μl, 0.4 逆转录酶 (200μ-l) 和5.6 μl经过处理的二乙基吡咯烷酮 (见所附材料表)。
- 在 0.2μl pcr 管中稀释30μl 二乙基碳酸酯处理后的水中的500纳克 rna, 并加入整个20μl 的主混料。
- 使用 pcr 循环器执行以下步骤: 10分钟 25°c, 30分钟 50°c, 5分85°c, 并保持在4°c。
- mrna 的分离。
- 进行定量 pcr (qpcr)。
请注意:对样品进行重复或三重奏的 qpcr。 - 与两种不同的荧光染料一起使用底漆。底漆的吸收为495纳米, 为感兴趣的基因排放 517 nm。
- 为了检测卫星细胞标记基因的表达, 使用引物配对盒蛋白 7 (pax7) 和 m-cadherin (cdh15) (见所附材料表)。
- 为了检测内皮细胞标记基因的表达, 使用引物的环素-5 (cld5), 闭塞 (oln) 和 zonula 闭塞-1 (tjp1或zonula) (见所附材料表)。
- 作为 18s rrna 的参考基因, 使用吸收 538 nm 和发射 538 nm 波长的引物。
- 为每个感兴趣的基因准备一个 qpcr 组合, 并提供相应的引物。主要组合含有: 10μl qpcr 缓冲液 (2x)、感兴趣基因的1μl 底漆 (10μm)、18s rrna 的1μl 底漆和4μl 的无核酸水。
- 将16μl 的主混料加入96孔反应板的单井中。在含有主混物的油井中加入4μl 的 cdna (从步骤5.3.2 中获得)。
- 使用实时 pcr 循环器执行以下步骤: 保持阶段与 50°c 2分钟和 95°c 10分钟循环阶段40个周期 95°c 15秒和 60°c 1分钟。
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Representative Results
隔离一天后, 原生小鼠 mmec 和残留的其他细胞形成企业集团, 并坚持到培养的培养物的底部 (图 1a天 1)。从第7天开始, 就可以观察到扁平和拉长的细胞。然而, 其他主要是球状细胞的污染仍然是可见的 (图 1 a 第7天)。因此, 需要通过mcs 进行 cd31 阳性选择的另一个周期。此后, 原生小鼠 mmec 扩散到约80–90% 的密度。在融合时, 它们通常形成一个纵向对齐细胞的非重叠单层 (图 1a第14天)。由于接触抑制, 扩散停止在汇合处。14天后约 5-10 x 10 5 细胞可用于进一步的研究。
通过流式细胞仪进行质量控制,使用可固定活力染料 fvd780 (用于染色死细胞)、pecam1 (cd31) 和 ptprc (cd45, 作为造血源细胞的标记) 显示, 细胞的活力和纯度分别在70% 左右在隔离之后立即 (图 2a)。通过mcs 进行 cd31 阳性选择后培养的细胞在纯度和生存能力方面都显示出令人满意的价值, 每个细胞的含量高达 95% (图 2b)。
为了评价选择步骤的准确性, 通过定量 pcr (qpcr) 进一步研究了获得的细胞在 mrna 水平上对骨髓细胞标记基因配对盒蛋白 7 (pax7) 和 m-cadherin (cdh15) 的基因表达。原代小鼠 mmec (pmmec) 和分化原代小鼠肌肉细胞 (pmmc) 分别作为阴性对照和阳性对照。小鼠肌肉细胞是商业购买的。如预期的那样, 只有 cd45-cd31 -分数以及 pmmc 表示 pmMC 和cdh15, 而 cd45-cd31+和主要小鼠 mec 对这些标记呈阴性反应 (图 2c).
ec 来源于骨骼肌内膜内的毛细血管, 表达紧密的结节蛋白4,5。采用 qpcr 技术, 评价了第二次 Cld5 mcs 步骤后, 融合原生小鼠mmec 的 claudin-5 (cld5)、闭合素 (cln) 和 zonula 遮挡-1 (tjp1或zonula) 的表达.pmmc 被用作控件 (图 2d)。原生小鼠 mmec 的cld5、 oln和tjp1水平较高, 而 pmmc 的 tjp1 表达率较低。此外, 免疫荧光染色作为质量控制, 证实了内皮特异性标记 pecam1 在原代小鼠 mec 中的表面表达 (图 2e)。
图 1: 原生小鼠 mmeec 的形态.(a) 用相色对比显微镜观察第1天至第14天培养的原生小鼠 mec 的代表性图像。d1 = 第1天, d1 = 第7天, d1 = 第14天。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 原生小鼠 mmec 的质量控制.利用 (i) fsc/ssc、(ii) fvd780 和 (iiiia) cd45 (iiib) cd31 (虚线 = 同型控制), 在分离 (a) 后和第15天 (b) 立即进行原生小鼠 mmec 流式细胞化分析的分型策略.(c) pax7和 m-cadherin (cdhn15) 在 mcs 隔离后的 cd45-cd1- 、cd45-cd31+组分以及原代小鼠 mec (pmmmec) 和原代小鼠肌肉细胞 (pmMMEC) 中的表达水平).表达水平显示为c t 值(样本-18s rrna), n. d. = 未确定。(d) pmmec 和 pmmc 的紧密连接蛋白 claudin-5 (cldn5)、遮挡素 (olcn) 或 zonula 闭塞-1 (tjp1或zo-1) 的表达水平, 如c t 值所示。(e) 第二次 cd31 阳性选择后, 在培养的原代小鼠 mmeec 24小时内进行 pecam1 (红色) 免疫荧光染色。含 dapi (蓝色) 安装介质的核染色;左 = 反 pecamdudapi, 右: 负控制/dapi。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
微血管内皮细胞在所有组织中提供屏障功能, 其功能障碍导致相关器官的疾病3。此外, 针对器官的微血管 ec 研究可以为新的治疗策略铺平道路。因此, 深入了解生理和病理生理条件下的微血管 ec 功能具有重要的科学意义。白细胞与内皮细胞相互作用的调节成功地用于治疗多发性硬化症患者与纳珠单抗, 一种抗体, 防止淋巴细胞粘附, 从而转染 6. 然而, 包括炎症亚型在内的各种肌病患者至今仍然只能治疗得很差。因此, 阐明骨骼肌内皮的 ec 特性有助于扩大对肌病的治疗, 或导致新的治疗方法。
建立了永生内皮细胞系 (iecl), 并将其用于几个体外模型。与初级微血管 ec 相比, 这些细胞系具有一些优势, 因为这些细胞系是不朽和快速增殖的。此外, 原代培养的细胞可以经过一段时间或通道后发生衰老, 失去或改变其形态或生理功能。然而, iecl 只维持一些内皮细胞的特性, 不能类似于不同的器官传播的初级微血管 ec 的品种。值得注意的是, 它们很少来自骨骼肌。到目前为止, 只有一份出版物描述了人类骨骼微血管内皮细胞系, 名为 tsm15 5.相比之下, 到目前为止, 还没有描述小鼠微血管 ec。最后, 转基因动物的原代细胞为研究体外基因修饰提供了机会。然而, 初级细胞培养也存在一定的陷阱。首先, 对没有意义的细胞的污染会干扰实验结果的有效性。因此, 必须保证几个选择步骤的准确性和分离细胞的高纯度。肌肉组织离解后的细胞悬浮液含有红细胞和不同的单核细胞类型, 如免疫细胞、卫星细胞、周细胞、成纤维细胞和内皮细胞7。因此, cd31 mcs 步骤后的细胞分数进行了单纯由肌肉卫星细胞表达的标记的测试。如预期 cd45- cd31-分数和原代肌肉细胞显示帕克斯-7 和 cdh15 ,而 cd45-cd31+和培养的原代小鼠 mec 是负的这些标记后, 第二次 cd31mcs 步骤。此外, 对分离或培养的细胞进行质量控制是不可避免的, 以保证可靠和可重复的实验。主要小鼠 mmec 的质量控制有几种方法: 除了对形态特性进行显微镜检查外, 还可以使用流式细胞仪、pcr 和免疫荧光污渍的特征 ec 标记物 (如 cd31、sca-1)。新分离原生小鼠 mmec 的纯度评估仅为60-70% 左右, 而可检测出约70% 的生存能力。这些细胞的显微镜部分显示细胞团群, 其中可能包括污染细胞, 如附在 ec 的成纤维细胞或周细胞。7天后主要观察到扁平和拉长的细胞和球体细胞。然而, 两个 cd31 mcs 通道导致了高的可行性和纯度。提高纯度的替代方法, 如含有嘌呤的培养基在原代小鼠 mmec 中失败, 同时对小鼠大脑微血管 ec 8有效。
由于毛细血管中提取的微血管 ec 表达紧密的连接蛋白, 因此初步小鼠 mec 与分化肌肉细胞相比, 其 Cld5、 oln和tjp1的基因表达得到了研究。如预期的那样, 在原生小鼠 mmeec 中检测到所有紧密结合分子。相比之下, 肌肉细胞的tjp1表达率很低, 而无法确定cld5和ocn的表达。类似的表达模式以前在整个小鼠骨骼肌中得到了证实。在这里, tjp1的基因和蛋白质水平的表达可以检测到, 但对于闭塞9则不是。进一步的功能特征, 如内皮抵抗可以测量。
本文描述的协议的特点只是从小鼠肌肉组织中分离微血管 ec。然而, 它可能会转移到其他各种物种, 例如, 一个类似的协议, 为大鼠微血管 ec 从附膜脂肪垫衍生。在 cd31 阳性选择之前,通过mcs 进行密度梯度离心 10 。类似的方法在大血管 ec 分离大血管 ec 从大鼠股动脉11成功。最近公布的分离心肺组织微血管 ec 的方法是使用 cd31 和内角林 (cd105) 作为磁性细胞分选的抗原12。然而, 使用额外的 cd105 磁珠分离不能进一步提高 ec 的纯度。分离纯化原代小鼠 mmec 的另一种可能性是多色荧光活化细胞分选 (facs)。小鼠肌肉中的 sca-1 +、cd31+、cd34模糊细胞和 cd45细胞的明显种群可以被分离, 并被定性为原生小鼠 mmeec 13.这种方法的优点是一个纯 ec 群体, 可以直接用于或培养进一步的实验 (请注意, 在我们的经验中, facs 会导致细胞死亡增加, 因为更高的细胞应激)。此外, 不同细胞类型的死细胞或团块可以通过流式细胞仪显著减少分离细胞的数量。此外, 在 21% o-2 和 5% co2 的常用培养条件下, 外联细胞仪分离的原生小鼠 mmec 未成功培养.在这里, 氧气水平必须被调整到5% 为充足的耕种13。此外, 外地资产管制系统技术更为复杂、耗时, 基础设施的先决条件也很昂贵。
4-12 龄雄性小鼠的股四头肌和三头肌最适合分离原生小鼠 mec, 因为它们很容易获得, 而且足够大, 可以分离出足够的细胞数量 (5-10 x10 5/克肌肉)。因此, 必须确保在独立实验中条件是可比的。如上所述, 原代细胞可以发生衰老。因此, 在较低的通道中迅速使用细胞进行各自的实验。经过8-10 段, 原生小鼠 mmec 改变形态, 显示出缓慢的增殖速度, 失去接触抑制作为去分化和衰老的标志。
此外, 还有一些有关此协议疑难解答的注意事项。无菌工作是避免污染所必需的。质量控制是监测分离细胞的纯度和活力所必需的。本协议中的旧材料必须按照制造商的说明进行储存和应用。另外, 使用过的动物的年龄和性别, 以及不同的肌肉群可能会影响孤立细胞的质量和可比性的实验。
所述方案应被视为分离骨骼肌初级微血管 ec 的平台方法。隔离细胞可用于多种应用, 以进一步深入了解血肌肉屏障功能。细胞既适用于蛋白质和 rna 表达研究, 也适用于功能分析 (包括转染和粘附研究)。然而, 该协议针对的是以炎症过程为重点的研究, 因此可能需要对不同的研究领域稍作修改。
为了模拟 mvu 内复杂的空间和功能细胞相互作用, 可以在更复杂的三维细胞培养系统中与其他细胞类型一起培养原生小鼠 mmec。前瞻性地说, 它也应该是可能的产生 mvu 有机体, 因为它已经描述了其他组织在14之前。然而, 成功隔离原生小鼠 mmec 是不可避免的目标, 以这一步骤的目标。
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Disclosures
提交人声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了 "else kröner-fre舍enius-stibtung" (2018_A03 到 tr) 的支持, "创新 medizinische forschung (基金组织) münster" (i-ru2001 1811 to tr) 和德国研究基金会 (dfg, inst 2105/27-1--, me 328---1, me 3281-1-1 至 sgm)。黑克·布鲁姆提供的插图图片。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
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