Summary
Etter kontroll av blod-oksygen-nivå-avhengige funksjonell magnetisk resonans imaging (fet fMRI) tilsvarende somatosensory fat feltet cortex området (kalt S1BF) er riktig aktivert, viktigste målet med denne studien er å tallfeste laktat innhold svingninger i aktivert rotte hjernen av lokaliserte proton magnetisk resonans spektroskopi (1H-MRS) på 7 T.
Abstract
Kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi tilbyr muligheten til å måle cerebral metabolitten innholdet i vivo og noninvasively. Takket være teknologiske utviklingen over det siste tiåret og økningen i magnetisk feltstyrke er det nå mulig å få god oppløsning spectra i vivo i rotte hjernen. Neuroenergetics (dvs., studiet av hjernen metabolisme) og, spesielt, metabolske interaksjoner mellom de forskjellige celletyper har tiltrukket seg mer og mer interessert i de siste årene. Blant disse metabolske interaksjoner, er eksistensen av laktat transport mellom nerveceller og astrocyttene fortsatt omdiskutert. Det er derfor av stor interesse å utføre funksjonelle proton magnetisk resonans spektroskopi (1H-MRS) i en rotte modell av hjernen aktivisering og overvåke laktat. Men metyl laktat toppen overlapper lipid resonans topper og er vanskelig å kvantifisere. Protokollen beskrevet nedenfor gir metabolske og laktat svingninger overvåkes i en aktivert brain området. Cerebral aktivisering oppnås ved whisker stimulering og 1H-MRS utføres i tilsvarende aktivert fat cortex, hvis området er oppdaget bruker blod-oksygen-nivå-avhengige funksjonell magnetisk resonans imaging (fet fMRI). Alle tiltak er fullstendig beskrevet: valg av anestesi, spoler og sekvenser, oppnå effektiv whisker stimulering direkte i magnet og databehandling.
Introduction
Hjernen har innebygde mekanismer at regulering av sin store substrat (dvs., glukose) både for sitt bidrag og dens utnyttelse, avhengig av variasjoner i lokale hjerne aktivitet. Selv om glukose viktigste underlaget for hjernen, har eksperimenter utført de siste årene vist at laktat, som er produsert av astrocyttene, kan være en effektiv energi substrat for neurons. Dette reiser hypotesen om laktat transport mellom astrocyttene og neurons1. Kjent som ANLS, for astrocytter-Nevron laktat flybuss2, teorien er fortsatt omdiskutert men har ført til forslaget at glukose, i stedet for å gå direkte inn i nerveceller, kan angi astrocyttene, hvor det er metaboliseres til laktat, en metabolitten som er , deretter overført til neurons, som bruker det som effektiv energi substrat. Hvis slike skytteltransport finnes i vivo, ville det ha flere viktige konsekvenser, både for forståelsen av grunnleggende teknikker i funksjonell cerebral imaging (fantes et positron utslipp tomografi [PET]) og for å tyde de metabolske forandringer observert i hjernen patologi.
Å studere hjernen metabolisme og, spesielt, metabolske samspillet mellom nerveceller og astrocyttene, fire viktigste teknikker er tilgjengelig (ikke inkludert mikro-/ nanosensors): autoradiography, PET, to-fotonet fluorescerende AC confocal mikroskopi og MRS. Autoradiography var en av de første metodene foreslått og gir bilder av regionale opphopning av radioaktivt 14C-2-deoxyglucose i hjernen skiver, mens PET gir i vivo bilder av regionale opptaket av radioaktivt 18 F-deoxyglucose. De har begge ulempen ved å bruke irradiative molekyler mens produsere lav-romlig oppløsning. To-fotonet mikroskopi gir mobilnettet oppløsning av fluorescerende sonder, men lysspredning av vev begrenser tenkelig dybden. Disse tre teknikker har brukt tidligere for å studere neuroenergetics i Red under whisker, stimulering,3,,4,,5,,6. I vivo MRS har doble fordelen av å noninvasive og nonradioactive, og alle hjernens struktur kan utforskes. Videre kan MRS utføres under neuronal aktivisering, en teknikk som kalles funksjonell MRS (fMRS), som har blitt utviklet nylig gnagere7. Derfor foreslått en protokoll for å overvåke hjernen stoffskifte under hjerne aktivitet av 1H-MRS i vivo og noninvasively. Prosedyren er beskrevet i voksen sunn rotter aktiveringen hjernen ved en luft blåse whisker stimulering direkte i en 7 T magnetisk resonans (MR) imager, men kan være tilpasset i genmodifiserte dyr, samt en patologisk tilstand .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med dyr eksperimentering retningslinjene i den europeiske samfunn rådsdirektiv av 24 November 1986 (86/609/EEC). Protokollen møtte etiske retningslinjer franske landbruks- og skoger og ble godkjent av de lokale komiteene (Comité d 'éthique pour L' expérimentation Animale Bordeaux n ° 50112090-A).
