Isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo scheletrico

Summary

Cellule endoteliali microvascolari dei muscoli scheletrici (MMEC) forma la parete interna dei vasi capillari del muscolo e regolano entrambi, scambio di fluidi/molecole e migrazione delle cellule (immuni) tra sangue e tessuto muscolare. Isolamento di MMEC murino primario, come descritto qui, consente indagini complete in vitro del "unità myovascular".

Abstract

Le cellule endoteliali dei capillari del muscolo scheletrico (muscolo cellule endoteliali microvascolari, MMEC) costruire la barriera tra sangue e nei muscoli scheletrici che regolano lo scambio di fluidi e sostanze nutrienti, nonché la risposta immunitaria contro infettive agenti di controllo della migrazione delle cellule immuni. Per queste funzioni, MMEC formano un funzionale "unità myovascular" (MVU), con altri tipi di cellule, come fibroblasti, periciti e cellule muscolari scheletriche. Di conseguenza, una disfunzione di MMEC e di conseguenza il MVU contribuisce a una vasta varietà di miopatie. Tuttavia, meccanismi regolatori di MMEC nella salute e nella malattia rimangono insufficientemente capiti e loro delucidazione precede trattamenti più specifici per miopatie. L'isolamento e l'indagine approfondita delle funzioni primarie di MMEC nel contesto del MVU potrebbe agevolare una migliore comprensione di questi processi.

Questo articolo fornisce un protocollo per isolare MMEC murino primario del muscolo scheletrico di dissociazione meccaniche ed enzimatiche, tra cui purificazione e operazioni di manutenzione di cultura.

Introduction

Organi, cellule e via flusso sanguigno sono forniti con ossigeno, substrati e altre molecole necessarie. Questo interscambio avviene nei capillari, i vasi più piccoli. I capillari sono formati da uno strato interno delle cellule endoteliali (CE) cui integrità rimane un prerequisito per il successo regolazione dell'omeostasi del muscolo tra lo spazio intravascolare e interstiziale. Per garantire una transizione selettiva di cellule e fattori solubili, CE costituiscono un monostrato collegati tra loro da stretti e adherens junctions ¹. Oltre il suo ruolo come barriera per le sostanze nutrienti o prodotti metabolici, CE regolano il reclutamento dei leucociti nei processi infiammatori. Infiammazione o tessuto danno conduce ad un su-regolamento delle molecole di adesione sulla superficie CE e la produzione di chemochine facilitare l'attaccamento del leucocita e trasmigrazione nei tessuti target ². Di conseguenza, CE criticamente sono coinvolti nella regolazione dei processi infiammatori quali la difesa contro gli agenti patogeni o riparazione dei tessuti.

Una disfunzione della CE è direttamente connesso con le malattie vascolari, insufficienza renale cronica, trombosi venosa grave patogeno infezioni. Inoltre, CE sono praticamente sempre coinvolti nell'autoimmunità organo-specifiche come diabete mellito o sclerosi multipla ³. La funzione di barriera tra sangue e organi è quindi controllata da un'interazione concertata dei diversi tipi di cellule. Nel muscolo scheletrico cellule endoteliali microvascolari (MMEC) insieme alle cellule muscolari, fibroblasti e periciti formano un'unità funzionale, l'unità di"myovascular" (MVU). Pertanto, una disfunzione del MVU possa giocare un ruolo critico nella fisiopatologia delle miopatie. Tuttavia, una più profonda comprensione di questi meccanismi regolatori è ancora manca e attualmente preclude l'identificazione di bersagli di nuovi, urgente, terapeutici in miopatie.

Per studiare i complessi meccanismi fisiologici e fisiopatologici, modelli animali sono comunemente usati. Tuttavia, in vitro modelli offrono il vantaggio di concentrarsi sull'argomento di interesse escludendo una varietà di fattori di confondimento. Per studiare processi in vitro è necessario isolare cellule primarie pure e vitale. In contrasto con linee cellulari, cellule primarie isolate da animali transgenici permettono di studiare le conseguenze delle modificazioni genetiche in vitro.

Qui, un metodo per isolare MMEC murino primario è descritto mediante dissociazione meccanica ed enzimatica, seguita da magnetico cella attivato ordinamento tecniche (MCS) per la purificazione. Per questo scopo, vengono utilizzati biglie magnetiche contro specifici marcatori di superficie. Piastrinica endoteliale delle cellule adesione molecule-1 (PECAM1, CD31) è espresso principalmente su CE e può essere utilizzato per arricchire questo tipo di cella. Nell'ottica di garantire purezza elevata delle cellule, cellule di origine ematopoietica sono esclusi da una selezione negativa per proteina tirosina fosfatasi recettore di tipo C (PTPRC, CD45). Inoltre, controlli di qualità, la coltivazione di primaria MMEC murino, potenziali applicazioni e limitazioni, nonché considerazioni speciali sono presentati.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalle autorità locali e condotto secondo la legge tedesca sul benessere degli animali (84-02.05.20.13.097).

1. osservazioni sugli esperimenti sugli animali

1. Eseguire tutti gli esperimenti del mouse conformemente agli orientamenti della rispettiva cura animale istituzionale e utilizzare il comitato.
2. Tenere topi in condizioni standardizzate e secondo linee guida internazionali come la Federazione per Laboratory Animal Science associazioni (FELASA).
   Nota: In generale questa tecnica di isolamento può essere utilizzata per topi indipendenti da età, sesso o background genetico. Per ottenere un numero sufficiente di cellule, settimana 4 – 10 vecchio maschi sono comodo, perché proprietà biologiche possono variare con l'età e genere.

