Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Изоляция микрососудистой эндотелиальных клеток первичного мышиных скелетных мышц

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58901
Automatic Translation
*1, *1, 1, *1, *1
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster
* These authors contributed equally

Summary

Микроваскулярная эндотелиальных клеток скелетных мышц (MMEC) форма внутренней стенки капилляров мышц и регулировать так, обмен жидкости/молекул и миграции клеток (иммунитет) между мышечной ткани и крови. Изоляция первичного мышиных MMEC, как описано здесь, позволяет всеобъемлющего в пробирке исследования группы «myovascular».

Abstract

Эндотелиальные клетки скелетной мускулатуры капилляров (микрососудистой эндотелиальных клеток мышц, MMEC) создать барьер между поток крови и скелетных мышц, регулирующий обмен жидкости и питательных веществ, а также иммунный ответ против инфекционных агенты, контролируя иммунные клетки миграции. Для выполнения этих функций, MMEC формируют функциональные «группа myovascular» (МВУ), с дальнейшей типов клеток, фибробластов, pericytes и скелетных мышечных клеток. Следовательно дисфункция MMEC и, следовательно, МВУ способствует разнообразие миопатий. Однако механизмы регулирования MMEC в здоровье и болезни по-прежнему недостаточно понятны и их разъяснение предшествует более конкретные лечения миопатии. Изоляции и углубленного исследования первичного MMEC функций в контексте МВУ может способствовать лучшему пониманию этих процессов.

Эта статья предоставляет протокол изолировать первичной мышиных MMEC скелетных мышц, механических и ферментативные диссоциации, включая очистки и культура обслуживания шаги.

Introduction

С кислородом, субстратов и других необходимых молекул поставляются через кровоток, клеток и органов. Этот обмен происходит в капиллярах, мельчайших сосудов. Капилляров образуются слоя внутренний эндотелиальных клеток (EC), целостность которого остается необходимым условием для успешного регуляции гомеостаза мышц между внутрисосудистого и интерстициального пространства. Для обеспечения выборочной переход клеток и растворимых факторов, ЕС составляют монослоя, плотно соединены и adherens соединения 1. Помимо своей роли как барьер для питательных веществ или продуктов метаболизма EC регулируют набор лейкоцитов при воспалительных процессах. Воспаление или ткани повреждение приводит к вверх регулирование молекул адгезии на поверхности EC и производство chemokines, содействия лейкоцита привязанность и переселение в целевой ткани 2. Следовательно ЕС критически участвуют в регуляции воспалительных процессов, таких как обороны против патогенов или восстановления тканей.

Дисфункция ЕС, непосредственно связанные с сосудистые заболевания, хроническая почечная недостаточность, тромбоз тяжелой возбудителя инфекции. Кроме того ЕС практически всегда участвуют в орган конкретных аутоиммунных заболеваний таких, как сахарный диабет или рассеянный склероз 3. Поэтому функцию барьера между поток крови и органов контролируется согласованного взаимодействия различных типов клеток. В скелетных мышцах микрососудистой эндотелиальных клеток (MMEC) вместе с мышечных клеток, фибробластов и pericytes образуют функциональный блок, «myovascular» (МВУ). Таким образом дисфункции МВУ может играть решающую роль в патофизиологии миопатий. Однако более глубокое понимание этих механизмов регулирования все еще отсутствует и в настоящее время препятствует выявлению новых, срочно необходимых, терапевтических целей в миопатий.

Для расследования сложных физиологических и патофизиологических механизмов, обычно используются Животные модели. Однако в пробирке модели предлагают преимущество сосредоточиться на предмет интереса, исключив различных смешанных факторов. Чтобы исследовать процессы в пробирке это необходимо изолировать чистой и жизнеспособных первичных элементов. В отличие от клеточных линий первичные элементы изолированы от трансгенных животных позволяют исследовать последствия генетических модификаций в пробирке.

Здесь метод, чтобы изолировать первичной мышиных MMEC описан с помощью механических и ферментативные диссоциации, следуют магнитные активированных клеток, сортировка методов (MCS) для очистки. Для этой цели используются магнитные шарики против конкретных поверхностных маркеров. Тромбоцитов эндотелиальных клеток адгезии молекулы-1 (PECAM1, CD31) выражается главным образом на ЕС и может использоваться для обогащения этого типа ячейки. Чтобы оправдать высокие ячейки чистоты, клеток кроветворных происхождения исключены негативный выбор для белка тирозинкиназы фосфатазы рецептор типа C (PTPRC, CD45). Кроме того контроль качества, культивирование первичного мышиных MMEC, потенциальные применения и ограничения, а также особые соображения представлены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных были утверждены местными властями и проведены согласно закону о немецких животных (84-02.05.20.13.097).