Merk: Under MR målingene, et tilstrekkelig nivå av anestesi og fysiologiske overvåking (kroppstemperatur, pustefrekvens) er uunnværlig.
1. dyr
- Bruk Wistar-hannrotter som veier mellom 350 og 450 g.
- Holde dem på en 12:12 h lys: mørke syklus og gi mat og vann ad libitum.
2. anestesi
- Forberede utstyret som trengs for anestesi (figur 1A, B, se Tabellen for materiale): en 5 mL sprøyte som inneholder medetomidine i fysiologisk saltløsning (240 µg/kg/h, med en perfusjonsmåling rate på 20 µL/min), en 0,5 mL sprøyte som inneholder atipamezole (20 μL, i 0,5 mL av saltvann) og øye ointment.
Merk: Holde alt utstyr under extractor panseret, unntatt 5 mL sprøyte som inneholder medetomidine, som er plassert i sprøytepumpen nær magneten for anestesi under MR oppkjøp. - Plasser rotta i induksjon kammeret, starte av bedøvelsen ved å levere 4% isoflurane, og justere infusjonshastigheten oksygen til 1,5 L/min.
- Evaluere dybden av anestesi ved å vurdere tilbaketrekking av pote reflekser.
- Når rotta ikke svarer til stimulering, ta den ut av boksen anestesi, plassere den på benken med nesen sin i isoflurane masken og vedlikeholde anestesi ved å levere 2,5% i oksygen på 1,5 L/min.
- Forsiktig massasje halen og plassere tilstrammende (figur 1 c).
Merk: Massasje kan utføres i varmt vann, med en temperatur mellom 38 og 42 ° C, for å få bedre vasodilatasjon av årer. - Sett den eksterne intravenøs kateter (22 G), tidligere heparinized, i venstre eller høyre hale blodåre. Merk at en venøs retur er observert (en dråpe blod er synlig på den distale del av nålen) når kateter er riktig satt inn (figur 1 d).
- Blåse ut eventuelle luftbobler i kateter dead space volumet ved hjelp av 2 mL sprøyte som inneholder fysiologisk saltløsning og heparin.
- Bruk øye ointment og forberede sprøyten som inneholder atipamezole (17 µg/mL) for å vekke rotta på slutten av eksperimentet.
3. rotte plassering i Magnet for Whisker stimulering
- Plasser en puste sensor på magnet sengen og deretter overføre rotta fra benken til sengen magnet. Plassere det i utsatt posisjon med nesen sin i isoflurane maske, med puste sensoren ligger mellom brystkasse og magnet sengen.
Merk: Alt utstyr som kommer inn i Mr rommet skal MRI-safe. - Reduser isoflurane (fra 4% til 1,5%-2%) under rotte plassering og bytte av bedøvelsen til medetomidine på slutten av denne fremgangsmåten. Kontroller at riktig kinnskjegg er gratis, kuttet den høyre kanten foran rotta MRI seng på forhånd å tillate flytting av kinnskjegg.
- Avholde rotta i posisjon med tape og overvåke dens puste som må være mellom 60 og 80 breaths per minutt.
- Gjøre et seil som fanger alle værhår i papir tape (figur 2). Juster det fleksible utløp av luft blåse langs rotta MRI seng slik at delen avslutter røret er vinkelrett og på rundt 1,5 cm fra seilet. Fikse det med papir tape.
4. whisker stimulering
- Koble den fleksible innløpsrøret fra en komprimert luft kilde (1 bar) til en magnetventil kontroll ventil inngang og utløp solenoid kontroll ventil utgang (Figur 3). Sikre at kontroll magnetventil forblir utenfor magnet rommet.
- Koble pulserende enheten i magnetventil og i magneten ved hjelp av transistor-transistor logikk (TTL)-port. Konfigurere den slik at pulserende frekvensen = 8 Hz, den pulserende tiden = 20 s, og den hvile tid = 10 s.
Merk: Disse parameterne, visualisert på liten flytende krystallklar utfoldelse (LCD) skjermen, er justerbar via de tre dedikert analogisk potentiometers. Elektronisk pulserende enheten, som styrer paradigmet, må være sammensatt av høy kvalitet elektroniske komponenter for å unngå eventuelle drift i tidsparametere (for riktig postprosessering).
5. fet fMRI oppkjøp
- Plasser rotte hjernen slik at den blir stående og bruk øret barer for å opprettholde den. Plasser volum matrise spolen over rottas hodet (figur 4A) og fikse det med tape. Kontroller at seilet er flytte riktig (anteroposterior bevegelse, ingen rotasjon og ingen friksjon av seil) når luften blåse systemet er slått på; deretter slå det av.
- Sett inn sengen og spolen i midten av magneten. Kontroller at seilet er fortsatt riktig når sengen er inne magneten når luften blåse-system er på; deretter slå det av. Bytte helt fra isoflurane til medetomidine (perfusjon rate: 20 µL/min).
- Sjekk at rotta er godt plassert med en lokalisering sekvens (TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; gjennomsnittlig = 1; repetisjon = 1; bit = 1 mm; bildestørrelse = 256 x 256; synsfelt (FOV) = 50 x 50 mm; søketid = 12 s 800 ms). Dra kategorien Localizer sekvens til instruksjon navn og klikk på Fortsett.
- Dra T2_Star_FID_EPI nummerserie-kategorien i instruksjon navn, senter FOV på midten av hjernen, og klikk kategorien justering plattform å åpne redigerte skanning instruksjon. Registrere kart B0 og videre til en skanning shim.
Merk: For B0 kart, bruker du følgende parametre: første ekko tid = 1.65 ms; TR = 20 ms, gjennomsnittlig = 1; snu vinkel = 30°; ekko avstanden = 3.805 ms; skive = 58 mm; bildestørrelse = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; søketid = 1 m 24 s 920 ms. For skanning shim, bruker du følgende parametre: voxel selektiv eksitasjon = STEAM Gaussian puls; TE = 5 ms; blande tid = 10 ms; oppkjøpet varighet = 204.8 ms; båndbredde = 10 000 Hz; holdetiden = 50 μs). - Starte T2 Star_FID_EPI sekvensen (TE = 16.096 ms; TR = 500 ms; gjennomsnittlig = 1; repetisjon = 600; bit = 1 mm; Fire påfølgende skiver; bildestørrelse = 128 x 128; FOV = 20 x 20 mm; båndbredde = 333,333.3 Hz; søketid = 5 min 00 s).
Merk: På grunn av TTL havnen, en ekstern utløser signal starter luft blåse-system samtidig. Paradigmet = [20 s aktivisering + 10 søvn] x 10, for den totale varigheten av 600 skanner, 500 ms per skanning. Sektorene er sentrert rundt midten av området for fat-feltet. - Kjøpe en ny lokalisering sekvens (samme som en beskrevet i trinn 5.3) for å sammenligne med det første og se om rotta flyttet under T2_Star_FID_EPI sekvensen.
- Bringe senga til sin opprinnelige posisjon, fjerne volum matrise spolen og koble overflaten spolen.
6. fet behandling
- Åpne filen T2 Star_FID_EPI og lese T2 Star_FID_EPI bildet i Bildet vises. Åpne vinduet oppstart av funksjonelle kontrolleren, kalt FunController.
- I denne behandlingen kategorien, Velg det tenkelig-vinduet, og Definer stimulering protokollen (varighet og veksling av On/Off perioder, tilsvarer paradigmet brukes).
- Velg vinduet protokollen (datasett med 600 rammens) og sett verdien av 40 i kategorien På periode og 20 i kategorien av perioden Klikk kategorien Inverter henvisning og dra glidebryteren Stimulering stater til venstre for å velge de verdien 1.
- I vinduet forbehandling Klikk på middelverdi-filteret i fly for forbehandling middelverdi-filteret (2D, 3D) for postprosessering.
- Klikk kategorien kjøre og dra pekere for å justere oppslagstabellen overlegg. Visualisere området aktivert hjernen (figur 4B).
7. proton MRS oppkjøp
- For å plassere riktig overflaten spolen, endre plasseringen av rotte hodet. Rotere hodet (ca 30° med klokken) slik at overflaten spolen (figur 5A) kan plasseres rett over venstre fat cortex samtidig vannrett og plassert midt magnet når inne magneten.
- Plasser overflaten spolen, fikse det på rotte hjernen med tape (figur 5B), og kontroller at seilet er flytte riktig (anteroposterior bevegelse, ingen rotasjon og ingen friksjon av seilet) når luften blåse systemet er slått på; deretter slå den av på hovedbryteren.
- Kontroller at seilet går riktig når sengen er inne magneten når luften blåse-system er på. Deretter slå det av.
- Sjekk rotta er plassert riktig bruker en lokalisering sekvens. Angi parametere som følger: TE = 2,5 ms; TR = 100 ms; gjennomsnittlig = 1; repetisjon = 1; bit = 1 mm; bildestørrelse = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm; søketid = 12 s 800 ms.
- Dra Localizer nummerserie-kategorien i vinduet instruksjon navn og klikk kategorien fortsette å kjøre skanningen programmet.
- Når hjernen lokalisering er korrekt dra kategorien T2_TurboRARE rekkefølge i vinduet instruksjon navn og klikk på Fortsett for å kjøre skanningen programmet. Disse anatomiske bilder, sammen med tidligere fet fMRI oppkjøpet, vil tillate den riktige lokaliseringen av voxel i S1BF MRS.
Merk: T2_TurboRARE parametrene er 14 skiver, 2 mm per sektor, FOV = 2,5 x 2,5 cm, TE = 100 ms, TR = 5000 ms, matrise = 128 x 128, sekvens tid = 2 min 40 s. - Flytter kategorien LASER sekvens til instruksjon navn -vinduet, plassere voxel (2 mm høy, 2,5 mm lang, 3 mm dyp) i sentrum av området S1BF.
- Bruk en rotten hjernen atlas og fet fMRI forbedringen for å lokalisere sonen på T2 bilder (figur 6). Klikk kategorien justering plattform å åpne redigerte skanning instruksjon. Klikk kategorien vingle og endre impedans (elektronisk lasting) på motta spole litt for å tune det. Klikk kategorien Bruk når kanalsøket er ferdig å lukke redigeringsprogrammet instruksjon og bruke endringene i redigerte instruksjon.
- Registrere kart B0 og Fortsett å skanne shim, og deretter utfører en lokal shim.
Merk: For B0 , bruker du følgende parametre: første ekko tid = 1.65 ms; TR = 20 ms, gjennomsnittlig = 1; snu vinkel = 30°; ekko avstanden = 3.805 ms; skive = 58 mm; bildestørrelse = 64 x 64 x 64; FOV = 58 x 58 x 58 mm; søketid = 1 m 24 s 920 ms. For skanning mellomlaget, bruker du følgende parametre: voxel selektiv eksitasjon STEAM Gaussian puls; TE = 5 ms; blande tid = 10 ms; oppkjøpet varighet = 204.8 ms; båndbredde = 10 000 Hz; holdetiden = 50 μs. For lokale mellomlaget, bruker du følgende parametre: vann undertrykkelse, damp oppkjøpet Varighet = 1,363.15 ms; poeng = 4 096; båndbredde i Hz = 3,004.81 Hz; båndbredde i ppm = 10 ppm; holdetiden = 166.40 μs; Spectral oppløsning = 0.37 Hz/poeng. LASER parametrene er: ekko tid = 19.26 ms; TR = 2500 ms; gjennomsnitt = 128 eller 32; søketid = 5 min 20 s eller 1 min 20 s; oppkjøpet poeng = 4 096. - Utføre 1H-MRS.
- Starte 1H-MRS oppkjøpet først i en hvile periode (4 x 32 LASER skanner + 128 LASER skanner, 2500 ms per skanne).
- Kjøpe en ny lokalisering sekvens (samme som en beskrevet i trinn 5.3) å sammenligne med den første registrert og sikre at rotta ikke flyttet under LASER oppkjøpet.
- Utføre 1H-MRS under whisker aktivering LASER sekvensen (4 x 32 LASER skanner + 128 LASER skanner, 2500 ms per scan) med luft blåse-system på (paradigme = 20 s aktivisering og 10 s hvile).
- Igjen, utføre en lokalisering sekvens for å kontrollere om rotta flyttet.
Merk: Antall skanninger og hvile/aktivert perioder kan tilpasses og endret, men alltid sikre at rotta ikke er flytting av regelmessig utfører en lokalisering sekvens.
- Bringe senga til sin opprinnelige posisjon, fjerne overflaten spolen og flytte rotta tilbake til benken. Sette inn atipamezole i en hudfold i rottes tilbake å reversere anestesi og vekke den.
8. proton MRS behandling
- Åpne programmet LCModel og klikk på den aktuelle fanen velger den riktige datatypen ( Gratis induksjon forfall -fil) og velg riktig fil. Klikk kategorien OK når dette er gjort.
- Optimalisere kvantifisering kontrollparameterne trinnvis.
- I delen Tittel manuelt angi en tittel og definere et tilstrekkelig ppm utvalg (f.eks, 0,2 til 4.0 ppm) ved manuelt å skrive inn nødvendige verdien i feltene.
- I grunnlag- delen, Velg og Last ned den nødvendige filen tilpasses Makromolekyl grunnlinjen riktig (det kan gis av programvareleverandøren).
- Definer og laste inn kontrollparameterne. Forberede lagre med alle nyttig filtyper på forhånd (tabell = kompakt tabeller; PS = nødvendig PostScript-utdata; CSV = format for regneark; KOORD = koordinater for tomter). Klikk kategorien RunLCModel for å starte LCModel kvantifisering.
- Define merkede metabolitter å generere statistikk.
Merk: LCModel gir metabolitten kvantifisering og anslår feil av en verdi kalt Cramér-Rao nedre grense (CRLB). En verdi med en CRLB < 15 regnes som en optimal kvantifisering. En CRLB > 25 angir en upålitelig verdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen tillater kvantifiseringen metabolitten svingninger under cerebral aktiveringen som oppnås ved riktig whisker stimulering direkte i magneten.
I denne studien var det overordnede målet med fet fMRI å sjekke at whisker stimulering var effektiv, visualisere aktivert S1BF området og finne riktig voxel for 1H-fMRS. Enheten bygget for whisker aktivisering er effektiv. Faktisk, når høyre værhår ble stimulert med hjemmelaget luft blåse-system, en positiv fet signal ble oppdaget i venstre fat cortex (figur 4B), også kalt S1BF, for feltet somatosensory fat (n = 8). Et positivt signal forsterkning ble oppdaget i venstre fat cortex i åtte av åtte rotter, mens bare bakgrunn ble oppdaget i høyre halvkuler. Når fet fMRI ble utført uten whisker stimulering, ble ingen signal forbedring observert i venstre eller høyre S1BF.
En sammenligning mellom anatomiske MR bilder og rotten hjernen atlas ordninger8kan aktivert hjernen området visualisert ved fet fMRI voxel plasseres i S1BF området, som aktiveres under whisker stimulering. Denne voxel ligger på tre påfølgende lysbilder (1 mm tykk) siden fat cortex er 3 mm lang. Når hjernen lysbildet er nesten delt inn i fire kvartaler, voxel ligger i øvre venstre kvartal på en ca 45° vinkel (figur 6).
Når paradigme for whisker stimulering var aktivert, en økning i laktat innhold ble observert i den venstre S1BF (figur 6, typisk spectra innhentet i en rotte). Bedre visualisere metabolske svingninger mellom hvile og aktivert perioder, en spektral subtraksjon ble utført (figur 6). Fra dette trukket fra spekteret, økningen i laktat innhold med hjernen aktivisering var visualisert mye enklere, mens i denne rat, N-acetylaspartate (NAA) signalet var litt redusert. Laktat økning i nevrale stimulering ble også observert på den spectral deconvolution (figur 7AB). Mens laktat toppen var knapt funnet på i vivo spekteret i ro, kunne LCModel Kvantifisere det (figur 7A) med nøyaktighet og god CRLB verdier. Faktisk, av 23 rotter, eneste spektrum hadde en CRLB verdi for laktat kvantifisering lik 24. Ingen var > 25. For alle andre spectra varierte verdiene mellom 3 og 19.
Variasjoner i laktat innhold i alle 23 rotter presenteres i Figur 8. Av 23 rotter, ble en nedgang i laktat innhold observert i en rotte. Det var en statistisk signifikant forskjell i laktat innhold mellom hvile og aktivert perioder (0.132 ± 0.012 og 0.163 ± 0,011, henholdsvis verdier slektninger til PCr + Cr innhold, sammenkoblet t-test, p = 0,0005 [parametrisk, tosidige] n = 23). Derfor ble en 31,6% ± 7,8% økning i laktat innhold målt under nevrale stimulering.
En liten nedgang i NAA innhold kan observeres i figur 6, som representerer typisk spectra innhentet i en dyr. Men variantsiden NAA var ikke signifikant (en 1,2% ± 1,2% nedgang ble målt, n = 23).
Figur 1: utstyr og trinnene for anestesi. (A) bilde av utstyret være forberedt før anestesi. (B) Isoflurane pumpe og induksjon kammer. (C) tilstrammende plassering. (D) bildet viser kateter er satt riktig inn; Merk dråpe blod i kateter nålen, som er et positivt tegn på en riktig sted i venen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Whisker stimulering. Greit værhår er fanget i et seil med papir tape. Seilet lar alle whiskers å bli stimulert samtidig med luft blåse-system, og derfor maksimerer neuronal aktivering av fat cortex. Utløpet av luft blåse-system (sort tube) bør plasseres rundt 1,5 cm og vinkelrett seilet. Sjekk utenfor magneten sørge seilet er bevegelige riktig ved å aktivere air blåse-system. Seilet må flytte på 8 Hz i en anteroposterior retning (ingen rotasjon). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Air blåse-system for whisker stimulering. (A) A fleksible rør kobler den komprimerte luften (B) kontroll magnetventil. En andre fleksible rør bringer pulserende luft fra solenoid kontroll ventil utdataene til seilet. Kontroll magnetventil er koblet til pulserende enheten, som styrer paradigmet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: fet fMRI. (A) volumet array coil plassering. Rotte hodet i vannrett stilling og blokkert av øret barer. Kontroller at seilet bevege seg fritt og ikke er blokkert av spolen eller MRI sengen. (B) en typisk fet signal i aktivert venstre fat cortex (rød pil). Ikke finner noe signal i kontralateral høyre halvkule (blå pil). Terskelen ligger på 76,5% av maksimal intensitetsverdien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: overflaten coil. (A) bilde av overflaten spolen brukt i denne studien. (B) overflate coil plassering. Rotte hodet må være litt slått slik at venstre fat cortex, og derfor overflaten spolen er plassert i midten av Mr sengen (hodet er slått i en vinkel på rundt 30°, et bra kompromiss mellom det korrekte plasseringen av venstre fat cortex for flater CE coil og gratis bevegelser av seilet i høyre kinnskjegg, som ikke skal blokkeres ved sengen Mr). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: typisk lokalisert 1H-MRS resten (blå spektrum) og under whisker aktivering (rød spektrum). Voxel (grønne firkanten) ligger i den venstre S1BF på anatomiske T2_TurboRARE bilder med rotte hjernen atlas ordninger og signal forsterkning på fet fMRI bilder. Spectral subtraksjon tegnes i svart. Laktat og N-acetylaspartate (NAA) topper er angitt på 1.32 og 2,02 ppm, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: typisk spectral deconvolution av MRS spectra. (A) Deconvolution av en 128-scan resten spektrum. (B) Deconvolution en 128-skanning aktivert spektrum. Rester, subtraksjon mellom eksperimentelle spektrum (rådata) og LCModel fit; MM = Makromolekyl; CR = kreatin + phosphocreatine; PCho + GPC = phosphocholine + glycerophosphocholine; NAA = N-acetylaspartate; Lac = laktat; GABA = γ-aminobutyric syre; Gln = glutamin; Glu = glutamat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: variasjoner i laktat innhold under hjernestimulasjon. Blå prikk: laktat innhold ved hvile, bestemmes av LCModel og i den kreatin + phosphocreatine innhold. Rød prikk: laktat innhold under whisker stimulering, bestemmes av LCModel og i den kreatin + phosphocreatine innhold. Forskjellen mellom aktivert og hvile, p = 0,0005, sammenkoblet t-test (parametrisk, tosidig), n = 23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fat cortex, også kalt S1BF for somatosensory cortex eller FAT-feltet er et område i kortikale laget IV som kan observeres med cytochrome c oksidase flekker9, og sin organisasjon er kjent siden det har vært stor grad beskrevet 10,11. En vibrissa er koblet til en fat, der rundt 19.000 neurons er organisert i en kolonne12. Whisker til fat cortex veien har flere fordeler. Først, den kan aktiveres i magneten ved hjelp av en MRI-kompatible luft blåse-system, som kan være lett hjemmelaget (for å sikre at den største delen av området S1BF, som samsvarer med ca størrelsen på voxel der MRS er utført, alle kinnskjegg er presset i et seil det innrømmer stimulering av maksimalt vibrissa). Andre rett whisker aktivering fører til venstre fat cortex aktivisering, og hjernen området ligger i somatosensory cortex, som tillater bruk av en høy-følsom overflate coil. Tredje er denne metoden av aktivereVinduer somatosensory cortex noninvasive sammenlignet elektrisk pote stimulering, den sistnevnte har ulempen ved å stimulere andre hjernen strukturer, inkludert noen i den høyre hjernehalvdelen13. Derfor er protokollen som brukes her den mest egnet til å utføre en i vivo, noninvasive og langsgående studere hjernen stoffskifte under cerebral aktivisering.
Valg av bedøvelse er viktig, som mange av bedøvelse skape nevrovaskulære kopling, hjernen metabolisme eller hjernen aktivitet14,15. For eksempel isoflurane, den vanligste bedøvelse brukes for MRI, fører til en tre-sixfold økning i hjernen laktat innhold15,16 og derfor bør ikke brukes i hjernen metabolske studier. Medetomidine er en α2-adrenoreceptor Agonistiske, som induserer pålitelig sedasjon, analgesi, muskelavslapping og anxiolysis17. Disse effektene kan tilbakeføres raskt ved hjelp av atipamezole, en α2-antagonist. Medetomidine er den beste kandidaten til å utføre funksjonelle studier i gnagere18 siden den har en svært lav innvirkning på fet signalet og laveste endringer i hjernen metabolitten innholdet.
Det er også viktig å følge whisker aktivisering paradigmet riktig. Siden NMR oppkjøp siste minuttene, er bruk av påfølgende aktivisering/hvileperioder avgjørende for å begrense desensitization av nerveceller i området aktivert hjernen. Parameterne for dette paradigmet (20 s aktivisering etterfulgt av en hvileperiode 10 s) ble valgt for å oppnå høyeste fet fMRI signalet i tilsvarende fat cortex. Mye omsorg må tas å respektere disse tidsvinduene siden det er viktig å bestemme aktivert/hvileperiode for fet behandling, selv om det er kontrollert av TTL porten. For å få høy fat cortex aktivisering, seilet at grupper kinnskjegg sammen er også viktig siden den største delen av området S1BF å bli stimulert. Mye omsorg må tas for å plassere stikkontakt luft røret foran dette seilet slik at det kan flytte på en anteroposterior fly. Frekvensen må være nøye kalibrert siden har det vært vist at nervecellene i fat cortex er aktivert når whisker stimulering frekvens er mellom 5 og 15 Hz19. Bruke en lavere eller høyere frekvens vil ikke føre til aktivering av S1BF området.
Protokollen som brukes i denne studien gjør det mulig å sammenligne spectra i samme hjernen område i ro og under hjernen stimulering, og derfor å overvåke metabolske endringer knyttet til cerebral aktivisering. Det er viktig å utføre en lokalisering sekvens i begynnelsen og slutten av NMR spektroskopi protokollen, for å sikre at dyret ikke flyttet, og at forskjellene i metabolske innholdet mellom landene i hvile og aktivert på grunn av hjernen stimulering og ikke bevegelse gjenstander.
Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, en økning i laktat innhold ble målt mellom hvile og aktivert perioder. Laktat økning bruker i vivo NMR spektroskopi under hjernen aktivering ble først observert i mennesker i tidlig på 1990-tallet20,21. Men ble de fleste målinger utført i mennesker i stedet for gnagere, der signal-til-støy forholdet er mye lavere. I rotte, ble ex vivo NMR kvantifisering av laktat under rotte hjernen aktivering utført av Mazuel et al. 22, som observert en økning i hjernen laktat innhold med neuronal aktivisering. Resultatene presenteres her viser at laktat ble økt under whisker aktiveringen. Men siden lokaliserte MRS ikke tillater mobilnettet oppløsning, er det fortsatt ukjent fra hvilke mobilnettet kupé laktat kommer (nerveceller eller astrocyttene). For å gå videre i forståelsen av cerebral metabolske utveksling, som fortsatt omdiskutert ANLSH (astrocytter-Nevron laktat shuttle hypotese), har denne protokollen skal brukes genmodifiserte dyr for de viktigste komponentene i denne Flyplasstransport, som den monocarboxylate transportører.
I studien beskrevet her, ble ingen statistisk signifikant forskjell i NAA innhold observert. En nedgang i NAA innhold under visuell stimulering var tidligere funnet i mennesker23,24,25, men ikke bekreftet av Mangia og Tkac26. I denne studien observerte vi en økning i NAA innhold under hjernen aktivisering i 50% av rotter og en nedgang i andre halvår. NAA bør derfor unngås som intern referanse for kvantifisering under funksjonelle fru ingen andre varianter i metabolitten innhold ble oppdaget.
Begge laktat og NAA varianter under neuronal aktivisering har førte til kontroverser,23,,26,,27,,28,,29. For å fremme vår forståelse av disse metabolske svingningene knyttet til hjerneaktivitet, ville det være interessant å bruke denne protokollen på transgene dyr. Dette vil gi ytterligere informasjon om underliggende prosessen. Samlet, lokalisert 1H-MRS under en oppgave eller funksjonelle MRS29, er en ny teknikk i gnagere, relevant for studiet av regionale dynamiske endringer i metabolitter, i normal eller patologisk hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den LabEx STIEN grant, referanse ANR-10-LABX-57 og en fransk-Swiss ANR-FNS gi referanse ANR-15-CE37-0012. Forfatterne takker Aurélien Trotier hans kundestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL syringe with needle | Becton, Dickinson and Company, USA | 2020-10 | 0.33 mm (29 G) x 12.7 mm |
| 1H spectroscopy surface coil | Bruker, Ettlingen, Germany | T116344 | |
| 7T Bruker Biospec system | Bruker, Ettlingen, Germany | 70/20 USR | |
| Arduino Uno based pulsing device | custom made | ||
| Atipamezole | Vétoquinol, S.A., France | V8335602 | Antisedan, 4.28 mg |
| Breathing mask | custom made | ||
| Eye ointment | TVM laboratoire, France | 40365 | Ocry gel 10 g |
| Induction chamber | custom made | 30x17x15 cm | |
| Inlet flexible pipe | Gardena, Germany | 1348-20 | 4.6-mm diameter, 3m long |
| Isoflurane pump, Model 100 series vaporizer, classic T3 | Surgivet, Harvard Apparatus | WWV90TT | from OH 43017, U.S.A |
| Isoflurane, liquid for inhalation | Vertflurane, Virbac, France | QN01AB06 | 1000 mg/mL |
| KD Scientific syringe pump | KD sientific, Holliston, USA | Legato 110 | |
| LCModel software | LCModel Inc., Ontario, Canada | 6.2 | |
| Medetomidine hydrochloride | Vétoquinol, S.A., France | QN05CM91 | Domitor, 1 mg/mL |
| Micropore roll of adhesive plaster | 3M micropore, Minnesota, United States | MI912 | |
| Micropore roll of adhesive plaster | 3M micropore, Minnesota, United States | MI925 | |
| Monitoring system of physiologic parameter | SA Instruments, Inc, Stony Brook, NY, USA | Model 1025 | |
| NaCl | Fresenius Kabi, Germany | B05XA03 | 0.9 % 250 mL |
| Outlet flexible pipe | Gardena, Germany | 1348-20 | 4.6-mm diameter, 4m long |
| Paravision software | Bruker, Ettlingen, Germany | 6.0.1 | |
| Peripheral intravenous catheter | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | SP500930S | 22 G x 1", 0.85x25 mm, 35 mL/min |
| Rat head coil | Bruker, Ettlingen, Germany | ||
| Sodic heparin, injectable solution | Choai, Sanofi, Paris, France | B01AB01 | 5000 IU/mL |
| Solenoid control valves, plunger valve 2/2 way direct-acting | Burkert, Germany | 3099939 | Model type 6013 |
| Terumo 2 ml syringe | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | SY243 | with 21 g x 5/8" needle |
| Terumo 5 mL syringe | Terumo, Shibuya, Tokyo, Japon | 05SE1 | |
| Wistar RJ-Han rats | Janvier Laboratories, France |
References
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55, 1251-1262 (2007).
- Pellerin, L., Magistretti, P. J. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10625-10629 (1994).
- Cholet, N., et al. Local injection of antisense oligonucleotides targeted to the glial glutamate transporter GLAST decreases the metabolic response to somatosensory activation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 404-412 (2001).
- Voutsinos-Porche, B., et al. Glial Glutamate Transporters Mediate a Functional Metabolic Crosstalk between Neurons and Astrocytes in the Mouse Developing Cortex. Neuron. 37, 275-286 (2003).
- Zimmer, E. R., et al. [18F]FDG PET signal is driven by astroglial glutamate transport. Nature Neuroscience. 20 (3), 393-395 (2017).
- Haiss, F., et al. Improved in vivo two-photon imaging after blood replacement by perfluorocarbon. The Journal of Physiology. , (2009).
- Mullins, P. G. Towards a theory of functional magnetic resonance spectroscopy (fMRS): A meta-analysis and discussion of using MRS to measure changes in neurotransmitters in real time. Scandinvian Journal of Psychology. 59, 91-103 (2018).
- Rat Brain Atlas. , Available from: http://Labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas/ (2018).
- Wong-Riley, M. T., Welt, C. Histochemical changes in cytochrome oxidase of cortical barrels after vibrissal removal in neonatal and adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77, 2333-2337 (1980).
- Petersen, C. C. The functional organization of the barrel cortex. Neuron. 56, 339-355 (2007).
- Cox, S. B., Woolsey, T. A., Rovainen, C. M. Localized dynamic changes in cortical blood flow with whisker stimulation corresponds to matched vascular and neuronal architecture of rat barrels. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13, 899-913 (1993).
- Feldmeyer, D. Excitatory neuronal connectivity in the barrel cortex. Frontiers in Neuroanatomy. 6, 24 (2012).
- Boussida, S., Traore, A. S., Durif, F. Mapping of the brain hemodynamic responses to sensorimotor stimulation in a rodent model: A BOLD fMRI study. PLoS One. 12, e0176512 (2017).
- Heinke, W., Koelsch, S. The effects of anesthetics on brain activity and cognitive function. Current Opinion in Anesthesiology. 18, 625-631 (2005).
- Horn, T., Klein, J. Lactate levels in the brain are elevated upon exposure to volatile anesthetics: a microdialysis study. Neurochemistry International. 57, 940-947 (2010).
- Boretius, S., et al. Halogenated volatile anesthetics alter brain metabolism as revealed by proton magnetic resonance spectroscopy of mice in vivo. Neuroimage. 69, 244-255 (2013).
- Sinclair, M. D. A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice. Canadian Veterinary Journal. 44, 885-897 (2003).
- Weber, R., et al. A fully noninvasive and robust experimental protocol for longitudinal fMRI studies in the rat. Neuroimage. 29, 1303-1310 (2006).
- Hartmann, M. J., Johnson, N. J., Towal, R. B., Assad, C. Mechanical characteristics of rat vibrissae: resonant frequencies and damping in isolated whiskers and in the awake behaving animal. The Journal of Neuroscience. 23, 6510-6519 (2003).
- Prichard, J., et al. Lactate rise detected by 1H NMR in human visual cortex during physiologic stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 5829-5831 (1991).
- Sappey-Marinier, D., et al. Effect of photic stimulation on human visual cortex lactate and phosphates using 1H and 31P magnetic resonance spectroscopy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 12, 584-592 (1992).
- Mazuel, L., et al. A neuronal MCT2 knockdown in the rat somatosensory cortex reduces both the NMR lactate signal and the BOLD response during whisker stimulation. PLoS One. 12, e0174990 (2017).
- Castellano, G., et al. NAA and NAAG variation in neuronal activation during visual stimulation. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 45, 1031-1036 (2012).
- Sarchielli, P., et al. Functional 1H-MRS findings in migraine patients with and without aura assessed interictally. Neuroimage. 24, 1025-1031 (2005).
- Baslow, M. H., Hrabe, J., Guilfoyle, D. N. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 32, 235-245 (2007).
- Mangia, S., Tkac, I. Dynamic relationship between neurostimulation and N-acetylaspartate metabolism in the human visual cortex: evidence that NAA functions as a molecular water pump during visual stimulation. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 245-248 (2008).
- Baslow, M. H., Hrabal, R., Guilfoyle, D. N. Response of the authors to the Letter by Silvia Mangia and Ivan Tkac. Journal of Molecular Neuroscience. 35, 247-248 (2008).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 347-350 (2018).
- Bak, L. K., Walls, A. B. CrossTalk opposing view: lack of evidence supporting an astrocyte-to-neuron lactate shuttle coupling neuronal activity to glucose utilisation in the brain. The Journal of Physiology. 596, 351-353 (2018).