2. preparazione delle soluzioni, dei Media e rivestimento

1. Preparare la soluzione di digestione (DS) miscelando 2,2 mL di Dulbecco´s per volta Eagle Medium (DMEM) con 200 μL Collagenase Dispase e 45 μL Desoxyribonuclease (DNasi).
2. Preparare 500 mL di medium di cellule endoteliali (ECM) con 450 mL di DMEM con 50 mL di FCS (10% circa), bFGF di fattore di crescita di base del fibroblasto di 0,25 mL (20 µ g/mL; circa lo 0,05%) e 5 mL di penicillina-streptomicina (1% circa). Eseguire la filtrazione sterile in un tubo di vetro (diametro dei pori del filtro: 0,2 μm). In seguito conservare la soluzione a 4 ° C.
3. Cappotto, piastre per colture cellulari come descritto di seguito.
   1. Per coltura di copertura MEC primaria recente isolata murino tutta la superficie con 1 mL per pozzetto di un 6 cell ben piastra di coltura con una soluzione di rivestimento di gelatina base velocità (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore per 3 – 5 min a camera temperatura (RT).
   2. Aspirare e scartare la soluzione di rivestimento. Sciacquare ogni pozzetto con 2 mL sterile tamponato fosfato salino (PBS), pH 7.1-7.5 in due lavaggi consecutivi.
   3. Aspirare e scartare PBS. Riempire i pozzetti con volume di 1 mL di ECM.

3. isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo (MMEC)

1. Eutanasia di un adulto 4 – 12 settimane vecchio, maschio mouse da dislocazione cervicale senza alcuna anestesia. L'obiettivo è quello di separare rapidamente il midollo spinale dal cervello in modo da fornire l'animale con una morte veloce e indolore.
2. Tagliare le estremità.
   1. Utilizzare un chirurgico sharp/blunt (tagliente 42mm, dritto) e punte acute (tagliente 23 mm, dritto) forbice, un dritto (seghettata, 2 x 1,25 mm x 12 cm) e una curve (Seghettato, 1.3 x 1 x 13cm) forcipe.
   2. Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici con etanolo al 70%.
   3. Posizionare l'animale sul dorso, inumidire le gambe con etanolo al 70%. Recidere l'intera gamba tagliando all'articolazione dell'anca con la forbice chirurgica sharp smusse. Posizionare l'estremità in una piastra di coltura di cellule chiuse (35 x 10 mm).
      Nota: Da ora in poi eseguire ogni passaggio sotto cappa a flusso laminare sterile e lavorare con strumenti sterilizzati.
3. Isolare il tessuto muscolare (utilizzare preferenzialmente il quadriceps di musculus femorale o musculus tricipite surale da entrambe le gambe).
   1. Tagliare la pelle aperta dall'anca alla punta-punta utilizzando una forbice di punte acute e pinzetta. Tenere la punta o il grassatore con il forcipe dritto. Togliere la pelle con il forcipe curvo dalla punta del piede all'anca.
   2. Isolare il quadriceps di musculus femorale tagliando il tendine dal ginocchio e recidere il muscolo lungo il femore all'anca. Isolare il musculus tricipite surale da recidere il tendine di Achille. In seguito, tagliare lungo la tibia al fossa popliteal e rimuovere il muscolo.
      Nota: Se grandi vasi (a. femoralis, a. tibiale posteriore, a. tibiale anteriore, muscolo peroneo a.) sono visibili nei muscoli isolati, rimuovere i vasi per evitare la contaminazione da endotelio macrovascular.
   3. Per rimuovere grandi vasi, tenere la parte del muscolo non contenenti grandi vasi con una pinzetta e tagliarlo accanto alla nave. Per questo protocollo, si consiglia 1 g o meno tessuto muscolare uguale a sia del quadricipite femorale e tricipite surale .
   4. Aggiungere 2.445 µ l DS (dal passaggio 2.1) per una piastra di coltura delle cellule (35 x 10 mm) e determinare il peso.
   5. Trasferire tutti i pezzi di muscolo per questo piatto di coltura cellulare contenente il 2445 µ l DS e determinare il peso. La differenza di entrambi i valori misurati fornisce il peso a secco del tessuto muscolare che non deve superare 1 g.
   6. Tagliare il tessuto di muscolo intero in piccoli pezzi (cubetti di ≤ 2 mm, circa 100 pezzi) utilizzando la forbice di punte acute.
4. Dissociare il tessuto muscolare.
   Nota: questo passaggio dura circa 120 min.
   1. Archivio del muscolo/DS sospensione a 37 ° C (incubatore con 5% CO₂) per 1,5 h. mescolare la sospensione attentamente ogni 20 min per circa 5 minuti utilizzando una siringa da insulina 1 mL.
   2. Trasferire la sospensione a 70 μm in nylon cella colino inserito su un tubo da 50 mL e raccogliere il flusso attraverso. Lavare il filtro cella con 8 mL di DMEM e raccogliere il flusso attraverso.
   3. Scartare la sospensione cellulare colino e centrifugare per 10 minuti a 300 x g a 20 ° C. Rimuovere con cautela il surnatante.
      Attenzione: pellet è facile perdere.
   4. Risospendere le cellule in 1 mL di un tampone lisante ammonio-cloruro-potassio (ACK) (Vedi allegato Tabella materiali) per la lisi dei globuli rossi ed incubare per 30 s a RT. aggiungere 9 mL DMEM + 10% FCS per interrompere la sospensione cellulare di reazione e trasferimento a t 15 mL Ube.
5. Impoveriscono CD45⁺ cellule seguendo le istruzioni del produttore microsfere CD45. Per tutte le fasi successive di CD45⁺ svuotamento utilizzare buffer di MCS (Vedi allegato tabella materiali).
   Nota: questo passaggio dura circa 60 minuti.
   1. Determinare i numeri di cellulare utilizzando una cella Neubauer camera di conteggio (si aspettano circa 5 x 10⁶ cellule per tessuto muscolare g).
   2. Sospensione di centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Togliere completamente supernatante e risospendere il pellet cellulare in 90 µ l di tampone MCS (al 10⁷ cellule o meno). Aggiungere 10 μL di microperle CD45 (al 10⁷ cellule o meno).
   3. Mescolare la sospensione cellulare e incubare per 15 min in frigo a 4 – 8 ° C.
   4. Aggiungere 1mL di tampone MCS (al 10⁷ cellule o meno). Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere completamente il surnatante e risospendere le cellule in buffer di MCS 500 μL.
   5. Per la separazione magnetica delle cellule è possibile utilizzare una grande colonna magnetica (LMC) con un volume di serbatoio di 8 mL e una capacità di fino a 2 x 10⁹ cellule totali. Posizionare la LMC nel campo magnetico del separatore.
   6. Sciacquare con 3 mL di tampone MCS nel serbatoio di LMC. Dopo il risciacquo, posizionare un tubo conico da 15 mL sotto la colonna per raccogliere il flusso attraverso. Applicare la sospensione di cellule intere (500 µ l) sulla colonna e lasciarlo completamente flusso.
   7. Lavare la colonna tre volte con l'aggiunta di 3 mL di tampone MCS nel serbatoio e attendere fino a quando il serbatoio di column´s è vuoto prima di eseguire la successiva fase di lavaggio.
   8. Raccogliere le cellule senza etichetta passando la colonna utilizzano per ulteriori operazioni di separazione (che rappresenta il CD45 frazione^– ). Etichettati cellule (che rappresenta il CD45⁺ frazione) accumulati nella colonna può essere scartata.
6. Si accumulano CD31⁺ cellule seguenti CD31 microsfere dal produttore. Per tutte le fasi successive di CD31⁺ accumulo utilizzare buffer di MCS.
   Nota: questo passaggio dura circa 60 minuti.
   1. Determinare il numero di cellulare utilizzando una cella Neubauer camera di conteggio (si aspettano circa 4 x 10⁶ cellule per tessuto muscolare g).
   2. Centrifuga ottenuto sospensione cellulare senza etichetta passaggio 3.5 per 10 min a 300 x g a 4 ° C.
   3. Rimuovere completamente il surnatante. Risospendere il pellet in 90 μL MCS tampone e aggiungere 10 μL di microperle CD31 (al 10⁷ cellule totali o meno). Mescolare la sospensione intera e incubare per 15 minuti in frigorifero a 4 – 8 ° C.
   4. Aggiungere 1mL di tampone di MCS e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Decollare il supernatante e risospendere le cellule in 500 µ l di tampone MCS.
   5. Per la separazione magnetica delle cellule è possibile utilizzare una colonna magnetica media (MMC) con un volume di serbatoio di 3,5 mL ed una capacità di fino a 2 x 10⁸ cellule totali.
   6. Posizionare la console MMC nel campo magnetico del separatore. Sciacquare la MMC con 500 µ l di tampone MCS. Dopo il risciacquo, posizionare un tubo conico da 15 mL sotto la colonna per raccogliere il flusso attraverso.
   7. Applicare la sospensione di cellule intere (500 µ l) sulla colonna e lasciarlo completamente flusso.
   8. Lavare la colonna tre volte aggiungendo 500 µ l di tampone MCS e attendere che il serbatoio della colonna è vuota prima di eseguire la successiva fase di lavaggio. Passando la colonna senza etichetta di cellule rappresenta il CD45^– CD31 frazione^– . Conservarli per ulteriori controlli di qualità.
   9. Rimuovere il separatore di colonna e posizionarlo su un tubo di raccolta idoneo (tubo da 15 mL). Pipettare 2 mL MCS di tampone sulla colonna. Sciacquare immediatamente le cellule magneticamente con etichetta premendo saldamente lo stantuffo nella colonna. Questo CD45^– CD31⁺ frazione rappresenta arricchito CE murino primario.
   10. Sospensione cellulare centrifuga per 5 min a 350 x g a 20 ° C. Rimuovere completamente il surnatante e risospendere le cellule (si aspettano circa 0,6 x 10⁶ cellule per tessuto muscolare g) in 1 ECM (v. punto 2.2). Trasferimento (0,5 – 0,7 x 10⁶ cellule) in un unico pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti rivestiti (dal punto 2.3) contenente 1 mL di ECM.
7. Per la coltivazione, incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO₂ in un'incubatrice sterile. Aggiornare l'ECM ogni due o tre giorni.

4. primaria murino MMEC purificazione

1. Eseguire un secondo ciclo di CD31⁺ accumulo, seguendo le istruzioni del produttore (CD31 microsfere del mouse protocollo; Vedi punto 3.6.).
   1. Staccare le cellule con soluzione di tripsina/EDTA quando si trovano alla confluenza di 80 – 90% (in genere dopo 7 giorni). Per questo, sciacquare ogni pozzetto con 2 mL di PBS sterile, in due lavaggi consecutivi. Utilizzare 800 μL di soluzione di tripsina/EDTA per 6-pozzetto e incubare a 37 ° C e 5% di CO₂ in un'incubatrice sterile per 3 – 5 min Stop attività enzimatica utilizzando 1200 μL DMEM contenente un minimo di 10% FCS.
   2. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 350 x g a 20 ° C.
   3. Eseguire il secondo passaggio di CD31-MCS per aumentare la purezza (secondo le istruzioni del produttore di microsfere CD31; Vedi 3.6.).
   4. Osservare la cellula confluenza via campo luminoso o standard di contrasto di fase microscopia utilizzando un
      20 x ingrandimento e apertura numerica 0,35 lente. Vedere la Figura 1.
      Nota: Le cellule possono essere utilizzate per esperimenti di rispettivi o tenute in coltura di passaggio. Utilizzare le cellule per esperimenti prontamente in passaggi più bassi. Non è consigliabile utilizzare cellule dopo passaggio
      8 – 10.

5. controllo di qualità

1. Eseguire citometria a flusso di MMEC murino primario dopo il secondo CD31-MCS-passo.
   1. Preparare una provetta di FACS aggiungendo 1 mL di tampone di flusso cytometry (FC) (Vedi allegato Tabella materiali).
   2. Staccare le cellule con soluzione di tripsina/EDTA quando sono al 100% confluenza (solitamente dopo i 14 giorni). Per questo, sciacquare ogni pozzetto con 2 mL di PBS sterile, in due lavaggi consecutivi. Utilizzare 800 μL di soluzione di tripsina/EDTA per 6-pozzetto e incubare a 37 ° C e 5% di CO₂ in un'incubatrice sterile per 3 – 5 min Stop attività enzimatica utilizzando 1200 μL DMEM contenente 10% FCS.
   3. Determinare il numero di cellulare utilizzando un Neubauer camera di conta cellulare e aggiungere un minimo di 1 x 10⁵ celle al tubo FACS preparato.
   4. Sospensione di cellule di centrifugare per 10 minuti a 300 x g a 4 ° C. Eseguire due passaggi del lavaggio rimuovendo il sovranatante, risospendere le cellule in 1 mL FC di tampone e centrifugazione per 10 min a 300 x g a 4 ° C.
   5. Preparare una miscela di colorazione aggiungendo anti-mouse anticorpo CD31-FITC (1: 100) e anti-CD45-PE (1: 100) con buffer di FC.
   6. Risospendere le cellule in 100 μL di macchiatura mix nei tubi FACS. Incubare per 30 min a 4 ° C. Aggiungere 1 mL di tampone FC. Sospensione cellulare centrifuga per 5 min a 300 x g a 4 ° C. Con attenzione rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 200 μL di tampone di FC.
   7. Celle di misura in un citofluorimetro seguendo la strategia di gating è mostrato nella figura. 2A.
2. In alternativa eseguire immunofluorescenza di MMEC murino primario dopo il secondo CD31-MCS-passo.
   1. Cappotto i coprioggetti.
      1. Trasferire una sterile 13 mm di diametro tondo vetrino coprioggetti in un pozzetto di una piastra ben 24. Vetrino coprioggetti cappotto aggiungendo 300 µ l di soluzione di rivestimento di velocità per pozzetto. Incubare per 3 – 5 min a temperatura ambiente (TA).
      2. Aspirare e scartare la soluzione di rivestimento. Sciacquare ogni pozzetto con 2 mL di PBS sterile in due lavaggi consecutivi. Aspirare e scartare PBS.
      3. Semi 1 x 10⁵ cellule in 1 mL ECM il coprivetrino rivestito e incubare a 37 ° C e 5% di CO₂ in un'incubatrice sterile fino a quando le cellule sono 99% confluenti.
   2. Eseguire la fissazione e colorazione di immunofluorescenza.
      1. Togliere la soluzione ECM di cellule coltivate dal 5.2.1.3.
      2. Difficoltà cellule coltivate con l'aggiunta di 300 µ l 4% paraformaldeide (PFA) con pH 7.4 per pozzetto, per 10 min a 4° C.
         Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.
      3. 3 lavaggio procedere aggiungendo 1 mL di PBS per pozzetto e rimuovere il supernatante dopo 5 minuti a TA.
      4. Preparare un blocco soluzione contenente 5% BSA, 0,2% siero di capra Triton-X e 1% in PBS.
      5. Aggiungere 300 µ l di soluzione bloccante in ogni pozzetto e incubare per 1 h a TA.
      6. Rimuovere il supernatante e aggiungere 200 µ l di anticorpo anti-PECAM-1 (CD31) (1: 200) in 5% BSA, siero di capra 1% in PBS e incubare a 4 ° C durante la notte.
      7. Eseguire 3 fasi di lavaggio aggiungendo 1 mL di PBS per pozzetto e rimuovendo supernatante dopo 5 min a temperatura ambiente in ogni passaggio.
      8. Preparare una soluzione di anticorpo secondario contenente Cy3-coniugati di anticorpo di IgG anti-ratto (1: 500) in 1% BSA e PBS. Aggiungere 300 µ l di soluzione di anticorpo secondario e incubare per 1 h a temperatura ambiente al buio.
      9. Eseguire 3 fasi di lavaggio aggiungendo 1 mL di PBS per pozzetto e rimuovendo supernatante dopo 5 min a temperatura ambiente in ogni passaggio.
   3. Estrarre le lamelle di vetro rotondo con attenzione con il forcipe e trasferirlo in una diapositiva di microscopia. Aggiungere una quantità appropriata di montaggio medio contenente DAPI sullo strato delle cellule e accuratamente messo un vetro di copertura su di esso (vedi allegata Tabella materiali).
   4. Osservare le cellule con un microscopio a fluorescenza equipaggiato con una sorgente di luce di fluorescenza (120 W) e due set di filtro: un filtro di eccitazione/emissione set con 550/25 nm e lunghezze d'onda nm 605/70 per rilevare Cy3 540/562 nm.
   5. Utilizzare un secondo filtro impostato con una lunghezza d'onda di eccitazione/emissione di 365/50 nm e 445/50 nm per rilevare DAPI 350/440 nm. Utilizzare un ingrandimento di 40x e 80% di intensità di 14,5 mW/cm² per DAPI con una durata di acquisizione di 30 ms per il rilevamento di Cy3 80% di 67,5 mW/cm² con una durata di acquisizione di 60 ms.
3. Eseguire PCR quantitativa.
   1. Isolamento di mRNA.
      1. Seguire le procedure standard, utilizzo di un reagente di acido guanidinio tiocianato-fenolo (AGTP) per isolare mRNA. Utilizzare un minimo di 0,5 x 10⁶ celle da CD45^– CD31^– (vedere il passaggio 3.6.8), CD45^– CD31⁺ (v. punto 3.6.9) frazioni e coltivato primario MMEC murino (4.1.3)
      2. Sospensione di cellule di centrifugare per 10 minuti a 300 x g a 20 ° C. Togliere completamente il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l della sospensione di cellule AGTP reagente e trasferimento in una provetta di reazione di 2 mL. Incubare per 5 min a RT.
      3. Aggiungere 100 µ l di cloroformio e agitare energicamente per 15 s. Incubare per 3 minuti a TA.
      4. Sospensione di centrifuga per 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
      5. Decollare il superiore fase acquosa (contenente RNA) con attenzione e trasferire in una provetta di reazione da 1,5 mL. Aggiungere 250 µ l di isopropanolo e incubare per 10 minuti a TA.
      6. Eseguire un passaggio di centrifugazione a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C.
      7. Prendere il sovranatante ed aggiungere 1 mL di etanolo al 75% con attenzione. Centrifuga a 7.500 x g per 5 min a 4 ° C.
         Nota: Il pellet è facile perdere.
      8. Rimuovere completamente il surnatante. Asciugare il pellet in onda per 5 – 10 min.
         Nota: etanolo deve essere rimosso ma non asciugare troppo.
      9. Sciogliere il pellet in 30 µ l Dietilpirocarbonato trattato contenente acqua e calore per 10 minuti a 55 ° C.
         Nota: Purezza e la concentrazione di RNA può essere misurate con uno spettrofotometro.
   2. Eseguire la sintesi del cDNA (reverse transcriptase PCR).
      1. Preparare un mastermix contenente: 10 µ l di tampone di PCR (5x), 2,5 µ l desoxyribonucleosid-trifosfato (dNTP (10 mM)), miscela casuale di 0,5 µ l di primer single-stranded (0,2 µ g / µ l), 1 µ l di inibitore di RNAsi (40 U / µ l, 0,4 reverse transcriptase (200 U / µ l) e 5,6 µ l di diethylpyrocarbonat acqua trattata (Vedi allegato tabella materiali).
      2. Diluire 500 ng RNA in 30 µ l di acqua Dietilpirocarbonato trattato in 0,2 mL PCR tubi e aggiungere l'intero mastermix 20 µ l.
      3. Utilizzare un cycler PCR esecuzione seguendo passi: 10 min 25 ° C, 30 min 50 ° C, 5 min 85 ° C e permanenza a 4 ° C.
4. Eseguire PCR quantitativa (qPCR).
   Nota: Eseguire qPCR di campioni in duplicati o triplici copie.
5. Utilizzare il primer con due differenti fluorescenza coloranti. Primer con un assorbimento di 495 nm e un'emissione di 517 nm per il gene di interesse.
6. Per la rilevazione dell'espressione genica delle cellule satelliti marcatore, utilizzare primer per proteina accoppiati casella 7 (Pax7) e M-cadherin (Cdh15) (Vedi allegato Tabella materiali).
7. Per la rilevazione dell'espressione genica delle cellule endoteliali marcatore, utilizzare primers per claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) e della zonula occludens-1 (Tjp1 o ZO1) (Vedi allegato tabella materiali).
8. Come gene di riferimento per 18s rRNA, utilizzare un primer con assorbimento di 538 nm e un'emissione di lunghezza d'onda di nanometro 554.
9. Preparare un mastermix qPCR per ogni gene di interesse con il rispettivo primer. Mastermix contiene: 10 µ l tampone qPCR (2x), 1 µ l di Primer per il gene di interesse (10 µM), 1 µ l di Primer per 18s rRNA e 4 µ l di nucleasi acqua gratis.
10. Aggiungere 16 µ l del mastermix in un unico pozzetto di una piastra a 96 pozzetti di reazione. Aggiungere 4 µ l di cDNA (ottenuto dal passaggio 5.3.2.) a ben contenente il mastermix.
11. Utilizzare un cycler PCR in tempo reale esecuzione seguendo passi: che tiene il palco con 50 ° C per 2 min e 95 ° C per 10 min. fase di escursioni in bicicletta con 40 cicli di 95 ° C 15 s e 60 ° C per 1 min.

Representative Results

Un giorno dopo l'isolamento, MMEC murino primario e residuo altre cellule formano conglomerati e aderiscano alla parte inferiore di piastre di coltura (Figura 1A giorno 1). Da giorno 7, si possono osservare cellule piatte e allungate. Tuttavia, la contaminazione di altri, principalmente cellule di sferoide, è ancora visibile (Figura 1A giorno 7). Così, un altro ciclo di CD31 positivi selezione tramite MCS è richiesto. Qui di seguito, MMEC murino primario proliferano ad una densità di circa 80 – 90%. Al momento di confluenza in genere formano un monostrato non sovrapposti di cellule allineati longitudinalmente (Figura 1A giornata 14). Proliferazione si arresti al confluenza a causa di inibizione per contatto. Dopo 14 giorni circa 5 – 10 x 10⁵ celle può essere utilizzato per ulteriori indagini.

Controllo qualità tramite flusso cytometry utilizzando risolvibile attuabilità colorante FVD780 (a macchiare per le cellule morte), PECAM1 (CD31) e PTPRC (CD45, come indicatore per le cellule di origine ematopoietica) hanno mostrato i valori sia di redditività e di purezza che vanno circa il 70% per le celle subito dopo l'isolamento (Figura 2A). Le cellule coltivate dopo un altro CD31 selezione positiva tramite MCS, hanno mostrato soddisfare i valori per la purezza per quanto riguarda la redditività che vanno fino a 95% ciascuno (Figura 2B).

Per valutare l'accuratezza della selezione passaggi, ottenute cellule ulteriormente sono stati studiati per l'espressione genica della muscolare delle cellule satelliti marcatore geni associati casella proteina 7 (Pax7) e M-cadherin (Cdh15) il livello di mRNA mediante PCR quantitativa (qPCR). MMEC murino primario (pmMMEC) e cellule di muscolo murino primario differenziato (pmMC) sono state utilizzate come controlli negativi e positivi, rispettivamente. Cellule muscolari murino commercialmente sono state acquistate. Come previsto, solo il CD45^– CD31 frazione^– , come pure il pmMC espresso Pax7 e Cdh15, mentre CD45^– CD31⁺ e il MMEC murino primario erano negativi per questi indicatori (Figura 2).

CE derivato dai capillari nell'endomisio del muscolo scheletrico express stretta della giunzione proteine ^4,5. Utilizzando qPCR, l'espressione del claudin-5 (Cld5), occludina (Ocln) e della zonula occludens-1 (Tjp1 o ZO1) di confluenti MMEC murino primario dopo il MCS CD31 secondo passo è stata valutata. PmMC sono stati utilizzati come controlli (Figura 2D). MMEC murino primario espresso gli alti livelli di Cld5, Ocln e Tjp1, mentre pmMC mostrano solo bassa espressione di Tjp1. Inoltre, immunofluorescenza che macchia come controllo di qualità ha confermato l'espressione di superficie di endotelio specifici marker PECAM1 in MMEC murino primario (Figura 2E).

Figura 1: morfologia del primario murino MMEC. (A) immagine rappresentativa della coltura primaria MMEC murino di microscopia di contrasto di fase da 1 a 14 giorni. D1 = giorno 1, d7 = giorno 7, d14 = giorno 14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: controllo di qualità di primario murino MMEC. Gating strategia per analisi cytometric di flusso di primaria MMEC murino subito dopo l'isolamento (A) e il giorno 15 (B) (I) utilizzando FSC/SSC, (II) FVD780 e CD45 (IIIa), CD31 (IIIb) (linee tratteggiate = isotipo controllo). Espressione (C) livello di Pax7 e M-Cadherin (Cdh15) in CD45^– CD31^-, CD45^– CD31⁺ frazioni dopo isolamento MCS pure come MMEC murino primario (pmMMEC) e cellule di muscolo murino primario (pmMC ). I livelli di espressione vengono visualizzati come valori di_t ΔC (campione - rRNA 18S), n.d. = non determinato. L'espressione (D) livello di giunzione stretta proteine claudin-5 (Cldn5), occludina (Ocln) o zonula occludens-1 (Tjp1 o ZO-1) di pmMMEC e pmMC, indicato come valori di_t ΔC. (E) immunofluorescenza che macchia per PECAM1 (rosso) in coltivato primario murino MMEC 24 h dopo la seconda selezione positiva di CD31. Nucleare colorazione con DAPI-contenenti (blu) mezzo di montaggio; sinistra = anti-PECAM1/DAPI, destra: negativo controllo/DAPI. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Cellule endoteliali microvascolari forniscono funzioni di barriera in tutti i tessuti e i loro risultati di disfunzione nella malattia di organi associati ³. Inoltre, gli studi di organo-specifici di microvascolare CE potrebbero spianare la strada per nuove strategie terapeutiche. Di conseguenza, una più profonda comprensione della funzione microvascolare CE in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche è di grande interesse scientifico. Modulazione dell'interazione leucocita/endotelio è utilizzato con successo per trattare pazienti con sclerosi multipla con natalizumab, un anticorpo che impedisce l'adesione dei linfociti e quindi trasmigrazione ⁶. Tuttavia, miopatie varie tra cui i sottotipi infiammatori ancora rimangono solo scarsamente trattabile fino ad oggi. Di conseguenza, delucidazione delle proprietà CE specificamente nell'endotelio di muscolo scheletrico potrebbe contribuire a espandere i trattamenti disponibili a miopatia o risultato in nuovi approcci terapeutici.

Linee cellulari endoteliali immortalizzate (IECL) sono state stabilite e utilizzate per diversi modelli in vitro. Queste linee cellulari offrono alcuni vantaggi rispetto al primario microvascolari CE a causa di immortalizzazione e proliferazione veloce. Inoltre, cellule in coltura primarie possono subire la senescenza e perdere o cambiare loro morfologia o la funzione fisiologica dopo qualche tempo o passaggi. Tuttavia, IECL solo mantenere alcune proprietà delle cellule endoteliali e non può assomigliare ad la varietà diverse a carico dell'organo CE. microvascolare primario Della nota, raramente sono derivati da muscoli scheletrici. Ad oggi, solo una singola pubblicazione descrive una linea di cellule endoteliali microvascolari scheletrico umano denominata TSM15 ⁵. Al contrario, murino microvascolare CE non sono stati descritti finora. Infine, le cellule primarie da animali transgenici forniscono l'opportunità di studiare le modificazioni genetiche in vitro. Tuttavia, colture cellulari primarie anche tengono certe insidie. In primo luogo, la contaminazione con cellule di nessun interesse può interferire con la validità dei risultati sperimentali. Pertanto, deve essere garantite la precisione delle diverse fasi di selezione e un'elevata purezza delle cellule isolate. Sospensione cellulare dopo dissociazione del tessuto muscolare contiene eritrociti e tipi differenti delle cellule mononucleari come cellule del sistema immunitario, le cellule satelliti, periciti, fibroblasti e cellule endoteliali ⁷. Pertanto, frazioni cellulari dopo il passaggio di CD31 MCS sono state testate per gli indicatori esclusivamente espressi dalle cellule muscolari satellite. Come previsto CD45^– CD31 frazione^– e cellule di muscolo primario ha mostrato espressione Pax-7 e Cdh15 , mentre CD45^– CD31⁺ e MMEC murino primario coltivati erano negativi per questi marcatori dopo un secondo CD31 Passo MCS. Inoltre un controllo di qualità di cellule isolate o coltivate è inevitabilmente garantire esperimenti affidabili e riproducibili. Sono disponibili diversi metodi per il controllo di qualità di primaria MMEC murino: oltre a microscopia delle proprietà morfologiche, citometria a flusso, PCR e immunofluorescenza stainings per marcatori caratteristici di CE (CD31, Sca-1) può essere utilizzato. Valutazione di purezza di recente isolate MMEC murino primario era solo circa il 60-70%, mentre potrebbe essere individuata una redditività di circa il 70%. La microscopia di queste cellule Mostra parzialmente conglomerati di cella, che potrebbero consistere di contaminanti cellule come fibroblasti o periciti attaccati alla CE. Dopo 7 giorni possono essere osservate principalmente cellule piatte e allungate e le cellule della sferoide. Tuttavia, due passaggi di CD31 MCS provocato dalla purezza e alta redditività. Approcci alternativi per aumentare la purezza come media con puromicina contenenti non in murino primario MMEC pur essendo efficace in murino cervello microvascolare EC ⁸.

Poiché CE microvascolare derivato dai capillari esprimono proteine di giunzione stretta, è stato esaminato l'espressione genica di Cld5, Ocln e Tjp1 in MMEC murino primario rispetto al muscolo cellule differenziate. Come previsto, tutte le molecole di giunzione stretta sono state rilevate in MMEC murino primario. In confronto, le cellule muscolari hanno dimostrato solo bassa espressione di Tjp1, mentre nessuna espressione di Cld5 e Ocln ha potuto essere determinata. Simili modelli di espressione precedentemente sono stati dimostrati in muscolo scheletrico intero murino. Qui, un'espressione genica e proteica livello potrebbe essere rilevata per Tjp1 ma non per occludina ⁹. Ulteriori caratteristiche funzionali come transendoteliale resistenza potrebbero essere misurate.

Il protocollo descritto nel presente documento presenta solo l'isolamento della microvascolare CE da tessuto muscolare murino. Tuttavia, potrebbe essere trasferito a varie altre specie come ad esempio che un protocollo simile è stato pubblicato per ratto che microvascolare CE derivata da rilievi grassi dell'epididimo. Qui, CD31 selezione positiva tramite MCS è stata preceduta da centrifugazione su gradiente di densità ¹⁰. Approcci simili riuscivano in isolamento CE macrovascular dal ratto arterie femorali ¹¹. Un metodo recentemente pubblicato per isolare CE microvascolare del tessuto cardiaco e polmonare utilizza CD31 ed endoglin (CD105) come antigeni per magnetico cella ordinamento ¹². Tuttavia, la purezza della CE non potrebbe essere ulteriormente aumentata utilizzando ulteriore separazione di biglie magnetiche CD105. Un'altra possibilità per isolare e purificare MMEC murino primario è attivata di fluorescenza multicolore cella ordinano (FACS). Una popolazione distinta di Sca-1⁺, CD31⁺, CD34^dim e CD45^– cellule dai muscoli murini potrebbero essere isolate ed è stata caratterizzata come primario murino MMEC ¹³. Un vantaggio di questo metodo è una popolazione pura di CE che può essere utilizzata direttamente o coltivata per ulteriori esperimenti (si noti che nella nostra esperienza FACS conduce alla morte aumentata delle cellule a causa di stress cellulare superiore). Cellule più ulteriormente, morte o conglomerati di diversi tipi di cellule possono ridurre significativamente i numeri delle cellule isolate da FACS. Inoltre, è segnalato che MMEC murino primario isolato da FACS con esito negativo sono state coltivate in condizioni di coltura comunemente usati del 21% O₂ e 5% CO₂. Qui, il livello di ossigeno ha dovuto essere registrato al 5% per una coltivazione sufficienti ¹³. Inoltre, la tecnica FACS è più complessa, che richiede tempo e i prerequisiti infrastrutturali sono costosi.

Il quadriceps di musculus femorale e il tricipite surale di musculus di topi maschi in età di 4-12 settimane sono più adatti per l'isolamento primario murino MEC come sono facilmente accessibile e abbastanza grande per l'isolamento di sufficiente numero di cellule (5-10 x 10⁵ a muscolo di grammo). Pertanto, è necessario accertarsi che le condizioni siano comparabili in esperimenti indipendenti. Come descritto in precedenza, le cellule primarie possono subire la senescenza. Quindi, utilizzare celle per il rispettivi esperimenti prontamente in passaggi più bassi. Dopo il passaggio 8 – 10 MMEC murino primario cambiare loro morfologia, dimostrare tassi lenta proliferazione e perdere loro inibizione da contatto come segni per dedifferenziazione e senescenza.

Infine vi sono alcune note per la risoluzione dei problemi per questo protocollo. Lavoro sterile è essenziale per evitare contaminazioni. Controlli di qualità sono necessari per monitor purezza e vitalità delle cellule isolate. Materiali utilizzati in questo protocollo devono essere memorizzati e applicate secondo le istruzioni del produttore. Ulteriori, età e sesso degli animali usati, come pure diversi gruppi muscolari potrebbe influenzare la qualità e la comparabilità delle cellule isolate in esperimenti.

Il protocollo descritto dovrebbe essere considerato come metodo piattaforma per isolare CE microvascolare primario dei muscoli scheletrici. Cellule isolate utilizzabile per diverse applicazioni per approfondire ulteriormente di sangue-muscolo-barriera funzione. Le cellule sono adatte sia della proteina e gli studi di espressione di RNA, nonché saggi funzionali (compresi gli studi di adesione e la trasmigrazione). Tuttavia, questo protocollo è stato ottimizzato per studi focalizzati su processi infiammatori e quindi lievi modifiche potrebbero essere necessarie rispetto alle aree di ricerca differenti.

Per modellare le complesse interazioni spaziali e funzionali cellulari entro il MVU, MMEC murino primario può essere coltivata in più complessi sistemi di coltura cellulare 3D insieme ad altri tipi di cellule. Prospetticamente, dovrebbe anche essere possibile generare MVU organoids come è stata descritta per altri tessuti prima del ¹⁴. Tuttavia, è inevitabile per il puntamento a questo prossimo passo successo isolare MMEC murino primario.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25200-056	ready to use
ACK buffer			150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)	Biolegend	102506	Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11)	Biolegend	103106	Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A4503
CD31 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-097-418
CD45 MicroBeads mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301
Collagenase-Dispase	Roche	10269638001	Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates	Corning	3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody	dianova	712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI)	Thermo Fisher	P36935
Desoxyribonuclease	Sigma Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water	Thermo Fisher	AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate	Thermo Fisher	31966-021	warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM)	Thermo Fisher	R0192	1 mL
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
FACS tubes	Sarstedt	551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer	Corning	352350
FC buffer			0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780	Thermo Fisher	65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm)	Fine Science Tools	11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix)	Braun	9161708V
large magnetiv columns (LS columns)	Miltenyi Biotec	130-042-401	for CD45-MACS-step
MCS buffer			0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column)	Miltenyi Biotec	130-042-201	for CD31-MACS-step
Nuclease free water	Thermo Fisher	R0581
PBS	Sigma Aldrich		Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742	in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse	SantaCruz	Sc-52713	100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
primary murine muscle cells	celprogen	66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin)	Thermo Fisher	Mm00483191_m1	FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5)	Thermo Fisher	Mm00727012_s1	FAM labeled
Primer Ocln (occludin)	Thermo Fisher	Mm00500912_m1	FAM labeled
Primer Pax-7	Thermo Fisher	Mm01354484_m1	FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)	Thermo Fisher	Mm00493699_m1	FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control)	Thermo Fisher	4310893E	VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)	Thermo Fisher	K0231	2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer	Thermo Fisher	SO142	Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x)	Thermo Fisher	EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL)	Thermo Fisher	EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp)	Fine Science Tools	14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt)	Fine Science Tools	14001-13
Speed Coating solution	PeloBiotech	PB-LU-000-0002-00