1. Общие замечания на эксперименты на животных

  1. Выполните все мыши экспериментов в соответствии с руководящими принципами соответствующих институционального ухода за животными и Комитета.
  2. Держите мышей в стандартизированных условиях и по данным международных руководящих принципов, таких, как Федерации для лабораторных животных науки ассоциаций (FELASA).
    Примечание: В целом этот метод изоляции может использоваться для мышей, независимо от возраста, пола или генетический фон. Для получения достаточного числа клеток, 4 – 10 недельных самцов предпочесны, потому что биологических свойств может меняться с возраста и пола.

2. Подготовка решений, средств массовой информации и покрытия

  1. Подготовка пищеварения (DS) решение путем смешивания 2,2 мл из Dulbecco´s изменение Eagle среднего (DMEM) с 200 мкл коллагеназы-Dispase и 45 мкл Desoxyribonuclease (DNase).
  2. Подготовка 500 мл среды эндотелиальных клеток (ECM) путем смешивания 450 мл DMEM с 50 мл FCS (примерно 10%), bFGF фактор роста фибробластов основные 0,25 мл (20 мкг/мл; приблизительно 0,05%) и 5 мл пенициллин стрептомицином (примерно 1%). Выполнение стерильной фильтрации в стеклянной трубки (диаметр поры фильтра: 0.2 мкм). Потом хранить решение при 4 ° C.
  3. Слой плиты культуры клеток, как описано ниже.
    1. Для выращивания свежевыделенных первичной мышиных MEC покрытия по всей поверхности с 1 мл на хорошо 6 хорошо клетки культуры плита покрытия раствором желатина на основе скорости (см. Таблицу материалы) согласно инструкции производителя для 3-5 мин на номер Температура (RT).
    2. Аспирационная и отменить решение покрытия. Промойте каждую лунку с 2 мл стерильного фосфатный буфер (PBS), рН 7,1-7,5 в два этапа подряд стирки.
    3. Аспирационная и отбросить PBS. Заполните скважин с объемом 1 мл ECM.

3. изоляция первичного мышиных микрососудистой эндотелиальных клеток (MMEC)

  1. Усыпить один взрослый 4 – 12 недель старые, мужчины мыши от шейки матки дислокации без каких-либо анестезии. Цель состоит в том, чтобы быстро отделить спинного мозга таким образом, чтобы обеспечить животное с быстрой и безболезненной смерти.
  2. Север конечностей.
    1. Используйте хирургический острый/Блант (передний край 42 мм, прямой) и острыми/острыми ножницами (передний край 23 мм, прямой), прямой (зубчатые, 2 мм x 1,25 мм x 12 см) и изогнутые (зубчатые, 1.3 мм x 1 мм x 13 см) щипцов.
    2. Лечением всех хирургических инструментов с 70% этиловом спирте.
    3. Положение на спине животного, смочите ноги с 70% этиловом спирте. Разорвать всю ногу путем разрезания на тазобедренного сустава с острыми/Блант хирургические ножницы. Место конечностей в культуры блюдо с закрытыми порами (35 мм x 10 мм).
      Примечание: Теперь выполнять каждый шаг под стерильную Ламинарный шкаф и работать с стерилизации инструментов.
  3. Изолировать мышечной ткани (преимущественно использовать musculus четырехглавой мышцы бедра или musculus трицепс Трёхглавая от обеих ног).
    1. Разрезать кожи от бедра на кончик пальца, используя острый/острыми ножницами и Изогнутый пинцет. Удерживайте палец или зверолов прямой пинцетом. Отслаиваются кожи пинцетом изогнутые от ноги до бедра.
    2. Изолировать musculus четырехглавой мышцы бедра , резка сухожилия от колена и разорвать мышцы вдоль бедра до бедра. Изолируйте Трёхглавая musculus трицепс , разрыв ахиллова сухожилия. Далее разрезать вдоль большеберцовой кости в подколенной ямки и удалить мышцы.
      Примечание: Если крупных сосудов (A. femoralis, A. tibialis передней, задней A. tibialis, A. малоберцовая) являются видимыми в изолированной мышцы, удалите судов, чтобы избежать загрязнения путем macrovascular эндотелия.
    3. Для удаления больших судов, удерживая часть мышц, не содержащие большие сосуды с изогнутой щипцами и отрезать его рядом с судна. Для этого протокола 1 g или меньше мышечной ткани, равным четырехглавой мышцы бедра и трицепс Трёхглавая рекомендуется.
    4. Мкл 2 445 DS (из шага 2.1) к ячейке культуры блюдо (35 мм x 10 мм) и определить вес.
    5. Передача всех частей мышцы к этому блюду культуры клеток, содержащих 2445 мкл DS и определить вес. Разница обоих измеренных значений дает сухого веса мышечной ткани, которая не должна превышать 1 г.
    6. Вырежьте всей мышечной ткани на мелкие кусочки (≤2 мм кубов, около 100 штук), используя острый/острыми ножницами.
  4. Отделить мышечной ткани.
    Примечание:     этот шаг занимает около 120 мин.
    1. Магазин мышцы/DS подвеска при 37 ° C (инкубатор с 5% CO2) для 1,5 ч. смешать подвеска тщательно каждые 20 мин около 5 минут, используя шприц 1мл инсулин.
    2. Перевести 70 мкм нейлон клеток стрейнер на 50 мл трубки подвеска и собирать через поток. Промойте фильтр ячейки с 8 мл DMEM и собирать через поток.
    3. Сбросить фильтр и центрифуги суспензию клеток для 10 мин на 300 x g при 20 ° C. Тщательно удалите супернатант.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Пелле легко потерять.
    4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл лизировать буфер аммония хлорид калия (ACK) (см. прилагается Таблица материалов) для лизиса красных кровяных клеток и Инкубируйте 30 s на RT. Добавить 9 мл DMEM + 10% FCS для остановки реакции и передачи суспензию клеток к t 15 мл убе.
  5. Разрушающим CD45+ клетки после CD45 микрошарики изготовителя. Для всех следующих шагов CD45+ истощение использовать буфер MCS (см. прилагается таблица материалов).
    Примечание:     этот шаг занимает около 60 мин.
    1. Определить число клеток с помощью Нойбауэр клеток подсчета палата (ожидать около 5 х 106 клеток / g мышечной ткани).
    2. Центрифуга подвеска на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Возьмите супернатант полностью и Ресуспензируйте Пелле клеток в 90 мкл MCS буфера (за 107 клеток или меньше). Добавьте 10 мкл CD45 микрошарики (за 107 клеток или меньше).
    3. Перемешать суспензию клеток и Инкубируйте 15 мин в холодильник на 4 – 8 ° C.
    4. Добавьте 1 мл MCS буфера (за 107 клеток или меньше). Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Полностью удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 500 мкл буфера MCS.
    5. Для разделения магнитных клеток используйте столбец большие магнитные (ОБК) с резервуар объемом 8 мл и емкостью до 2 х 109 всего клеток. Расположите УТС в магнитном поле разделителя.
    6. Промойте с 3 мл буфера МКН в водохранилище ОБК. После ополаскивания, место 15 мл Конические трубки ниже столбца для сбора потока через. Применить подвеска вся ячейка (500 мкл) на столбец и дайте ему полностью потока.
    7. Промойте колонку три раза путем добавления 3 мл буфера МКН в водохранилище и подождать до тех пор, пока column´s резервуар пуст перед выполнением следующего шага стирки.
    8. Собрать немеченого клетки, передавая столбец использовать для дальнейшего разделения шаги (представляющий CD45 фракция– ). Помечены клетки (представляющий CD45+ фракция) накопленных в столбце, может быть удален.
  6. Накапливать CD31+ клетки следующие CD31 микрошарики с инструкциями производителя. Для всех следующих шагов CD31+ накопление использовать буфер MCS.
    Примечание:     этот шаг занимает около 60 мин.
    1. Определить номер ячейки, используя ячейку Нойбауэр, считая палата (ожидать около 4 х 106 клеток / g мышечной ткани).
    2. Центрифуга получил суспензию немеченого клеток от шаг 3.5 для 10 мин на 300 x g при 4 ° C.
    3. Полностью удалите супернатант. Ресуспензируйте гранулы в 90 мкл буфера MCS и добавить 10 мкл CD31 микрошарики (за 10 клеток всего7 или меньше). Смешать вся подвеска и Инкубируйте 15 мин в холодильник на 4 – 8 ° C.
    4. Добавить 1 мл MCS буфер и центрифуги на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Возьмите супернатант и Ресуспензируйте клетки в 500 мкл буфера MCS.
    5. Для разделения магнитных клеток используйте столбец средних магнитные (MMC) с резервуар объемом 3,5 мл и емкостью до 2 x 108 всего клеток.
    6. Расположите консоль MMC в магнитном поле разделителя. Промойте MMC с 500 мкл буфера MCS. После ополаскивания, место 15 мл Конические трубки ниже столбца для сбора потока через.
    7. Применить подвеска вся ячейка (500 мкл) на столбец и дайте ему полностью потока.
    8. Промойте колонку три раза путем добавления 500 мкл буфера MCS и подождать до тех пор, пока столбец резервуар пуст перед выполнением следующего шага стиральная. Немеченого клетки, передавая столбце представляют CD45– CD31– фракции. Сохраните их для дальнейшего контроля качества.
    9. Удалить столбец из сепаратора и поместите его на трубку подходящего коллекции (15 мл). Пипетка 2 мл MCS буфер на столбец. Немедленно промойте магнитно помечены клетки, твердо толкает поршень в столбце. Этот CD45– CD31+ фракция представляет обогащенных первичных мышиных EC.
    10. Суспензию клеток центрифуги для 5 мин на 350 x g при 20 ° C. Полностью удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки (ожидать около 0,6 х 106 клеток / g мышечной ткани) в 1 мл ECM (см. шаг 2.2.). Передачи (0,5 – 0,7 х 106 клеток) в один колодец пластины с покрытием 6-ну культуры (из шага 2.3) содержащий 1 мл ECM.
  7. Для выращивания инкубации клеток при 37 ° C и 5% CO2 в стерильных инкубатора. Обновите ECM каждые два-три дня.

4. Первичные мышиных MMEC очистки

  1. Выполните второй цикл CD31+ накопление, следуя инструкциям производителя (CD31 микрошарики мыши протокола; см. шаг 3.6.).
    1. Отсоедините клетки раствором трипсина/ЭДТА, когда они находятся в 80 – 90% слияния (обычно после 7 дней). Для этого промойте каждой скважины с 2 мл стерильного PBS, в двух шагах подряд стирки. Используйте 800 мкл раствора трипсина/ЭДТА на 6-Ну и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 в стерильных инкубатор для 3-5 мин остановка ферментативной активности с помощью 1200 мкл DMEM, содержащий как минимум 10% FCS.
    2. Центрифуга суспензию клеток для 5 мин на 350 x g при 20 ° C.
    3. Выполните второй CD31-MCS шаг для повышения чистоты (согласно инструкциям manufacturer´s CD31 микрошарики; 3.6 см.).
    4. Соблюдать слияния клеток через яркие поля или с помощью стандартных фазово контрастной микроскопии
      20 x увеличение и 0,35 объектив числовая апертура. Смотрите Рисунок 1.
      Примечание: Клетки могут быть использованы для соответствующих экспериментов или хранится в культуре пассированый. Используйте клетки для экспериментов оперативно в нижней проходы. Не рекомендуется использовать клетки после прохождения
      8 – 10.

5. контроль качества

  1. После второго CD31-MCS-шаг выполните проточной цитометрии первичного мышиных MMEC.
    1. Подготовка трубки СУИМ, добавив 1 мл буфера потока цитометрии (FC) (см. прилагается Таблица материалов).
    2. Отсоедините клетки раствором трипсина/ЭДТА, когда они находятся в 100% слияния (обычно после 14 дней). Для этого промойте каждой скважины с 2 мл стерильного PBS, в двух шагах подряд стирки. Используйте 800 мкл раствора трипсина/ЭДТА на 6-Ну и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 в стерильных инкубатор для 3-5 мин остановка ферментативной активности с помощью 1200 мкл DMEM, содержащие 10% FCS.
    3. Определите номер ячейки с помощью Нойбауэр клеток подсчета палаты и добавить менее 1 x 105 клеток в подготовленных трубки СУИМ.
    4. Суспензию клеток центрифуги для 10 мин на 300 x g при 4 ° C. Выполните два Стиральная, удалив супернатанта, resuspending клеток в 1 мл ФК буфера и центрифугирование 10 мин на 300 x g при 4 ° C.
    5. Подготовка окрашивание смесь, добавив анти мышь мышь CD45-PE (1: 100) борьбе с ФК буфера и CD31-FITC антитела (1: 100).
    6. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл окрашивания микс в СУИМ трубы. Инкубируйте 30 мин при 4 ° C. Добавьте 1 mL ФК буфера. Суспензию клеток центрифуги для 5 мин на 300 x g при 4 ° C. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 200 мкл буфера ФК.
    7. Мера клетки в проточный цитометр после стробирования стратегия показано на рисунке. 2A.
  2. Можно также выполните, иммунофлюоресценции окрашивание первичных мышиных MMEC после второго CD31-MCS-шаг.
    1. Пальто coverslips.
      1. Передача стерильные 13 мм диаметром круглые стекло coverslip в колодец 24 хорошо плиты. Пальто coverslip, добавляя 300 мкл раствора покрытия скорость на хорошо. Инкубируйте 3 – 5 мин при комнатной температуре (RT).
      2. Аспирационная и отменить решение покрытия. Промойте каждую лунку с 2 мл стерильного PBS в два этапа подряд стирки. Аспирационная и отбросить PBS.
      3. Семян 1 x 105 клеток в 1 мл ECM на покрытые coverslip и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 в стерильных инкубатор, до тех пор, пока клетки являются 99% притока.
    2. Выполнение фиксации и окраски иммунофлюоресценции.
      1. Удалите средство ECM культивируемых клеток от 5.2.1.3.
      2. Исправить культивируемых клеток путем добавления параформальдегида 4% 300 мкл (PFA) с рН 7,4 на колодец, за 10 мин при 4° C.
        ОСТОРОЖНОСТЬЮ: PFA токсичных и должны быть обработаны с осторожностью.
      3. 3 выполните Стиральная, добавив 1 мл PBS на хорошо и удалить супернатант после 5 мин на RT.
      4. Подготовьте блокирования решения с 5% BSA, 0,2% Тритон-X и 1% козьего сыворотки в PBS.
      5. Добавить 300 мкл блокирования решения каждой скважины и инкубировать 1 час на RT.
      6. Удалить супернатант и 200 мкл на хорошо антитела анти PECAM-1 (CD31) (1: 200) в 5% BSA, 1% козьего сыворотки в PBS и Инкубируйте на 4 ° C на ночь.
      7. Выполните 3 мытье шаги путем добавления 1 мл PBS на колодец и удаления супернатанта после 5 минут в каждом шаге в рт.
      8. Подготовьте раствор вторичное антитело, содержащий Cy3-конъюгированных антител IgG против крыс (1: 500) в 1% BSA и PBS. 300 мкл на хорошо раствор вторичных антител и инкубировать 1 час на RT в темноте.
      9. Выполните 3 мытье шаги путем добавления 1 мл PBS на колодец и удаления супернатанта после 5 минут в каждом шаге в рт.
    3. Взять coverslips круглые стекла тщательно с щипцами и перенести его на слайд микроскопии. Добавьте соответствующее количество монтажа средних содержащие DAPI на слоя клеток и тщательно поставить стекло на него (см. прилагаемые Таблицы материалы).
    4. Соблюдать клетки с соответствующим флуоресценции микроскопом с источником света флуоресцирования (120 Вт) и два фильтра набора: набор фильтров возбуждения/выбросов с 550/25 Нм и 605/70 нм длины волн для обнаружения Cy3 540/562 Нм.
    5. Используйте фильтр второй набор с возбуждения/выбросов волны 365/50 Нм и 445/50 Нм для обнаружения DAPI 350/440 Нм. Использовать масштаб 40 x и 80% интенсивности 14.5 МВт/см2 для DAPI приобретение продолжительностью 30 г-жа для обнаружения Cy3 использовать 80% 67.5 МВт/см2 приобретение продолжительностью 60 мс.
  3. Выполняйте количественного PCR.
    1. Изоляция мРНК.
      1. Выполните стандартные процедуры, с помощью кислоты Гуанидиновые тиоцианат фенола (AGTP) реагента для изоляции мРНК. Используйте как минимум 0.5 x 106 клеток от CD45– CD31– (см. шаг 3.6.8), CD45– CD31+ (см. шаг 3.6.9.) фракций и культивируемых первичной мышиных MMEC (4.1.3)
      2. Суспензию клеток центрифуги для 10 мин на 300 x g при 20 ° C. Полностью снять супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл суспензии клеток реагента и передачи AGTP в 2-мл пробирку реакции. Инкубируйте 5 мин на RT.
      3. 100 мкл хлороформе и встряхнуть для 15 s. инкубировать на 3 мин на RT.
      4. Подвеска центрифуги для 15 мин на 12000 x g при 4 ° C.
      5. Снять верхний водной фазе (содержащие РНК) тщательно и передачи в 1,5 мл реакции. 250 мкл изопропанола и проинкубируйте втечение 10 мин на RT.
      6. Выполните шаг центрифугирования в 12000 x g для 10 мин при 4 ° C.
      7. Возьмите супернатант и осторожно добавьте 1 mL 75% этанола. Центрифуга на 7500 x g 5 мин при 4 ° C.
        Примечание: Пелле легко потерять.
      8. Полностью удалите супернатант. Пусть Пелле сушат на воздухе для 5 – 10 мин.
        Примечание: этанола должен быть удален, но не слишком сухой.
      9. Растворяют гранулы в 30 мкл лечение Диэтилпирокарбонат воды, содержащей в и тепла в течение 10 минут при температуре 55 ° C.
        Примечание: Чистоты и концентрации РНК может быть измерен спектральных фотометр.
    2. Выполните синтез cDNA (обратная транскриптаза ПЦР).
      1. Подготовить mastermix, содержащий: 10 мкл буфера PCR (5 x), 2,5 мкл desoxyribonucleosid трифосфата (dNTP (10 мм)), 0.5 мкл случайных смесь одноцепочечной праймера (0,2 мкг / мкл), 1 мкл АБС битор РНКазы (40 ед / мкл, 0,4 обратной транскриптазы (200 U/мкл) и 5,6 мкл diethylpyrocarbonat очищенной воды (см таблица материалов).
      2. Разбавьте 500 нг РНК в 30 мкл воды Диэтилпирокарбонат лечение в 0.2 мл ПЦР пробирок и добавить весь mastermix 20 мкл.
      3. Использование ПЦР велосипедист, выполняя следующие шаги: 10 мин 25 ° C, 30 мин 50 ° C, 5 мин 85 ° C и удерживайте при 4 ° C.
  4. Выполняйте количественного PCR (ПЦР).
    Примечание: Выполните ПЦР образцов в дубликаты или triplicates.
  5. Используйте грунт с двумя различными флуоресценции красители. Грунтовка с поглощением 495 нм и выбросов 517 Нм для гена интереса.
  6. Для обнаружения экспрессии генов маркер Спутниковое ячейки, используйте грунты для парных поле белка 7 (Pax7) и M-Кадгерины (Cdh15) (см. прилагается Таблица материалов).
  7. Для обнаружения экспрессии генов маркер эндотелиальных клеток, используйте грунты для Клаудин-5 (Cld5), occludin (Ocln) и zonula occludens-1 (Tjp1 или ZO1) (см таблица материалов).
  8. Как ссылка ген 18s рРНК, используйте грунт с поглощением 538 Нм и выброс 554 Нм длины волны.
  9. Подготовьте mastermix ПЦР для каждого гена интереса с соответствующей грунтовки. MasterMix содержит: 10 мкл буфера ПЦР (2 x), 1 мкл грунтовка для гена интереса (10 мкм), 1 мкл грунтовка для 18s рРНК и 4 мкл нуклеиназы свободной воды.
  10. 16 мкл mastermix, один колодец 96-луночных реакции плиты. 4 мкл cDNA (полученные от шага 5.3.2.) за хорошо содержащие mastermix.
  11. Использовать в реальном времени PCR велосипедист, выполняя следующие шаги: проведение этапа с 50 ° C на 2 мин и 95 ° C на 10 мин Велоспорт сцену с 40 циклов 95 ° C 15 s и 60 ° C за 1 мин.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Один день после изоляции, первичный мышиных MMEC и остаточного другие клетки образуют конгломераты и придерживаться нижней части культуры блюд (день 1рис. 1A ). С дня 7 могут наблюдаться плоские и удлиненные клетки. Однако, до сих пор виден загрязнением других, главным образом клетки сфероида, (день 7рис. 1A ). Таким образом еще один цикл CD31 положительный выбор через MCS не требуется. Далее первичный мышиных MMEC размножаться плотность примерно 80-90%. После слияния они обычно образуют non перекроя монослоя продольно унифицированных ячеек (день 14рис. 1A ). Распространения останавливается после слияния благодаря контакт ингибирование. После 14 дней о 5 – 10 x 105 клетки могут быть использованы для дальнейшего расследования.

Контроль качества через проточной цитометрии с помощью поправимо жизнеспособности краситель FVD780 (чтобы пятно для мертвых клеток), PECAM1 (CD31) и PTPRC (CD45, как маркер для клеток кроветворных происхождения) показали значения для жизнеспособности и чистоты, начиная около 70% для клеток сразу же после изоляции (рис. 2A). Клетки культивировали после другой CD31 положительный выбор через MCS, показали, удовлетворяющих значения для чистоты, а также что касается жизнеспособности, начиная до 95% (рис. 2B).

Для оценки точности отбора шаги, полученные клетки были дальнейшее расследование для экспрессии генов мышцы Спутниковое маркер гены парных поле белков 7 (Pax7) и M-Кадгерины (Cdh15) на уровне мРНК Количественная ПЦР (ПЦР). Основная мышиных MMEC (pmMMEC) и дифференцированной первичной мышиных мышечных клеток (КТДК) использовались как положительные и отрицательные управления, соответственно. Коммерчески были приобретены мышиных мышечных клеток. Как и ожидалось, только CD45– CD31– фракции, а также КТДК выразили Pax7 и Cdh15, тогда как CD45– CD31+ и первичного мышиных MMEC были отрицательными для этих маркеров (рис. 2 c).

EC производным от капилляров в эндомизиуму скелетных мышц Экспресс туго Джанкшен белки 4,5. С помощью ПЦР, выражение Клаудин-5 (Cld5), occludin (Ocln) и zonula occludens-1 (Tjp1 или ZO1) вырожденная первичной мышиных MMEC после второй CD31 MCS оценивалась шаг. КТДК были использованы в качестве контроля (Рисунок 2D). Первичный мышиных MMEC выразил высокий уровень Cld5, Ocln и Tjp1, тогда как КТДК показывать только низкий выражение Tjp1. Кроме того иммунофлюоресценции, окрашивание как контроль качества подтвердил поверхности выражение маркера эндотелий конкретных PECAM1 в первичной мышиных MMEC (рис. 2е).

Figure 1
Рисунок 1: морфология первичного мышиных MMEC. (A) представитель изображение культивировали первичной мышиных MMEC, Фазово-контрастная микроскопия от 1 до 14 дней. D1 = 1 день, d7 = 7 день, d14 = 14 день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: контроль качества первичных мышиных MMEC. Строб стратегия для потока гранулярных анализа первичных мышиных MMEC сразу же после изоляции (A) и на 15-й день (B) (I) использованием FSC/SSC, (II) FVD780 и CD45 (IIIa), CD31 (IIIb) (штриховые линии = изотипа управления). (C) выражение уровня Pax7 и M-Кадгерины (Cdh15) в CD45– CD31-, CD45– CD31+ фракции после MCS изоляции, а также как основной мышиных MMEC (pmMMEC) и первичной мышиных мышечных клеток (КТДК ). Уровни выражения отображаются как значенияt ΔC (пример - 18S рРНК), н.о. = не определяется. (D) выражения уровня туго Джанкшен белки Клаудин-5 (Cldn5), occludin (Ocln) или zonula occludens-1 (Tjp1 или ZO-1) pmMMEC и КТДК, показанный как значенияt ΔC. (E) иммунофлюоресценции пятная для PECAM1 (красный) в культивируемых первичной мышиных MMEC 24 ч после второй CD31 позитивного выбора. Ядерная, окрашивание с DAPI-содержащих (синий) монтажа средних; Left = анти PECAM1/DAPI, справа: отрицательного контроля/DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Микроваскулярная эндотелиальные клетки обеспечивают барьерные функции во всех тканях и результаты их дисфункции в болезни ассоциированных органов 3. Кроме того орган конкретных исследования микрососудистой ЕС может проложить путь для новых терапевтических стратегий. Таким образом более глубокое понимание микрососудистой EC функции в условиях физиологического и патофизиологические является большой научный интерес. Модуляции лейкоцита/эндотелия взаимодействия успешно используется для лечения рассеянного склероза пациентов с natalizumab, антитело которое препятствует адгезии лимфоцитов и тем самым трансмиграции 6. Однако различные миопатии, включая воспалительные подтипы по-прежнему остаются только плохо поддается лечению на сегодняшний день. Таким образом выяснение EC свойств специально в скелетных мышцах эндотелия может помочь расширить имеющиеся лечения миопатии или результат в новые терапевтические подходы.

Увековечен эндотелиальных клеток линии (IECL) были созданы и используются для нескольких моделей в пробирке. Эти клеточные линии предлагают ряд преимуществ, по сравнению с первичной микрососудистой EC благодаря увековечении и быстрого распространения. Кроме того основной культивируемых клеток может пройти старение и потерять или изменить их Словотолкование или физиологических функций после некоторое время или проходы. Однако IECL только сохранять некоторые свойства эндотелиальных клеток и не напоминают разнообразие различных нести орган первичной микрососудистой ЕС. Следует отметить они редко являются производными от скелетных мышц. На сегодняшний день, только одной публикации описывает человеческого скелета микрососудистой эндотелиальных клеток линии, названной TSM15 5. В противоположность этому мышиных микрососудистой ЕС не были описаны пока. Наконец Главные ячейки от трансгенных животных предоставляют возможность изучения генетических модификаций в пробирке. Однако начальных клеточных культур также провести определенные недостатки. Во-первых загрязнение с ячейками не представляет интереса может мешать действительность экспериментальных результатов. Таким образом точность выбора нескольких шагов и высокой чистоты изолированных клеток должно быть гарантировано. Суспензию клеток после диссоциации мышечной ткани содержит эритроцитов и типов различных мононуклеарных клеток как иммунные клетки, клетки Спутниковое, pericytes, фибробластов и эндотелиальных клеток 7. Таким образом фракций клеток после шага CD31 MCS были протестированы для маркеров, исключительно выраженные мышечные клетки Спутниковое. Как ожидается CD45– CD31– фракции и основных мышечных клеток показали Pax-7 и Cdh15 выражение, тогда как CD45– CD31+ и культивируемых первичной мышиных MMEC были отрицательными для этих маркеров после второй CD31 MCS шаг. Кроме того контроль качества изолированных или культивируемых клеток неизбежно заключается в обеспечении надежных и воспроизводимых экспериментах. Доступны несколько методов для контроля качества первичных мышиных MMEC: Помимо микроскопии морфологических свойств, проточная цитометрия, ПЦР и иммунофлюоресценции stainings характерные EC маркеров (например, CD31, Sca-1) могут быть использованы. Оценка чистоты свежевыделенных первичной мышиных MMEC был только около 60-70%, тогда как жизнеспособность около 70% могут быть обнаружены. Микроскопия этих клеток частично показывает конгломераты клеток, которые могут состоять из загрязняющих клетки фибробластов или pericytes, прилагается к ЕС. После 7 дней может наблюдаться главным образом плоские и удлиненные клетки и клетки сфероида. Однако два отрывка CD31 MCS привели к высокой жизнеспособности и чистоты. Альтернативные подходы к повышению чистоты, такие, как puromycin содержащих СМИ не удалось в первичной мышиных MMEC то же время эффективным в мышиных мозг микрососудистой EC 8.

Так как производные микрососудистой EC из капилляров Экспресс туго Джанкшен белки, было рассмотрено выражение гена Cld5, Ocln и Tjp1 в первичной мышиных MMEC, по сравнению с дифференцированных мышечных клеток. Как ожидалось в первичной мышиных MMEC были обнаружены все жесткие соединения молекул. В сравнении мышечные клетки продемонстрировал только низкий выражение Tjp1, тогда как выражение Cld5 и Ocln не может быть определено. Ранее подобные выражения шаблоны были продемонстрированы в целом мышиных скелетных мышц. Здесь выражение на уровне генов и белков может быть обнаружен, для Tjp1 , но не для occludin 9. Дополнительные функциональные возможности, такие как трансэндотелиальной сопротивление можно измерить.

Здесь описывается протокол включает только изоляции микрососудистой EC из мышиных мышечной ткани. Однако она может быть передана различных других видов, например, когда был опубликован аналогичный протокол для крыс, микрососудистой EC, полученных от эпидидимальных жировых отложений. Здесь CD31 положительный выбор через MCS предшествовала плотность градиентного центрифугирования 10. Аналогичные подходы были успешными в macrovascular EC изоляции от бедренной артериях крыс 11. Недавно опубликованные метод, чтобы изолировать микрососудистой EC сердечной и легочной ткани использует CD31 и endoglin (CD105) как антигены для магнитных ячейку Сортировка 12. Однако чистоту ЕС может не далее увеличить с помощью дополнительных CD105 магнитный шарик разделения. Еще одна возможность изолировать и очистить первичной мышиных MMEC является ячейка многоцветной активированных флуоресцированием сортируя (FACS). Совокупность отдельных Sca-+, 1 CD31+, CD34dim и CD45– клетки из мышиных мышцы могут быть изолированы и было охарактеризовано как основной мышиных MMEC 13. Преимуществом этого метода является чисто населения ЕС, которые могут быть непосредственно использованы или выращиваются для дальнейших экспериментов (Обратите внимание, что в наш опыт СУИМ приводит к возросла клеточной гибели из-за выше ячейки стресса). Кроме того, мертвые клетки или конгломератов различных типов клеток может значительно уменьшить число изолированных клеток, СУИМ. Кроме того сообщалось, что основной мышиных MMEC, изолированные FACS были безуспешно культивировали в условиях часто используемых культура 21% O2 и 5% CO2. Здесь уровень кислорода пришлось скорректировать до 5% для достаточно культивирования 13. Кроме того СУИМ техника является более сложным, длительным и инфраструктурные условия являются дорогостоящими.

Musculus четырехглавой мышцы бедра и трицепс Трёхглавая musculus мужчин мышей в возрасте 4-12 недель являются наиболее подходящими для изоляции первичных мышиных MEC, как они были легко доступны и достаточно большой, для изоляции достаточного числа клеток (5-10 x 105 процентов грамм мышц). Таким образом необходимо обеспечить, что условия являются сопоставимыми в независимых экспериментах. Как описано выше, Главные ячейки могут пройти старение. Следовательно используйте клетки для соответствующих экспериментов оперативно в нижней проходы. После прохождения начального мышиных MMEC 8 – 10 изменить их морфологии, продемонстрировать медленного распространения ставки и потерять свои контакты ингибирование как знаки для дифференцировке и старение.

Кроме того есть некоторые примечания для устранения неполадок для этого протокола. Стерильные рабочие имеет важное значение для избежания загрязнений. Контроль качества, необходимые для мониторинга чистоты и жизнеспособность изолированных клеток. Используемые материалы в этом протоколе должны храниться и применяется в соответствии с инструкциями производителя. Дополнительные, возраст и пол используемых животных, а также различных групп мышц могут повлиять на качество и сопоставимость изолированных клеток в экспериментах.

Описывается протокол должны рассматриваться как платформа метод для изоляции первичных микрососудистой EC скелетных мышц. Изолированных клеток может использоваться для нескольких приложений, чтобы получить дальнейшее понимание крови мышцы барьерную функцию. Клетки для белка и РНК выражение исследования, а также функциональные анализы (в том числе исследования трансмиграции и адгезии). Однако этот протокол был оптимизирован для исследований, посвященных воспалительные процессы, и следовательно незначительные изменения могут потребоваться в различных научно-исследовательских областях.

Для моделирования сложных пространственных и функциональных сотовой взаимодействий в МВУ, первичный мышиных MMEC могут культивироваться в более сложных системах культуры 3D клеток вместе с другими типами клеток. Проспективно оно также должно быть возможно генерировать organoids МВУ, как это было описано для других тканей до 14. Однако успешное изоляции первичных мышиных MMEC неизбежна для направленных на этот следующий шаг.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана, «еще Kröner-Fresenius-Stiftung» (2018_A03 TR), «Инновационные Medizinische Тюрингия (МВФ) Münster» (I-RU211811 для TR) и Немецкий исследовательский фонд (DFG, INST 2105/27-1, меня 3283/5-1 и меня 3283/6-1 к SGM). Иллюстрированный изображения, предоставляемые Хайке Blum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Tags

Нейробиологии выпуск 145 изоляция клетки мышиных микрососудистой эндотелиальные клетки клетки скелетной мышцы барьер крови мышцы myovascular блок миопатия
Изоляция микрососудистой эндотелиальных клеток первичного мышиных скелетных мышц
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müntefering, T., Michels, A. P. … More

Müntefering, T., Michels, A. P. E., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter