Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering af primære Murine skeletmuskulatur mikrovaskulære Endothelial Cells

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58901
Automatic Translation
*1, *1, 1, *1, *1
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster
* These authors contributed equally

Summary

Mikrovaskulære endotelceller af skeletmuskulatur (MMEC) form indersiden af muskel kapillærer og regulere både, udvekslingen af væsker/molekyler og migration af (immunceller) mellem muskelvæv og blod. Isolering af primære murine MMEC, som beskrevet her, giver mulighed for omfattende in vitro-undersøgelser af "myovascular enhed".

Abstract

Endotelceller af skeletmuskulatur kapillærer (muskel mikrovaskulære endotelceller, MMEC) opbygge barriere mellem blodet og skeletmuskulatur regulerer udvekslingen af væsker og næringsstoffer samt immunrespons mod smitsomme agenter ved at kontrollere immun celle migration. For disse funktioner, MMEC danne en funktionel "myovascular enhed" (MVU), med yderligere celletyper, som fibroblaster, pericytes og skeletmuskulatur celler. Derfor bidrager en dysfunktion af MMEC og derfor MVU til en lang række myopatier. Men reguleringsmekanismer af MMEC i sundhed og sygdom forbliver utilstrækkeligt forstået og deres udredning forud for mere specifikke behandlinger for myopatier. Isolation og tilbundsgående undersøgelse af primær MMEC funktioner i forbindelse med MVU kunne fremme en bedre forståelse af disse processer.

Denne artikel indeholder en protokol for at isolere primære murine MMEC af skeletmuskulatur af mekanisk og enzymatiske dissociation herunder rensning og kultur vedligeholdelse skridt.

Introduction

Via blodbanen, celler og organer leveres med ilt, substrater og andre nødvendige molekyler. Denne udveksling foregår i kapillærer, de mindste fartøjer. Kapillærer er dannet af en indre endotel (EF) cellelag hvis integritet er fortsat en forudsætning for vellykket regulering af muskel homøostase mellem det intravaskulære og interstitielle rum. For at sikre en selektiv overgang af opløselige faktorer og celler, EF udgør en éncellelag forbundet af stram og adherens vejkryds 1. Ud over sin rolle som barriere for næringsstoffer eller stofskifteprodukter regulere EF ansættelse af leukocytter i inflammatoriske processer. Betændelse eller væv skader fører til en op-regulering af adhæsionsmolekyler på EF overflade og produktion af kemokiner lette leukocyt vedhæftet fil og transmigration i target væv 2. EF er derfor kritisk involveret i reguleringen af inflammatoriske processer som forsvar mod patogener eller væv reparation.

En dysfunktion i EF er direkte forbundet med Vaskulære sygdomme, kronisk nyresvigt, venøs trombose svær patogen infektioner. Derudover EF er næsten altid involveret i orgel-specifikke autoimmunitet såsom diabetes mellitus eller multipel sklerose 3. Funktionen barriere mellem blodet og organer er derfor styret af et samordnet samspil af forskellige celletyper. I skeletmuskulaturen mikrovaskulære endotelceller (MMEC) samt muskelceller, fibroblaster og pericytes udgør en funktionel enhed, "myovascular enhed" (MVU). Derfor kan en dysfunktion af MVU spiller en afgørende rolle i Patofysiologi af myopatier. Dog en dybere forståelse af disse reguleringsmekanismer stadig mangler og i øjeblikket er til hinder for identifikation af nye, presserende, terapeutiske mål i myopatier.

For at undersøge de komplicerede fysiologiske og patofysiologiske mekanismer, er dyremodeller almindeligt anvendt. Men, in vitro- modeller tilbyder fordel fokusere på emne af interesse ved at udelukke en række forstyrrende faktorer. For at undersøge processer in vitro-det er nødvendigt at isolere ren og levedygtige primærelementer. I modsætning til cellelinjer aktiverer primærelementer isoleret fra transgene dyr for at undersøge konsekvenserne af genetiske modifikationer i vitro.

Her, er en metode til at isolere primære murine MMEC beskrevet ved hjælp af mekaniske og enzymatiske dissociation efterfulgt af magnetisk aktiveret celle sortering teknikker (MCS) for rensning. Til dette formål anvendes magnetiske perler mod specifikke overflade markører. Trombocyttal endotel celle vedhæftning molekyle-1 (PECAM1, CD31) er hovedsagelig udtrykt på EF og kan bruges til at berige denne celletype. For at garantere høj celle renhed, er hæmatopoietisk celler udelukket af en negativ selektion for protein tyrosin phosphatase receptor type C (PTPRC, CD45). Yderligere, kvalitetskontrol, dyrkning af primære murine MMEC, potentielle anvendelsesmuligheder og begrænsninger samt særlige overvejelser præsenteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af de lokale myndigheder og gennemføres i henhold til den tyske animalske velfærd opføre (84-02.05.20.13.097).

1. generelle bemærkninger om dyreforsøg

  1. Udføre alle mus eksperimenter efter retningslinjerne i de respektive institutionelle dyrs pleje og bruge udvalget.
  2. Holde mus under standardiserede betingelser og i overensstemmelse med internationale retningslinjer som Federation for Laboratory Animal Science foreninger (FELASA).
    Bemærk: Generelt kan denne isolation teknik bruges til mus uafhængigt af alder, køn eller genetiske baggrund. For at opnå en tilstrækkelig celle nummer, er 4-10 uge gamle hanner at foretrække, fordi biologiske egenskaber kan varierer med alder og køn.

2. udarbejdelsen af løsninger, medier og belægning

  1. Forbereder fordøjelsen løsning (DS) ved at blande 2,2 mL af Dulbecco´s modificeret Eagle Medium (DMEM) med 200 μl Collagenase-Dispase og 45 μL Desoxyribonuclease (DNase).
  2. Forberede 500 mL i Endothelial celle medium (ECM) ved at blande 450 mL af DMEM med 50 mL FCS (ca 10%), 0,25 mL basic fibroblast vækstfaktor bFGF (20 μg/mL, cirka 0,05%) og 5 mL penicillin-streptomycin (ca 1%). Udføre sterile filtrering i et glasrør (diameter af filter porer: 0,2 μm). Bagefter gemme løsning ved 4 ° C.
  3. Coat celle kultur plader, som beskrevet nedenfor.
    1. Til dyrkning af frisk isolerede primære murine MEC dækker hele overfladen med 1 mL pr. brønd af et 6 godt celle kultur plade med en gelatine baseret hastighed belægning løsning (Se Tabel af materialer) ifølge producentens anvisninger for 3-5 min. på værelse temperatur (RT).
    2. Opsug og kassér belægning løsning. Skyl hver brønd med 2 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pH 7.1-7,5 i to på hinanden følgende vaske trin.
    3. Opsug og kassér PBS. Fylde brøndene med 1 mL volumen af ECM.

3. isolering af primære Murine muskel mikrovaskulære Endothelial celler (MMEC)

  1. Aflive en voksen 4 – 12 uger gamle, mandlige mus af cervikal dislokation uden nogen anæstesi. Formålet er at hurtigt adskille rygmarv fra hjernen for at give dyret med en hurtig og smertefri død.
  2. Sever ekstremiteterne.
    1. Bruge en kirurgisk skarp/stump (forkant 42 mm, straight) og skarp/skarp (forkant 23 mm, straight) saks, en straight (savtakket, 2 mm x 1,25 mm x 12 cm) og en buet (savtakket, 1,3 mm x 1 mm x 13 cm) pincet.
    2. Desinficere alle kirurgiske instrumenter med 70% ethanol.
    3. Placer dyret på ryggen, fugtes benene med 70% ethanol. Sever hele benet ved at skære på hofteled med skarp/blunt kirurgisk saks. Placer yderpunkterne i en lukket celle kultur parabol (35 mm x 10 mm).
      Bemærk: Fra nu af udføre hvert skridt under en steril laminar flow hætte og arbejde med steriliserede instrumenter.
  3. Isolere muskelvæv (fortrinsvis bruge musculus quadriceps femoris eller musculus triceps surae fra begge ben).
    1. Skær huden åben fra hoften til tå-tip ved hjælp af en skarp/skarp saks og buet pincet. Hold tå eller footpad med lige pincet. Skrælle huden med buet pincet fra tå til hoften.
    2. Isolere musculus quadriceps femoris ved at skære senen fra knæet og sever muskel langs lårbenet til hoften. Isolere musculus triceps surae ved overskæring achillessenen. Herefter skære langs skinnebenet at den knæhaselymfeknuderne fossa og fjerne musklen.
      Bemærk: Hvis store fartøjer (A. femoralis, A. tibialis anterior, A. tibialis posterior, A. fibularis) er synlige i de isolerede muskler, fjerne fartøjer for at undgå kontaminering af makrovaskulære endotelet.
    3. For at fjerne store fartøjer, holde del af musklen ikke indeholder store fartøjer med en buet pincet og skære det ved siden af skibet. For denne protokol anbefales 1 g eller mindre lig med både quadriceps femoris og triceps surae muskelvæv.
    4. Tilføje 2,445 µL DS (fra trin 2.1) til en celle kultur parabol (35 mm x 10 mm) og vejning.
    5. Overføre alle muskel stykker til denne celle kultur parabol indeholdende 2445 µL DS og vejning. Forskellen på begge målte værdier giver muskelvæv, der ikke må overstige 1 g tørvægt.
    6. Klippe det hele muskelvæv i små stykker (≤2 mm kuber, ca. 100 stykker) ved hjælp af skarp/skarp saks.
  4. Adskille muskelvæv.
    Bemærk:     dette trin tager ca 120 min.
    1. Store muskel/DS suspension ved 37 ° C (kuvøse med 5% CO2) for 1,5 h. Bland suspension omhyggeligt hvert 20 min for ca. 5 min. ved hjælp af en 1 mL insulin sprøjte.
    2. Overføre suspension til en 70 μm nylon celle si placeret på en 50 mL tube og indsamle flow gennem. Vaske celle si med 8 mL af DMEM og indsamle flow gennem.
    3. Kassér cellesuspension si og centrifugeres i 10 minutter ved 300 x g ved 20 ° C. Fjern forsigtigt supernatanten.
      Forsigtighed: pellet er let at miste.
    4. Resuspend celle pellet i 1 mL af en Ammonium-chlorid-kalium (ACK) lysing buffer (Se vedlagte Tabel af materialer) for lysering af røde blodlegemer og Inkuber i 30 s på RT. tilføje 9 mL DMEM + 10% FCS at stoppe cellesuspension reaktion og overførsel til en 15 mL t ube.
  5. Nedbryder CD45+ celler efter CD45 microbeads producentens anvisninger. For alle følgende trin i CD45+ udtynding bruge MCS buffer (Se vedlagte tabel af materialer).
    Bemærk:     dette trin tager ca 60 min.
    1. Bestemme celle numre ved hjælp af en Neubauer celle tælle kammer (forventer ca 5 x 106 celler pr. g muskelvæv).
    2. Centrifuge suspension ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Take off supernatanten helt og resuspend celle pellet i 90 µL MCS buffer (pr. 107 celler eller mindre). Tilsættes 10 μL CD45 microbeads (pr. 107 celler eller mindre).
    3. Bland cellesuspension og Inkuber i 15 min. i køleskab ved 4 – 8 ° C.
    4. Tilsæt 1mL MCS buffer (pr. 107 celler eller mindre). Der centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten helt og resuspend celler i 500 μL MCS buffer.
    5. For magnetisk celleseparering skal du bruge en stor magnetisk kolonne (LMC) med et reservoir volumen af 8 mL og en kapacitet på op til 2 x 109 samlede celler. Placer LMC i magnetfelt af separatoren.
    6. Skyl med 3 mL af MCS buffer i reservoiret af LMC. Efter skylning, placere en 15 mL konisk slange under kolonnen til at indsamle gennemstrømningen. Anvende den hele cellesuspension (500 µL) over på kolonnen og lad det helt flyde.
    7. Vask kolonnen tre gange ved tilsætning af 3 mL af MCS buffer i reservoiret og vente, indtil column´s reservoir er tom, før du udfører det næste vask skridt.
    8. Indsamle umærkede cellerne passerer kolonnen brug for yderligere adskillelse trin (der repræsenterer CD45- brøkdel). Mærket celler (der repræsenterer CD45+ brøkdel) akkumuleret i kolonnen kan kasseres.
  6. Akkumulere CD31+ celler følgende CD31 microbeads producentens anvisninger. For alle følgende trin af CD31+ ophobning bruge MCS buffer.
    Bemærk:     dette trin tager ca 60 min.
    1. Bestemme celle nummer ved hjælp af en Neubauer celle tælle kammer (forventer omkring 4 x 106 celler pr. g muskelvæv).
    2. Centrifuge fremstillet umærkede cellesuspension af trin 3.5 i 10 minutter ved 300 x g ved 4 ° C.
    3. Fjern supernatanten helt. Resuspenderes i 90 μL MCS buffer og tilsættes 10 μL CD31 microbeads (pr. 107 samlede celler eller mindre). Bland det hele suspension og Inkuber i 15 min. i køleskab ved 4 – 8 ° C.
    4. Tilsæt 1mL MCS buffer og centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Take off supernatanten og resuspend celler i 500 µL af MCS buffer.
    5. For den magnetiske celleseparering skal du bruge et medium magnetiske kolonne (MMC) med et reservoir volumen på 3,5 mL og en kapacitet på op til 2 x 108 samlede celler.
    6. Placer MMC i magnetfelt af separatoren. Skyl MMC med 500 µL af MCS buffer. Efter skylning, placere en 15 mL konisk slange under kolonnen til at indsamle gennemstrømningen.
    7. Anvende den hele cellesuspension (500 µL) over på kolonnen og lad det helt flyde.
    8. Vask kolonnen tre gange ved at tilføje 500 µL af MCS buffer og vente, indtil den kolonne reservoir er tom, før udførelse af trinnet næste vask. Umærkede celler passerer kolonnen repræsenterer CD45- CD31- fraktion. Gemme dem for yderligere kvalitetskontrol.
    9. Fjern kolonnen fra separatoren og placere den på en egnet collection tube (15 mL tube). Afpipetteres 2 mL MCS buffer på kolonnen. Straks skylle ud de magnetisk mærket celler ved fast at skubbe stemplet i kolonnen. Denne CD45- CD31+ brøkdel repræsenterer beriget primære murine EF.
    10. Centrifuge cellesuspension i 5 min. på 350 x g ved 20 ° C. Fjern supernatanten helt og resuspend celler (forventer omkring 0,6 x 106 celler pr. g muskelvæv) i 1 mL ECM (Se trin 2.2.). Overfør celler (0,5-0,7 x 106 celler) til et enkelt godt af en coated 6-godt kultur plade (fra trin 2.3) indeholder 1 mL af ECM.
  7. For dyrkning, Ruger celler ved 37 ° C og 5% CO2 i en steril inkubator. Opdater ECM hver to til tre dage.

4. primære Murine MMEC rensning

  1. Udføre en anden cyklus af CD31+ ophobning, efter producentens instruktioner (CD31 microbeads mus protokol; se trin 3.6.).
    1. Fjern celler med Trypsin/EDTA-oploesning, når de er på 80-90% confluence (normalt efter 7 dage). For dette, skyl hver brønd med 2 mL steril PBS, i to på hinanden følgende vaske trin. Bruge 800 μL Trypsin/EDTA-oploesning pr. 6-godt og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i en steril inkubator for 3-5 min. Stop enzymatisk aktivitet ved hjælp af 1200 μl DMEM indeholdende minimum 10% FCS.
    2. Centrifugeres cellesuspension i 5 min. på 350 x g ved 20 ° C.
    3. Udføre den anden CD31-MCS skridt for at øge renhed (i henhold til instruktionerne CD31 microbeads manufacturer´s; se 3.6.).
    4. Observere celle sammenløbet via lysfelt eller standard fasekontrast mikroskopi ved hjælp af en
      20 x forstørrelse og 0,35 numeriske blænden. Se figur 1.
      Bemærk: Celler kan bruges til respektive eksperimenter eller holdes i kultur af passaging. Bruge celler for eksperimenter straks i lavere passager. Det anbefales ikke at bruge celler efter passage
      8 – 10.

5. kvalitetskontrol

  1. Udføre flowcytometri af primære murine MMEC efter det andet CD31-MCS-trin.
    1. Forbered en FACS rør ved at tilføje 1 mL flow flowcytometri (FC) buffer (Se vedlagte Tabel af materialer).
    2. Fjern celler med Trypsin/EDTA-oploesning, når de er på 100% confluence (normalt efter 14 dage). For dette, skyl hver brønd med 2 mL steril PBS, i to på hinanden følgende vaske trin. Bruge 800 μL Trypsin/EDTA-oploesning pr. 6-godt og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i en steril inkubator for 3-5 min. Stop enzymatisk aktivitet ved hjælp af 1200 μl DMEM indeholdende 10% FCS.
    3. Bestemme celle nummer ved hjælp af en Neubauer celle tælle kammer og tilføje et minimum af 1 x 105 celler til rede FACS røret.
    4. Centrifuge cellesuspension i 10 minutter ved 300 x g ved 4 ° C. Udføre to vaske trin ved at fjerne supernatanten, resuspending celler i 1 mL FC buffer og centrifugering i 10 minutter ved 300 x g ved 4 ° C.
    5. Forbered en farvning mix ved at tilføje anti-mus CD31-FITC antistof (1: 100) og anti-mus CD45-PE (1: 100) med FC buffer.
    6. Resuspend celler i 100 μL af farvning mix i FACS rør. Inkuber i 30 min. ved 4 ° C. Der tilsættes 1 mL af FC buffer. Centrifuge cellesuspension i 5 min på 300 x g ved 4 ° C. Forsigtigt fjerne supernatanten og resuspend celler i 200 μl af FC buffer.
    7. Måle celler i et flow forskellige følgende gating strategien er vist i figur. 2A.
  2. Du kan også udføre immunofluorescens farvning af primære murine MMEC efter det andet CD31-MCS-trin.
    1. Frakke af coverslips.
      1. Overføre en steril 13 mm diameter runde glas coverslip i en brønd på en 24 godt plade. Frakke coverslip ved at tilføje 300 µL af hastighed belægning løsning pr. brønd. Inkuber i 3-5 min. ved stuetemperatur (RT).
      2. Opsug og kassér belægning løsning. Skyl hver brønd med 2 mL steril PBS i to på hinanden følgende vaske trin. Opsug og kassér PBS.
      3. Frø 1 x 105 celler i 1 mL ECM på den coatede coverslip og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i en steril inkubator indtil celler er 99% sammenflydende.
    2. Udføre fiksering og immunfluorescens farvning.
      1. Fjerne ECM medium af dyrkede celler fra 5.2.1.3.
      2. Fix kulturperler celler ved at tilføje 300 µL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) med pH-værdi på 7,4 pr. brønd for 10 min. ved 4° C.
        Forsigtighed: PFA er giftigt og skal håndteres med omhu.
      3. Udføre 3 vask trin ved tilsætning af 1 mL PBS pr. brønd og Fjern supernatanten efter 5 min på RT.
      4. Forberede en blokerende løsning indeholdende 5% BSA, 0,2% Triton-X og 1% ged serum i PBS.
      5. Tilsæt 300 µL blokerende løsning til hver brønd og Inkuber i 1 time på RT.
      6. Fjern supernatanten og tilføje 200 µL pr. brønd af et anti-PECAM-1 (CD31) antistof (1:200) i 5% BSA, 1% ged serum i PBS og inkuberes ved 4 ° C natten over.
      7. Udføre 3 vaske trin ved tilsætning af 1 mL PBS pr. brønd og fjerne supernatanten efter 5 min på RT i hvert trin.
      8. Forberede en sekundær antistof løsning indeholdende Cy3-konjugerede anti-rotte IgG antistof (1: 500) i 1% BSA og PBS. Tilsæt 300 µL pr. brønd sekundær antistof-opløsning og inkuberes i 1 h i RT i mørke.
      9. Udføre 3 vaske trin ved tilsætning af 1 mL PBS pr. brønd og fjerne supernatanten efter 5 min på RT i hvert trin.
    3. Tag runde glas coverslips omhyggeligt med pincet og overføre det til en mikroskopi dias. Tilføje en passende mængde montering medium indeholdende DAPI på cellelag og forsigtigt sætte et cover glas på det (Se vedlagte Tabel af materialer).
    4. Observere celler med en passende fluorescens mikroskop udstyret med en fluorescens lyskilde (120 W) og to filtrere sæt: en excitation/emission filter sæt med 550/25 nm og 605/70 nm bølgelængder at opdage Cy3 540/562 nm.
    5. Bruge et andet filter sæt med en excitation/emission boelgelaengden 365/50 nm og 445/50 nm at opdage DAPI 350/440 nm. Bruge 40 x forstørrelse og 80% intensitet af 14,5 mW/cm2 for DAPI med en erhvervelse varighed af 30 ms. til påvisning af Cy3 bruger 80% af 67,5 mW/cm2 med en erhvervelse varighed af 60 ms.
  3. Udføre kvantitativ PCR.
    1. Isolering af mRNA.
      1. Følge standard procedurer ved hjælp af en syre guanidinium kaliumthiocyanat-phenol (AGTP) reagens for at isolere mRNA. Bruge et minimum af 0,5 x 106 celler fra CD45- CD31- (Se trin 3.6.8), CD45- CD31+ (Se trin 3.6.9.) fraktioner og dyrkede primære murine MMEC (4.1.3)
      2. Centrifuge cellesuspension i 10 minutter ved 300 x g ved 20 ° C. Tag supernatanten helt. Resuspenderes celle i 500 µL af AGTP reagens og overførsel cellesuspension ind i et 2 mL reaktion rør. Inkuber i 5 min på RT.
      3. Tilsæt 100 µL chloroform og rystes kraftigt for 15 s. Incubate for 3 min på RT.
      4. Centrifuge suspension for 15 min på 12.000 x g ved 4 ° C.
      5. Tage den øverste vandfasen (der indeholder RNA) omhyggeligt og overføres til en 1,5 mL reaktion tube. Tilsæt 250 µL af isopropanol og inkuberes i 10 min. ved RT.
      6. Udføre en centrifugering skridt på 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
      7. Tage supernatanten og tilsættes 1 mL af 75% ethanol omhyggeligt. Der centrifugeres ved 7.500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
        Bemærk: Pellet er let at miste.
      8. Fjern supernatanten helt. Lad pellet tørre på luft i 5-10 min.
        Bemærk: ethanol skal fjernes men må ikke tørre for meget.
      9. Opløse pellet i 30 µL diethylpyrocarbonate behandlet vand indeholdende i og varme i 10 min. ved 55 ° C.
        Bemærk: RNA koncentration og renhed kan måles ved en spektral-fotometer.
    2. Udføre cDNA syntese (reverse transkriptase PCR).
      1. Forberede en mastermix indeholdende: 10 µL PCR buffer (5 x), 2,5 µL desoxyribonucleosid-trifosfat (dNTP (10 mM)), 0,5 µL tilfældig blanding af enkeltstrenget primer (0,2 µg / µL), 1 µL af RNase inhibitor (40 U / µL, 0,4 reverse transkriptase (200 U/µL) og 5,6 µL af diethylpyrocarbonat behandlet vand (Se vedlagte tabel af materialer).
      2. Fortynd 500 ng RNA i 30 µL diethylpyrocarbonate behandlet vand i 0,2 mL PCR rør og tilføje den hele 20 µL mastermix.
      3. Bruge en PCR cycler udfører efter trin: 10 min. 25 ° C, 30 min. 50 ° C, 5 min 85 ° C og hold ved 4 ° C.
  4. Udføre kvantitativ PCR (qPCR).
    Bemærk: Udføre qPCR prøver i dubletter eller tre.
  5. Bruge primer med to forskellige fluorescens farvestoffer. Primer med en absorption af 495 nm og en emission af 517 nm for gen af interesse.
  6. Til påvisning af satellit celler markør Gen-ekspression, bruger primere for parret boks protein 7 (Pax7) og M-cadherin (Cdh15) (Se vedlagte Tabel af materialer).
  7. For registrering i endothelial celle markør Gen-ekspression, bruger primere for claudin-5 (Cld5), at occludin (Ocln) og zonula occludens-1 (Tjp1 eller ZO1) (Se vedlagte tabel af materialer).
  8. Som reference genet for 18s rRNA, bruge en primer med absorption af 538 nm og en emission af 554 nm bølgelængde.
  9. Forberede en qPCR mastermix for hvert gen af interesse med den respektive primer. Mastermix indeholder: 10 µl qPCR buffer (2 x), 1 µL af Primer for gen af interesse (10 µM), 1 µL af Primer for 18s rRNA og 4 µL af nukleasen frit vand.
  10. Tilføje 16 µL af mastermix til et enkelt godt af en 96-brønd reaktion plade. Tilføj 4 µL cDNA (fremstillet af trin 5.3.2.) pr. godt indeholdende mastermix.
  11. Bruge en real-time PCR cycler udfører efter trin: holding scenen med 50 ° C i 2 min. og 95 ° C i 10 min. cykling scenen med 40 cyklusser på 95 ° C 15 s og 60 ° C i 1 minut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En dag efter isolation, primære murine MMEC og resterende andre celler danner konglomerater og overholde bunden af kultur retter (figur 1A dag 1). Fra dag 7, kan fladt og langstrakt celler observeres. Men forurening af andre, for det meste klumpformet celler, er stadig synlige (figur 1A dag 7). Således, en anden cyklus af CD31 positive valg via MCS er påkrævet. Herefter primære murine MMEC formere sig til en tæthed på ca 80-90%. Ved sammenløbet udgør de typisk en ikke-overlappende éncellelag langs justerede celler (figur 1A dag 14). Spredning stopper ved sammenløbet på grund af kontakt-inhibering. Efter 14 dage om 5-10 x 105 celler kan bruges til yderligere undersøgelser.

Kvalitetskontrol via flowcytometri ved hjælp af fixable levedygtighed farvestoffet FVD780 (til at pletten for døde celler), PECAM1 (CD31) og PTPRC (CD45, som markør for celler af hæmatopoietisk oprindelse) viste værdier for både rentabilitet og renhed lige omkring 70% hver for celler umiddelbart efter isolation (figur 2A). Celler dyrkes efter en anden CD31 positive valg via MCS, viste opfylder værdier for renhed samt levedygtighed spænder op til 95% hver (figur 2B).

For at vurdere rigtigheden af udvælgelsen blev trin, opnået celler yderligere undersøgt for genekspression af muskel satellit celle markør gener parrede boks protein 7 (Pax7) og M-cadherin (Cdh15) på mRNA niveau af kvantitativ PCR (qPCR). Primære murine MMEC (pmMMEC) og differentieret primære murine muskelceller (pmMC) blev brugt som negativ og positiv kontrol, henholdsvis. Murine muskelceller var kommercielt købt. Som forventet, kun CD45- CD31- del samt pmMC udtryk Pax7 og Cdh15, hvorimod CD45- CD31+ og den primære murint MMEC blev negativ for disse markører (figur 2 c).

EF afledt af kapillærerne i endomysium i skeletmuskulaturen express tight junction proteiner 4,5. Ved hjælp af qPCR, udtryk for claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) og zonula occludens-1 (Tjp1 eller ZO1) af sammenflydende primære murine MMEC efter den anden CD31 MCS blev skridt evalueret. PmMC blev brugt som kontrolelementer (figur 2D). Primære murine MMEC udtrykt høje niveauer af Cld5, Ocln og Tjp1, mens pmMC kun vise lav udtryk for Tjp1. Desuden bekræftede immunofluorescens farvning som kvalitetskontrol overflade udtryk i endotelet-specifikke markør PECAM1 i primære murine MMEC (figur 2E).

Figure 1
Figur 1: morfologi af primære murine MMEC. (A) repræsentativt billede af kulturperler primære murine MMEC af fase kontrast mikroskopi fra dag 1 til 14. D1 = dag 1, d7 = dag 7, d14 = dag 14. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: kvalitetskontrol af primære murine MMEC. Gating strategi for flow cytometric analyse af primære murine MMEC umiddelbart efter isolation (A) og på dag 15 (B) ved hjælp af (I) FSC/SSC, (II) FVD780 og (III) CD45, (IIIb) CD31 (stiplede linjer = isotype kontrol). (C) udtryk niveau af Pax7 og M-Cadherin (Cdh15) i CD45- CD31-, CD45- CD31+ brøker efter MCS isolation samt som primære murine MMEC (pmMMEC) og primære murine muskelceller (pmMC ). Udtrykket niveauer er vist som ΔCt værdier (prøve - 18S rRNA), n.d. = ikke bestemmes. (D) udtryk niveau af stram vejkryds proteiner claudin-5 (Cldn5), occludin (Ocln) eller zonula occludens-1 (Tjp1 eller ZO-1) af pmMMEC og pmMC, vist som ΔCt værdier. (E) immunofluorescens farvning for PECAM1 (rød) i dyrkede primære murine MMEC 24 h efter anden CD31 positive valg. Nukleare farvning med DAPI-holdige (blå) montering medium; venstre = anti-PECAM1/DAPI, højre: negativ kontrol/DAPI. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrovaskulære endotelceller give barriere funktioner i alle væv og deres dysfunktion resulterer i sygdom af tilknyttede organer 3. Desuden, orgel-specifikke undersøgelser af mikrovaskulære EF kunne bane vejen for nye terapeutiske strategier. En dybere forståelse af mikrovaskulære EF funktion under fysiologiske og patofysiologiske forhold er derfor af stor videnskabelig interesse. Graduering af leukocyt/endotelet interaktion bruges med succes til behandling af multipel sklerose patienter med natalizumab, et antistof, som forhindrer lymfocyt vedhæftning og derved transmigration 6. Forskellige myopatier herunder de inflammatoriske undertyper stadig forblive dog kun dårligt behandlelige til dato. Derfor, udredning af EF ejendomme specifikt i skeletmuskulatur endotelet kunne bidrage til at udvide tilgængelige behandlinger til resultatet i romanen terapeutiske tilgange eller myopathy.

Udødeliggjort endotel cellelinjer (IECL) er blevet etableret og brugt til flere in vitro-modeller. Disse cellelinjer har nogle fordele i forhold til primære mikrovaskulære EF på grund af immortalization og hurtig spredning. Endvidere, primære kulturperler celler kan gennemgå gulne og miste eller ændre deres morfologi eller fysiologiske funktion efter nogle tid eller passager. Men IECL kun opretholde nogle endotel celleegenskaber og kan ikke ligne sorten i forskellige orgel-bårne primære mikrovaskulære EF. Af note, er de sjældent afledt af skeletmuskulatur. Til dato, beskriver kun en enkelt publikation et menneskelig skelet mikrovaskulære endotel cellelinie opkaldt TSM15 5. Derimod murine mikrovaskulære EF har ikke været beskrevet indtil nu. Endelig, primærelementer fra transgene dyr giver mulighed for at studere genetiske modifikationer i vitro. Primære cellekulturer hold dog også visse faldgruber. Først, forurening med celler af nogen interesse kan interferere med gyldigheden af eksperimentelle resultater. Derfor, nøjagtigheden af flere udvalg skridt og en høj renhed af isolerede celler skal garanteres. Cellesuspension efter dissociation af muskelvæv indeholder erytrocytter og forskellige mononukleære celletyper såsom immunceller, satellit celler, pericytes, fibroblaster og endotelceller 7. Derfor, celle fraktioner efter CD31 MCS skridt blev testet for markører udelukkende udtrykt af muskelceller satellit. Som forventet CD45- CD31- fraktion og primære muskelceller viste Pax-7 og Cdh15 udtryk, der henviser til CD45- CD31+ og dyrkede primære murint MMEC blev negativ for disse markører efter en anden CD31 MCS trin. Desuden er en kvalitetskontrol af isolerede eller kulturperler celler uundgåeligt at sikre pålidelige og reproducerbare eksperimenter. Der findes flere metoder til kontrol med kvaliteten af primære murine MMEC: Udover mikroskopi af morfologiske egenskaber, flow flowcytometri, PCR og immunfluorescens stainings for karakteristiske EF markører (f.eks. CD31, Sca-1) kan bruges. Renhed vurdering af frisk isolerede primære murine MMEC var kun omkring 60-70%, mens en levedygtighed på omkring 70% kan påvises. Mikroskopi af disse celler viser delvist cellen konglomerater, der kunne bestå af kontaminerende celler såsom fibroblaster eller pericytes knyttet til EF. Efter 7 dage kan primært flad og aflang celler og klumpformet celler observeres. Men to CD31 MCS passager resulterede i høj rentabilitet og renhed. Alternative tilgange til at øge renhed, såsom puromycin-holdige medier mislykkedes i primære murine MMEC samtidig være effektiv i murine hjerne mikrovaskulære EF 8.

Da mikrovaskulære EF stammer fra kapillærerne express tight junction proteiner, Gen-ekspression af Cld5, Ocln og Tjp1 i primære murine MMEC sammenlignet med differentierede muskelceller blev undersøgt. Som forventet blev alle tight junction molekyler fundet i primære murine MMEC. I sammenligning vist muskelceller kun lave udtryk for Tjp1, ikke udtryk for Cld5 og Ocln kan fastlægges. Lignende udtryk mønstre var tidligere påvist i hele murine skeletmuskulatur. Her, kunne et udtryk på gen- og protein niveau påvises for Tjp1 , men ikke for occludin 9. Yderligere kan funktionelle funktioner som transendothelial modstand måles.

Den heri beskrevne protokol har kun isolation af mikrovaskulære EF fra murine muskelvæv. Det kan imidlertid overføres til forskellige andre arter som for eksempel en lignende protokol blev offentliggjort for rotte mikrovaskulære EF stammer fra epididymis fedtpuder. Her, blev CD31 positive valg via MCS forudgået af tæthed gradient centrifugering 10. Lignende metoder var vellykket makrovaskulære EF isoleret fra rotte femoralis arterier 11. En nyligt offentliggjort metode til at isolere mikrovaskulære EF af hjerte og lunge væv bruger CD31 og endoglin (CD105) som antigener for magnetisk celle sortering 12. Dog kunne renheden af EF ikke yderligere øges ved hjælp af yderligere CD105 magnetisk bead adskillelse. En anden mulighed for at isolere og rense primære murine MMEC er flerfarvet fluorescens aktiveret celle sortering (FACS). En særskilt population af Sca-1+, CD31+, CD34dim og CD45- celler fra murine muskler kan isoleres og blev karakteriseret som primære murine MMEC 13. En fordel ved denne metode er en ren EF befolkning, som direkte kan anvendes eller kulturperler for yderligere eksperimenter (Bemærk, at i vores erfaring FACS fører til øget celledød skyldes højere cell stress). Yderligere, døde celler eller konglomerater af forskellige celletyper kan reducere de isolerede celle numre af FACS. Derudover er det rapporteret, at primære murine MMEC isoleret af FACS var forgæves kulturperler ved almindeligt anvendte kultur 21% O2 og 5% CO2. Her, måtte iltindholdet justeres til 5% for en tilstrækkelig dyrkning 13. Derudover FACS teknik er mere komplekse, tidskrævende og de infrastrukturelle forudsætninger er dyre.

Musculus quadriceps femoris og musculus triceps surae af mandlige mus i en alder af 4-12 uger er mest egnet til dyrkning af primære murine MEC, da de er let tilgængelige og stor nok til isolation af tilstrækkelig celle numre (5-10 x 105 per gram muskel). Derfor skal det sikres, at betingelserne er sammenlignelige i uafhængige forsøg. Som beskrevet ovenfor, kan primærelementer gennemgå ældning. Derfor, bruge celler for respektive eksperimenter straks i lavere passager. Efter passage 8 – 10 primære murine MMEC ændre deres morfologi, demonstrere langsomme spredning priser og mister deres kontakt hæmning som tegn for dedifferentiation og ældning.

Der er yderligere nogle noter til fejlfinding i forbindelse med denne protokol. Sterile arbejde er afgørende for at undgå kontaminering. Kvalitetskontrol er nødvendige for at overvåge renhed og levedygtighed af isolerede celler. Anvendte materialer i denne protokol skal opbevares og anvendes ifølge producentens anvisninger. Yderligere, alder og køn af anvendte dyr samt forskellige muskelgrupper, som kan påvirke kvaliteten og sammenligneligheden af isolerede celler i eksperimenter.

Den beskrevne protokol bør betragtes som platform metode til at isolere primære mikrovaskulære EF af skeletmuskulatur. Isolerede celler kan bruges til flere programmer for at få yderligere indblik i blod-muskel-barriere funktion. Celler er velegnet til både protein og RNA udtryk undersøgelser såvel som funktionelle assays (herunder transmigration og vedhæftning undersøgelser). Men denne protokol var optimeret til undersøgelser med fokus på inflammatoriske processer og dermed mindre ændringer kan være nødvendigt med hensyn til forskellige forskningsområder.

Til model komplekse rumlige og funktionelle cellulære samspillet inden for MVU, kan primære murine MMEC dyrkes i mere komplekse 3D celle kultur systemer sammen med andre celletyper. Fremadrettet, bør det også være muligt at generere MVU organoids, som det er blevet beskrevet for andre væv inden 14. Vellykket dyrkning af primære murine MMEC er imidlertid uundgåeligt for sigter denne næste skridt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af "anden Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 til TR), "Innovative Medizinische Forschung (IMF) Münster" (I-RU211811 til TR) og tyske Research Foundation (DFG, INST 2105/27-1, mig 3283/5-1, og mig 3283/6-1 til SGM). Illustreret billeder leveres af Heike Blum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Tags

Neurovidenskab sag 145 celle isolation murine mikrovaskulære endotelceller skeletmuskulatur celler blod muskel barriere myovascular enhed myopathy
Isolering af primære Murine skeletmuskulatur mikrovaskulære Endothelial Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müntefering, T., Michels, A. P. … More

Müntefering, T., Michels, A. P. E., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter