Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

חדש נייד במבחנה חשיפה קלטת לדיגום אירוסול

Published: February 22, 2019 doi: 10.3791/58916
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Life Science Engineering, Virginia Commonwealth University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע חשיפות תרסיס סלולרי נייד ולמדוד את תגובת תאי. השיטה משתמשת בתאים, גדל הממשק אוויר נוזלי, מחקה ויוו פיזיולוגיה. תגובה תאית nanoparticle נחושת אירוסולים נצפתה כמו לחץ חימצוני באמצעות הדור מינים חמצן תגובתי cytotoxicity כמו שחרור לקטט דהידרוגנאז.

Abstract

פרוטוקול זה מציג במבחנה חשיפה מערכת חדשה, מסוגל להיות שחוקים, כולל אפיון והביצועים שלו. ממשק אוויר נוזלי (עלי) במבחנה חשיפה מערכות לעיתים קרובות מגושם, יצירת תחבורה שדה ומבצע במקור של פליטת או בתוך האזור נשימה קשה וגדולים. דרך המזעור של מערכות אלה, ניתן להביא את המעבדה לשדה, לזירוז זמן עיבוד ואספקת שיטה מתאימה יותר חשיפה זה אינו משנה את תרסיס לפני פנייה אל התאים. הנייד במבחנה חשיפה קלטת (PIVEC), מסתגל קלטת מסנן 37 מ מ כדי לאפשר במבחנה רעילות בדיקות מחוץ סביבה מעבדה מסורתיים. PIVEC התאפיינה באמצעות שלושה גדלים של חלקיקים נחושת כדי לקבוע יעילות התצהיר בהתבסס על gravimetric ניתוח ריכוז מספר החלקיקים. Cytotoxicity הראשונית הניסויים בוצעו עם תאי הריאות חשופות כדי לקבוע את היכולת של המערכת הפקדת חלקיקים תוך שמירה על התא הכדאיות. PIVEC מספק יעילות דומה או מוגבר התצהיר בהשוואת להתקני זרימה בניצב זמין במבחנה חשיפה. למרות התפוקה דגימה נמוך יותר, גודל קטן נותן כמה יתרונות ה הנוכחי במבחנה עלי חשיפה מערכות. אלה כוללים את היכולת להיות משוחק לניטור אישי, ניידות מהמעבדה כדי מקור פליטה, ואת האפשרות שיבנו מערכות מרובות עבור רזולוציה מרחבית תוך שמירה על משתמש התחתון עולה. PIVEC הוא מסוגל איסוף אירוסולים בשדה, בתוך האזור נשימה אל אוויר-לממשק, במבחנה מודל מערכת.

Introduction

דגימה אישי תוך שימוש בטכניקות במבחנה יכול לספק מידע מקיף על האפקטים הביולוגיים של אירוסולים במקום העבודה. 1 חשיפות מזהמים באוויר כוללים חשיפות הכימיקל עצמו, את הדגימות שנאספו אוויר, בתנאים המשוקע שבו הגז היא הציגה התליה תא, חשיפות לסירוגין באמצעות מכשיר כמו כיסא נדנדה, או ישירה חשיפות-הממשק אוויר נוזלי (עלי). 2 רבים של טכניקות אלה מבוצעים עם תאים גדל ההשעיה או האוסף של דוגמאות לפני החשיפה, שכל אחד מהם יכול להשפיע על המחקר רעילות עקב שינויים פוטנציאליים בתרסיס. 3 כדי למנוע שינויים אלה, המעבדה ניתן להביא לשדה באמצעות מספר במבחנה עלי תרבות החשיפה מערכות המשמשות בספרות,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 . עם זאת, מעטים הם זמינים מסחרית. 8 , 9 , 12 מערכות אלה לעיתים קרובות מגושם, במיוחד כאשר כולל מכשירים לווסת טמפרטורה, לחות של הסביבה התאית, קצב הזרימה של מדגם בתרסיס. באמצעות את PIVEC, תרסיס חשיפות ניתן לבצע מחוץ סביבה מעבדה מסורתי או בתוך האזור הנשימה בזמן מחקה שאיפה תנאים.

הקביעה של תרסיס התצהיר במבחנה חשובה החקירה של השפעות בריאותיות כתוצאה מהשאיפה. אזור הנשימה, שטחה של 30 ס מ הפה והאף,14 חיוני להבנת את החשיפה חלקיקים ולשם קישור בין האפקטים הביולוגיים של הריאות. 2 לעתים קרובות, התצהיר על תאים מוגדר על יעילות התצהיר, החלקיקים הנמסרים, נלקח על ידי התאים מחולק החלקיקים מנוהל מערכת ה-6,15 או על בסיס המוני של כמויות זהה. 4 , 16 השיטות למדידת אירוסולים באזור נשימה הן מסנן המבוסס, לכידת חלקיקי על פני תקופה דגימה נתון ושימוש המסננים לערוך בדיקה נוספת. 17 ניטור אישי מחייב מערכת קטנה שמגיע עם עסקת החליפין של דגימות פחות.

קיימות גישות רבות כדי לקבוע את ההשפעות הבריאותיות מחשיפה תרסיס. המודל עלי מאפשר בתרסיס להינתן ישירות לתאים באוויר כמו תרחיש חשיפה אמיתית, אך היא חסכונית יותר, פחות זמן אינטנסיבי יותר ויוו לומד תוך כדי לחקות את המחסומים אוויר נוזלי כגון העיניים, העור והריאות. ריאות תאים גדל את עלי יש את היכולת ליצור שכבה מכשול מקוטב,18,19 אשר מייצרת תכונות פיזיולוגיות הדומות ויוו ריאות האפיתל, כולל ייצור ריר, חומרים פעילי שטח ספציפי שורות תאים הסמפונות או מכתשי, cilia מכות, צמתי צר19 , קיטוב20 ותא19,. 18 משתנה כגון אלה יכולים להשפיע על התגובה התאית נמדד מחקרי רעילות. 21 . בנוסף, עלי במבחנה דגם תוצאות הם לעתים קרובות יותר רגישה תאים נחשפו באמצעות מודלים ההשעיה22 ואין מסוגלות כדי דגם חריפה ויוו שאיפת רעילות. 23 , 24 . לפיכך, מערכת חשיפה עלי כי הוא מסוגל לבצע מדידות בתוך האזור נשימה היא צעד הבא טבעי.

על ידי חשיפת התאים תרסיס ישירות על מקור פליטה, חקירת ההשפעות של גזים, תרכובות נדיפות למחצה, וכל חלקיקי מעורב בתערובת מתרחשת. כאשר התערובת נאסף על מסנן, תרכובות נדיפות של גזים לא נתפס, לא יכול לחקור את כל התערובת. בנוסף, שיחזור של חלקיקי אבקה או השעיה נוזלי יכול להוביל צבירת או אינטראקציות חלקיקים-נוזל, כגון פירוק, ההשעיה נוזלי. 25 , 26 כאשר חלקיקי אירוסול מתווספים הנוזל, קיים פוטנציאל גבוה יותר עבור הצטברות,25,27 היווצרות של חלבונים קורונה,28 או אינטראקציה עם תרכובות בתוך הנוזל, אשר יכול להשפיע על התצהיר, להשפיע על התגובה הביולוגית. 29 , 30

חשיפה-עלי מבוססת על שלושה פרופילים תרסיס הראשי, ענן שיקוע, במקביל זרימה וזרימה בניצב. ענן להתיישב, בשימוש על ידי חשיפה תא ממשק אוויר נוזלי (אליס),4 היא מערכת אצווה שבו חלקיקים להפקיד באמצעות כוח הכבידה, diffusional מסתדר כמו בתרסיס היא כאל יחידה אחת. זרם מקבילים, המשמש את תרסיס אלקטרוסטטית במבחנה חשיפה מערכת (המרזבים)5 ו Multiculture חשיפה קאמרית (MEC) II,6 מאפשר התצהיר באמצעות התוספת של תנועה בראונית דרך הפרופיל זרימה. זרימת בניצב, בשימוש על ידי microsprayer,7 ננו תרסיס קאמרית In-Vitro רעילות (NACIVT),11 , מסחרי עלי מערכות8,9,10,12, מוסיף את פקק של חלקיקים בתוך אזור התצהיר. רבות ממערכות אלה חשיפה וגדולים מגושם, הדורשים מערכות עודף עבור תרסיס מראש מיזוג, משאבות הזרימה, או אפילו חימום לשכות דגירה של תאים. גודל גדול זה מקטין הניידות של המערכת. במקום דגימה ישירות על מקור פליטה, מערכות אלו לעתים קרובות יש דוגמאות הובא אירוסולים מעבדה או מודל שנוצר לצורך ניתוח. אסור לאבד את המורכבות בתרסיס הנפלט בתרגום מן השדה למעבדה. PIVEC הוא קטן יותר מאשר המערכות הקיימות, עם שטח פני השטח החיצוניים של 460 ס מ2 , במשקל 60 גרם בלבד, עם חום ולחות שולבו מערכת המאפשרת להתקן נייד במיוחד. ירידה בגודל ובמשקל לאפשר למערכת להיות שחוקים או נלקח למקור של חשיפה, המתיר דגימה ישירה.

גודלו של מערכות החשיפה הנוכחית גם פוחתת היכולת לבצע דגימה לחקור את מרחבי מעברי צבע בריכוזים. החלטה זו היא המפתח בעת החלטה על תופעות רעילות של פוטנציאל סביבתיים רבים, סיכון מקצועי כגון פליטה לרכבים חלקיקי החומר או מקום העבודה פעילויות שבו מתרחשת חשוד. מיד לאחר פליטה, הופך שם שונות מרחבית בריכוז החלקיקים. זה גדל עם הזמן כפי החלקיקים לפזר ברחבי האטמוספירה ולשנות אפקטים אלה בהתבסס על תנאי הסביבה, כגון טמפרטורה, לחץ, רוח, שמש. חלקיקים יכולים להתחיל בגיל, נישחק גם פעם הנפלט31,32 , פיזור המחירים המושפעים הטופוגרפיה; ריכוז גבוה ניתן למצוא קניונים ומנהרות, שבו פיזור האפקטים הם האטה, ריכוז נמוך יותר ניתן למצוא איפה יש אזור גדול עבור פיזור. 33 שינויים אלה של פיזור המחירים יכול להיות השפעות משמעותיות על בריאות האדם, ניתן לראות כאשר משווים את המספר של אסתמה מבוגרים המתגוררים עירוני לעומת הכפרי. 34 בעוד מערכות חשיפה רבות לספק דוגמאות מרובים בבת אחת, מערכות מרובות נחוצים עם שפע של ציוד גדול לביצוע רזולוציה מרחבית.

על ידי הבאת מהמעבדה לשדה, הניתנות להפחתה הזמן של ניתוח על-ידי שימוש את כל התא חיישן. בעקבות מנגנונים ביולוגיים ידוע ונקודות קצה יכול לסייע בקביעת הרכב תרסיס ואת גודל. בשל שיטות הסיווג איטי, לרבות בשחרור ליחה, phagocytosis רוברטסונית, חלקיקים אלה לעיתים קרובות אינטראקציה עם תאים כ ימים עד שבועות3 יוצר סטרס חמצוני, דלקת, אפילו מוות של תאים. אלה נקודות קצה ביולוגי יכול להיות נקודות המוצא עבור תוצאה שלילית מסלולים עבור מחלות לב וכלי דם או מחלת ריאות חסימתית כרונית. בנוסף, Wiemenn. et al. לבצע מגוון של מבחני במבחנה כדי להשוות ערכים ספרות לטווח קצר ויוו שאיפת רעילות. 35 In vivo התגובה היה חזה עם שניים מתוך ארבעת תוצאות חיוביות של בדיקות cytotoxicity באמצעות שחרור לקטט דהידרוגנאז, סטרס חמצוני של הפחתת גלוטתיון היווצרות מימן על-חמצני ושחרור, דלקת אפשרית מן הגן הגידול נקרוזה מקדם אלפא. מתוך עשר nanosized תחמוצות מתכת נבדק, שש נבדק כמו פעיל (טיטניום אוקסיד, תחמוצת אבץ ו תחמוצת צריום שונות ארבעה) באמצעות חשיפות בתוך חוץ גופית עם אישור ויוו. 

על מנת לחקור את ההשפעות של אירוסולים בסביבה תעסוקתית, המעבדה שלנו פיתח את PIVEC עבור חשיפות בשטח. בנוסף, PIVEC יכול להיות משוחק על דגימה אישי לפקח ולחקור שאיפת חשיפה כמו קלטת מסנן36 37 mm או מערכות מרובות ניתן להשיג רזולוציה מרחבית בתוך אזור נתון. ב פרוטוקול זה, אפיון ושימוש PIVEC הנדונה. לאחר החשיפה, השפעות ביולוגיות הם נצפו דרך מבחני cytotoxicity.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מפעילי חייב ללבוש ציוד מגן אישי (למשל חלוק, כפפות, משקפי מגן) בעת ביצוע שלבים 1, 2, 3, 5 ו- 6.

1. הכנה של חומרים

  1. להכין חומרים עבור מכלול המערכת ולהבטיח חשיפה הדיר.
    1. ודא שימוש חדש 70% אתנול ניקה ¼" הקוטר הפנימי מוליך צנור ו- ¼" הקוטר החיצוני למחברי או עבור מכלול המערכת.
    2. מאגר חומרים מבחן כולל מסננים, PIVEC רכיבים, פינצטה, אבקות חלקיקים בסביבה מבוקרת היטב, לגבי טמפרטורה, לחות, במשך לפחות 24 שעות לפני הניסוי.
      הערה: הטמפרטורה צריכה להיות קרוב לטמפרטורת החדר, כ 20 ° C, עם לחות יחסית פחות מ- 35%. זה חשוב מאוד להשיג את הדיר בין ניסויים.
    3. להכין את מוני חלקיקים באמצעות אלכוהול איזופרופיל לנקות חלקים ולאפשר מערכת החימום על-פי המלצות היצרן, כולל ניידות סריקה של חלקיקים סייזר (SMPS), חלקיקים אופטיים סייזר (OPS) למדידה.

2. דור של תרסיס יבש

הערה: מפעילי יש לבצע תרסיס דור בשכונה fume.

  1. להרכיב מערכת להפקת אירוסולים יבש
    הערה: התליה של חלקיקי גז או נוזל צריך להיות מתאים התרבות מעוצבת של יישום, תא. השיטה הבאה יכולה להתבצע באמצעות תרסיס בנוזל. העיצוב של המערכת תרסיס יבש הוא מפני אש ואח. 37 סכימטי של מערכת פיזור יבש מוצג באיור1.
    1. את ברז להתחבר בכל קצה של גודל השחיל הצינור 4" 1/8, זה ישמש הופר חלקיקים. להתחבר 2" 1/8 גודל צינור ברז אחד.
    2. שוקל חלקיקים נחושת, במחקר זה ריכוז מסה עבור כל גודל החלקיקים נשמר קבוע תוך קביעת היעילות התצהיר. להשתמש 7.5 מ"ג של 40 ננומטר נחושת חלקיקים, 7 מ"ג של חלקיקים nm נחושת 100 מ"ג 13 של חלקיקים 800 nm נחושת לכל חשיפה. למקם את חלקיקי נחושת הופר חלקיק דרך הקצה הפתוח.
      הערה: כמות חלקיקי נחושת שקל ישמש המיסה מבוסס ריכוז מנוהל.
    3. המקום של 3" פיסת הקוטר החיצוני (OD) אבובים ½" סביב צינור 2" המקום HEPA מסנן בתוך צנור קצר זה כך כיוון הזרימה היא דרך ברז.
    4. להתחבר הגנרטור ואקום שסתום כדור אחרים באמצעות שרשור. להתחבר ואקום גנרטוריים מיכל אוויר על-ידי הצבת של "5/16" OD צינורות לתוך הקשר דחיפה-כדי-lock. השתמש OD אבובים ¼" כדי להתחבר לשקע של הגנרטור ואקום הסידור ניסיוני על ידי הנחת הצנרת מעל השקע של הגנרטור ואקום.
  2. השימוש במערכת תרסיס יבש כדי ליצור תרסיס יבש
    1. לפתוח את המיכל אוויר על-ידי סיבוב שמתחזקים את הברז הראשי ולאפשר זרימת אוויר למערכת. לפתוח את השסתום על המתקן זרימה על המיכל אוויר, להגדיר כך הזרימה דרך המערכת שווה ההגדרות הרצויות על המשאבה ואקום.
    2. פתח את ברז הקרוב מסנן HEPA ולאחר מכן לפתוח את ברז ואקום גנרטוריים הקרוב ביותר. פקח אלה עבור 3 s כדי לאפשר חלקיקים ששולפים לתוך זרם האוויר.
    3. לסגור את ברז הקרוב ואקום מחולל ולאחר מכן לסגור ברז הקרוב מסנן HEPA. לאפשר האוויר ממיכל לזרום משך זמן הניסוי לפי הצורך.
    4. סגור שסתומים הראשי, הרגולטור על מיכל אוויר כדי לעצור את הזרימה. נקי כדוריים, ואקום גנרטוריים באמצעות אתנול 70%. אוטוקלב צינורות מתכת עבור עיקור.

3. בתצהיר היעילות מדידה באמצעות PIVEC

הערה: מפעילי יש לבצע חשיפות תרסיס בשכונה fume.

  1. למדוד את התצהיר על ידי איסוף בתרסיס nanoparticle נחושת שנוצר בשלב 2.2 על מסנן קדם שנשקל. השתמש את המינון הופקדו, נמדד באמצעות המסה שנאספו על המסנן, והמנה מנוהל, נמדד באמצעות כמות החלקיקים נחושת שנשקל, כדי לקבוע את היעילות התצהיר.
    1. שמור 1.00 מיקרומטר נקבובית זכוכית סיבים מסננים בתנאים לחות נמוכה, שמתואר 1.1.2, במשך לפחות 24 שעות לפני טרום חשיפה מדידות. שוקל מסנן בשימוש שלוש פעמים ולהקליט את המשקולות מסנן. המקום למסנן שאינם בשימוש של תרבות תא הכנס.
    2. בחר תאים מתאים לתרבות הוספה מתאם (6 טוב או טוב 24) עבור PIVEC לתמוך את תותב התרבות תאים עם המסנן. המקום התרבות התא להוסיף מתאם פיסת על הבסיס PIVEC, הגדרת למקום כזה כי הבסיס של היצירה מתאם הוא רחב יותר למעלה.
    3. שימוש פינצטה כדי למקם תרבית תאים מסנן נטען להוסיף בתוך חתיכת מתאם. מניחים את החלק העליון על גבי פיסת מתאם, להתיישב במקום כזה כי הבסיס של החלק העליון הוא רחב יותר למעלה. עוטפים PIVEC עם שכבה אחת של דבק.
    4. להתחבר 37 mm חתיכות קלטת על החלק העליון והתחתון של PIVEC על ידי דחיפת למקומו. מניחים ¼" תיל מתאמי כניסת קלטות ו עודפים.
    5. לעטוף את החימום resistive סביב PIVEC כך החוטים הם בבסיס. הקלטת כדי לאבטח.
    6. עוטפים PIVEC עם ~ 8 סיבובים של רדיד אלומיניום לבידוד. לאבטח עם קלטת.
    7. לחבר 2" חתיכה ארוכה של 1/2" הקוטר החיצוני גמיש אבובים על המתאם על גבי PIVEC. הסר אבובים מגומי נקבובי במים סטריליים ומקום בתוך צינורות על גבי PIVEC.
    8. מקום PIVEC בתוך המלחציים על הדוכן טבעת ומאובטח. הגדרת להשלים עם משאבת ואקום, מוני חלקיקים, הגדרת תרסיס.
      הערה: המינון הופקדו המבוססת על מספר יכול להיקבע רק אם מוני חלקיקים ממוקמים לפני את PIVEC ואחרי את PIVEC על מסלולים נפרדים.
    9. חושפים את המסננים באמצעות שלב 2.2 פרוטוקול, זמן החשיפה הרצויה וקצבי זרימה, במחקר זה שזמן החשיפה של 10 דקות-0.5 LPM שימש. הסר PIVEC הסידור. להוציא את תותב תרבות תא ולמקם את המסנן חשוף בעל מסנן תחת תנאי לחות נמוכה לפחות 24 שעות לפני מדידות.
    10. PIVEC נקי עם 70% אתנול. לחטא עם האור האולטרה סגול במשך לפחות 30 דקות לפני הניסוי הבא.
    11. שוקל את המסנן חשוף שלוש פעמים ולהקליט את המשקולות מסנן. מקם את המסנן חשוף בעל מסנן תוויות עבור אחסון.

4. חישוב של הפקיד מינון ויעילות התצהיר

הערה: הידע של העדות הוא חשוב עבור המינהל תרסיס ופרשנות של תגובת תאי.

  1. לחשב את התצהיר של מדידות מבוסס-מסה
    1. לחשב את המסה הופקדו על מסנני כהפרש בין משקל ממוצע טרום חשיפה לבין משקל ממוצע לאחר חשיפה. ערך זה הוא המינון הופקדו מבוסס-מסה לניסוי.
    2. שימוש מנוהל מסה, מ'admin, המבוסס על מסה שהופקדו המינון נקבע 4.1.1, זה-dep, כדי לחשב את היעילות התצהיר מבוסס-מסה, ηמ', לניסוי.
      Equation
    3. ממוצע של ערכים מן 4.1.1 4.1.2 לניסויים לפחות 3 לקבוע התצהיר ויעילות התצהיר עבור PIVEC עבור גודל החלקיקים.
  2. לחשב את התצהיר של המבוססת על מספר מדידות
    1. ודא כי מדידות עם מוני חלקיקים בוצעו עם מוני לאחר את PIVEC, כדי לקבוע ריכוז החלקיקים לפני PIVEC. לשלב את ריכוז החלקיקים לאורך זמן עבור המונה חלקיקים ואז לשלב מעל קוטר של חלקיקים כדי לקבוע את הסכום הכולל חלקיקים נמדד.
    2. לחשב את מספר החלקיקים הופקדו כהפרש בין החלקיקים מנוהל חלקיקים למדוד את הפוסט-PIVEC. ערך זה הוא המינון הופקדו המבוססת על מספר לניסוי.
    3. שימוש מנוהל חלקיקים, nadmin, המבוססת על מספר להפקיד במינון ndep, ספיקה, V, זמן, t, כדי לחשב את התצהיר המבוססת על מספר יעילות, ηn, לניסוי.
      Equation
    4. ממוצע של ערכים 4.2.2 ו 4.2.3 לניסויים לפחות 3 לקבוע התצהיר ויעילות התצהיר עבור PIVEC עבור גודל החלקיקים.

5. תרסיס חשיפה של תאים

הערה: עבור התא תרבות הממשק אוויר נוזלי הקורא נקרא ריק ואח. 38 אופרטורים, יש לבצע הוספה תרבות תא טעינה (צעדים 5.1.2-5.1.4) בתוך ארון אבטחה. אופרטורים, יש לבצע חשיפות תרסיס בשכונה fume.

  1. התרבות תאים על ממשק אוויר נוזלי
    1. הרם A549 תאים מן הבקבוק תרבות על-ידי הוספת טריפסין-EDTA, 3 מ"ל בקבוקון T75 או 1 מ"ל על בקבוקון T25, תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C. להוסיף 7 מ של מדיה מלאה עבור בקבוקון T75 או 4 מ"ל של התקשורת מלאה T25 הבקבוקון אל הבקבוק, יש לשטוף את הבקבוק קיר עם השעיה תא למקסם את מספר התא התאושש. להעביר את המתלים תא צינור חרוטי סטרילי 15 mL ואז צנטריפוגה תאים ב 800 x גרם במשך 3 דקות.
    2. הסר את supernatant המכיל טריפסין-EDTA, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של התקשורת מלאה. להסיר µL 10 של השעיה תא ומוסיפים hemocytometer. לספור תאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע את הריכוז ואת המספר הכולל של תאים.
    3. המקום 0.5 מ"ל של מדיה מלאה כל טוב בתוך צלחת טוב 24 שעות ביממה. מקום מוסיף התרבות תאים שאינם בשימוש בארות. תרבית תאים זרע מוסיף בצד הפסגה צפיפות תא ליד עונה 1 פרק 105 תאים/cm2 עבור סוגי תאים לגדול בקצב ליד הכפלת ליום. זרע A549 תאים בתוך בגודל 24 להוסיף טוב, להוסיף תאים זרע על צפיפות של עונה 1 פרק 105 תאים/cm2 על-ידי הוספת תאים 35,000 התרבות התא.
      הערה: תאים עם קצב צמיחה איטי יכול להיות נזרע על צפיפות תאים מוגברת.
    4. הוסף מדיה מלאה לצד הפסגה של התא תרבות הוספה כדי להגיע את עוצמת הקול הסופי (עבור 24 צלחת טוב נפח סופי הוא 0.25 mL).
    5. תרבות במשך 7 ימים בתנאים המשוקע, החלפת מדיה כל 1-2 ימים. לאחר 7 ימים, הסר את הפסגה המדיה והתרבות לפחות יום אחד בתנאים עלי, החלפת רק התקשורת basolateral.
  2. להרכיב PIVEC
    1. מאפשרים לתאים equilibrate לממשק אוויר נוזלי לפחות 24 שעות לפני החשיפה.
    2. בחר תאים מתאים לתרבות הוספה מתאם עבור PIVEC לתמוך את תותב התרבות תאים עם המסנן. תרבית תאים המקום להוסיף מתאם חתיכה על גבי PIVEC הבסיס, הגדרת למקום כזה כי הבסיס של היצירה מתאם הוא רחב יותר למעלה. להוסיף 4 מיליליטר תא תרבות המדיה הבאר של בסיס PIVEC.
    3. שימוש פינצטה כדי למקם את התרבות התא להוסיף בתוך חתיכת מתאם להציב בשלב 5.2.3. מניחים פיסת העליון על גבי פיסת מתאם, להתיישב במקום כזה כי הבסיס של החלק העליון הוא רחב יותר למעלה. עוטפים היטב, PIVEC עם שכבה אחת של דבק.
    4. להתחבר 37 mm חתיכות קלטת על החלק העליון והתחתון של PIVEC, על ידי דחיפת למקומו. מניחים ¼" תיל מתאמי כניסת קלטות ו עודפים.
    5. לעטוף חימום התנגדות סביב PIVEC כך החוטים הם בבסיס. הקלטת כדי לאבטח.
    6. עוטפים PIVEC עם ~ 8 סיבובים של רדיד אלומיניום לבידוד. לאבטח עם קלטת.
    7. להתחבר קטע קצר של 1/2" צנור גמיש הקוטר החיצוני המתאם בראש PIVEC. הסר אבובים מגומי נקבובי במים סטריליים ומקום בתוך צינורות על גבי PIVEC.
    8. מקום PIVEC בתוך המלחציים על הדוכן טבעת ומאובטח. השלם את קביעת עם משאבת ואקום, הגדרת תרסיס.
  3. לחשוף תאים-עלי באמצעות את PIVEC
    1. להשתמש יעילות התצהיר נקבע בשלב 2 כדי לחשב את המסה של חלקיקי להיות aerosolized. שוקל מסה המתאים ולהוסיף מערכת תרסיס להגדיר בעקבות שלב 2 בתוך המנוע fume.
    2. לחשוף תאים על-ידי ביצוע שלב 2.2 במחקר ביולוגי נקודות הקצה של התאים נחשפו כ- 3.5 מ"ג של חלקיקים נחושת עם קצב זרימה של 0.5 LPM, משך חשיפה של 10 דקות שליטה מחקרים שבוצעו לקביעת אוויר humidified השפעת אוויר לבד. הסר PIVEC הסידור. להוציא את תותב התרבות תאים, מניחים בצלחת טוב סטרילי וחוזרים החממה2 CO (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 90% לחות).
    3. האחות המדיה מן PIVEC. אם ביצוע ניסויים נוספים, שטיפה התחתון של PIVEC עם פוספט buffered פתרון ולאחר מכן חזור על שלב 5.1 ו- 5.2.
    4. PIVEC נקי עם אתנול 70% בסיום. לחטא עם האור האולטרה סגול במשך לפחות 30 דקות לפני הניסוי הבא.
  4. נהלים וזמינותו הביולוגית
    הערה: מבחני שבוצעה במחקר זה היו דור סטרס חמצוני דרך וזמינותו DCFH-DA cytotoxicity דרך שחרור לקטאט דהידרוגנאז (LDH).
    1. להמיס 24.4 מ"ג של DCFH-DA ב 50 מ ל מתנול כדי להפוך פתרון 1 מ DCFH-DA. פתרון זה ניתן לאחסן ב-20 ° C עד 4 חודשים. למהול 1 מ DCFH-DA פתרון על ידי ערבוב 0.1 מ"ל של 1 מ מ DCFH-DA פתרון 9.9 מ ל HBSS לעשות 10 מיליליטר 10 מיקרומטר DCFH-פרקליט המחוז
    2. הסר תא תרבות ומדיה שטיפת תא תרבות עם 1 מ"ל ל- PBS. להוסיף 0.5 מיליליטר 10 מיקרומטר DCFH-DA פתרון כל טוב, החלפת מוסיף בסיום. מכסים בצלחת ברדיד אלומיניום, כדי למנוע photoactivation של לצבוע ולחזור חממה 37° C עבור 1 h.
    3. להסיר תאים של החממה, וארוקן את הפתרון עובד DCFH-DA מן הבארות. להוסיף 0.5 mL HBSS בארות ולהחליף מוסיף התרבות תאים.
    4. לטעון את הצלחת היטב לתוך צלחת קורא ולמדוד פלורסצנטיות בסיסית באמצעות עירור/פליטה אורכי הגל של 485/530 ננומטר. הסר צלחת צלחת קורא ו'טען הוספה לתוך PIVEC לחשיפה.
    5. לחשוף תאים למשך החשיפה הרצויה. הסר הוספה PIVEC ולחזור לבסיס טוב. הסר µL 50 של נוזל basolateral צלחת טוב והמקום בצלחת טוב לבן 96. למדוד את זריחה של DCF באמצעות עירור/פליטה אורכי הגל של 485/530 ננומטר בכל 30 דקות לאחר חשיפה כבר שעתיים.
    6. תן נוזל basolateral equilibrate לטמפרטורת החדר במשך 20-30 דקות להוסיף 50 µL של LDH assay פתרון, מעורבות פרוטוקול יצרן הבאים, כדי basolateral נוזלים צלחת היטב ולתת מגיב במשך 10 דקות להוסיף 25 µL של להפסיק פתרון טוב. לקרוא זריחה של מוצר resorufin באמצעות עירור/פליטה אורכי גל 560/590 ננומטר.
    7. להסיר נוזל basolateral נוספות, חזור על שלב 5.4.6 ב 4 שעות ו- 24 שעות לאחר חשיפה.

6 שיטות סטטיסטיות

  1. ניתוח של נתוני וזמינותו הביולוגית
    1. דוח ROS ייצור כמו העלייה עוצמת קרינה פלואורסצנטית תאי המטופל ביחס למדידות בסיסית. דו ח פעילות LDH כמו העלייה עוצמת קרינה פלואורסצנטית של תאים שטופלו ביחס תאים ללא טיפול.
    2. לבצע גורם יחיד ANOVA כדי לקבוע הבדלים סטטיסטיים בין ערכות נתונים. במקרים המתאימים, לבצע סטודנט t-בדיקות לפי שווי של מובהקות של 0.05. לדווח נתונים כמו הממוצע ± סטיית התקן של פחות שלוש מדידות חשיפה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תעסוקתית במבחנה הרעלים כוללת שמירה על יכולת הקיום הסלולר תוך כדי ביצוע החשיפה תרסיס. מערכת PIVEC מוצג באיור 2, לרבות הטמפרטורה, בקרת לחות, את PIVEC שחוקים. הטמפרטורה נשמר באמצעות תנור resistive המופעלים באמצעות סוללות והגדילה תרסיס humidified באמצעות לחות טבעי דרך צינור נקבובי, שנרטבו. תרסיס מבוקרת הגדרת בתוך מעבדה, PIVEC יכולה להיות הגדרת חשיפה המוצג באיור1. אפיון המערכת מאפשרת קביעת המינון הופקדו על גבי התאים אשר ישויך ואז על התגובה התאית.

היעילות התצהיר תלויה בגודל של החלקיקים הנוספים למערכת מאז התצהיר כוחות כוללים פקק, שיקוע, דיפוזיה. בנוסף, התצהיר הוא תלויים קצב הזרימה, זמן החשיפה, את מאפייני מערכת חשיפה. בעזרת מידע זה, התצהיר ניתן לחזות. היעילות בתצהיר PIVEC נקבע באמצעות שתי שיטות, גרווימטריה, ספירת מספר החלקיקים. משוואות 1 ו- 2 שימשו כדי לקבוע את היעילות התצהיר טבלה 1 באמצעות מסנן בהתבסס, סריקה סייזר חלקיקים ניידות (SMPS), חלקיקים אופטי מדידות גודל סמלים (OPS), איור 3. התצהיר מוגברת נצפית הכולל עבור 24 עיצוב טוב יותר 6 טוב עיצוב מקטין מעט עבור 100 ננומטר לעומת 40 ננומטר וחלקיקים nm נחושת 800. התצהיר בבארות 24 מאוד אחידה מעל תותב, עם זאת, התצהיר בעיצוב טוב 6 חסר אחידות כמו רוב ההפקדה חלקיקים סמוך למרכז תותב. ניתוח לאחר חשיפה יכולה להחיש על-ידי קביעת המינון הקשר בין המסנן 37 mm את תותב התרבות תאים, הפחתת הצורך כדי לקבוע את המינון לאחר חשיפה הסלולר. השוואה של העדות בתוך בקלטת מסנן 37 mm ו PIVEC את מראה מתאם חזק עבור כל בארות וגדלים עם מתאם פירסון של מעל 0.7, אולם רק עבור 800 ננומטר הוא משמעותי עם p המתאם < 0.05, ראה איור 4. לעומת מערכות דומות ברחבי הספרות,11,12 היעילות בתצהיר PIVEC מעל טווח גודל החלקיקים נבדק הוא דומות או מוגבר על הערכים שדווחה, שנמדדו באיור5. ניתן לשפר את היעילות התצהיר בתוך PIVEC באמצעות מזעור הפסדים למערכת אלקטרוסטטית dissipative או מוליך פלסטיק או דומה החומר באמצעות לעצב את PIVEC.

אם מסננים לא מיובש היטב בסביבה מבוקרת לחות לפני החשיפה, המים העודפים מגדיל את המסה הראשוני והוא יכול לייצר מינונים הופקדו שאינם פיזיים, שלילי. המחירים זרימה משתנה יכול גם לקדם מינונים הפקיד לא עקבי בתוך המערכת. כדי למנוע בעיות אלה, אפשר לפחות יום אחד לפני ואחרי חשיפה למסננים להתייבש בסביבה מבוקרת לחות.

תגובות הסלולר יושפעו המינון הופקדו, עשוי להיות מושפע משך החשיפה, אם התאים לא מתוחזקים כראוי. A549 תאים, קו תא מכתשי קרצינומה אפיתל, נחשפו במשך 10 דקות על גדלים של חלקיקים נחושת בספיקה של 0.5 LPM. אנך חלופי לזרום שימוש במערכות חשיפה בין 0.005 LPM 1.5 LPM לתקופה חשיפה ממושכת ואילו שיטה זו משתמשת קצב זרימה בינונית במהלך חשיפה מהירה. באמצעות יעילות התצהיר מבוסס-מסה נמדד מנוהל במינון, 1.58 0.04 מ ג/cm ±2 40 ננומטר נחושת, 0.30 0.00 mg/cm ±2 של חלקיקים 100 ננומטר נחושת, ו- 0.32 ± 0.01 מ"ג/cm2 חלקיקים nm נחושת 800 הופקדו על גבי התאים. Cytotoxicity סטרס חמצוני נצפו בתוך עשרים וארבע שעות לאחר חשיפה ראשונה. Cytotoxicity נמדדה באמצעות השחרור של לקטט דהידרוגנאז (LDH) של תאים פגומים באופן מיידי, 4 שעות ו- 24 שעות לאחר חשיפה. היה לא רעילות משמעותיות של חלקיקים נחושת מתחת 1.62 mg/cm2 תוך 4 שעות של חשיפה, איור 6b. עשרים וארבע שעות לאחר חשיפה שם הייתה ירידה משמעותית מבחינה סטטיסטית תא הכדאיות של פחות מ-20% הכדאיות עבור תאים נחשפים חלקיקים נחושת. תאיים סטרס חמצוני נחקר באמצעות וזמינותו DCFH-DA דרך החמצון של DCFH על ידי מינים חמצן תגובתי במרחק שעתיים שלאחר חשיפה ראשונה 6a איור. רמות משמעותיות של סטרס חמצוני נמדדו ב 30 דקות לאחר חשיפה עבור תאים נחשפים חלקיקים נחושת בכל הגדלים. הרמה של סטרס חמצוני המשיכה להגדיל במחירים דומים עבור כל גדלי נבדק במסגרת השעתיים נצפתה.

ההצלחה של החשיפה יכול להיקבע דרך הדיר התגובה התאית. קריטריוני קבלה שני המוצע עבור מבחני cytotoxicity כוללים: זליגת LDH הכולל 1) % עבור הפקד חיובית צריך להיות גדול מ- 50%, ו- 2) חיובי, לדוגמה שכפל המקדם של וריאציות צריך להיות בתוך 50%. 39 אם קריטריונים אלה אינם נפגשו, זו הצע ההבדלים בין ניסויים, כגון כמויות התצהיר מסולף או בקרת לחות וטמפרטורה המסכן. בנוסף, התבוננות מדידות cytotoxicity יכול להוביל להבנה של הפקדים ניסיוני וסיוע בקביעת השגיאה. כאשר קצב הזרימה הוא גבוה מדי, תאים עשוי למות מתוך כמויות גבוהות של גזירה. על-ידי הורדת קצב הזרימה, ניתן להקטין את הלחץ על תאים מן הזרם.

Figure 1
איור 1. סכמטי של מערכת פיזור יבש ולהגדרה ניסיוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. עיצוב PIVEC. א) עיצוב מלא בתמונה כשתיבת בגובה 30 ס מ עבור השוואה. B) PIVEC עם טמפרטורה לחות שליטה בתמונה עם 30 ס מ תיבת גבוה עבור השוואה. ג) PIVEC שחוקים. ד) פיסת העליון PIVEC. ה) התא מתאם תרבות עבור 24 טוב (משמאל) 6 טוב (מימין). F) החלק התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מספר המבוסס על התצהיר יעילות (%) מסה המבוסס על התצהיר יעילות (%)
6 טוב 40 ננומטר 17.83 ± 32.13 5.85 ± 0.85
100 ננומטר 0.47 ± 4.06 5.11 ± 0.94
800 nm 3.70 ± 35.00 6.39 ± 1.01
24 טוב 40 ננומטר 1.43 ± 2.43 12.61 ± 1.34
100 ננומטר 1.37 ± 19.45 2.95 ± 0.75
800 nm 6.98 ± 3.93 15.95 ± 0.53

טבלה 1. PIVEC התצהיר יעילות.

Figure 3
איור 3. ריכוז מספר חלקיקים ננו-חלקיק נחושת אירוסולים. א) מדידה של SMPS. B) מבצעים מדידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. הקשר בין התצהיר על הוספה תא SKC 37 מ מ מסנן. שגיאה ± 0.002 מ ג. א) חלקיקי 40 ננומטר נחושת. ב) חלקיקי 100 ננומטר נחושת. ג) חלקיקי nm נחושת 800. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. התצהיר יעילות של PIVEC לעומת מערכות זרימה בניצב חשיפה לספרות. מותווים ערכי ספרות ממערכות החשיפה לזרום בניצב בסמני מוצק, PIVEC ערכים הם סמנים ריק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6. תגובת תאי נחושת חלקיקים לאחר חשיפה (PE). עבור כל המדידות, n = 3 ו- p < 0.05. א) סטרס חמצוני נקבע באמצעות DCFH-DA וזמינותו. B) cytotoxicity באמצעות וזמינותו LDH. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מסנן קלטות מספקות שיטה פשוטה, זולה של איסוף אירוסולים באזור נשימה; עם זאת, תרסיס מופק מסננים לא מייצגים את תרסיס כולו (כלומר גזים שיכללו חומרים נדיפים, חלקיקים) ודוגמאות כתוצאה מכך להגביל את ההערכה של השפעות ביולוגיות קשורים. באמצעות העיצוב הראשוני בקלטת מסנן 37 mm, PIVEC נועד לשמור על ניידות ומחקים את ויוו הפקדת חלקיקים משאיפת. PIVEC הוא קטן באופן משמעותי יותר הנוכחי עלי חשיפה למערכות, בערך בגודל של תיבת רקמת עם בקרת טמפרטורה ולחות כלל. הגודל הוא דומה impactors אשד אישי תוך מתן נתונים על התגובה התאית בתרסיס בנוסף. בזמן PIVEC מכיל שטח עבור מדגם אחד לעומת מערכות אחרות-החשיפה הנוכחית, גודל קטן מאפשרת מערכות מרובות כדי לשמש בעת ובעונה אחת, לכן, הגדלת גודל המדגם המאפשר התפוצה המרחבית להיות במעקב.

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. כדי לקבוע את היעילות התצהיר, חיוני כראוי להתנות את המסננים, כמתואר בשלב 1. בנוסף, חשוב לשקול כראוי על חלקיקים נחושת לפני חשיפה, חשיפה פוסט מסנן כדי לקבוע את היעילות התצהיר מבוסס-מסה. היעילות התצהיר מספר להיקבע באמצעות ההבדל בעדות בין ריכוז תרסיס הראשונית לבין הריכוז הסופי נקבע באמצעות את מוני חלקיקים. אם היעילות התצהיר לא נקבע כהלכה, זה קשה לקבוע את התגובה הביולוגית ההבדלים בין סוגי תרסיס. שינויים התצהיר לכלול שינוי התצהיר. התצהיר יכול להיות מוגברת על ידי שינוי משך החשיפה וקצב הזרימה. זה עשויים גם להשפיע את הכדאיות תא עם הפוטנציאל של ייבוש התאים. ההתניה של אירוסולים מתבצע לעיתים קרובות כדי לפצות על תכונות פיזיולוגיות כגון טמפרטורת הגוף, לחות את דרכי הנשימה. לחות מוגברת, מעל 50%, מחקה את האוויר הנשאף ומקטינות מוות של תאים עקב חשיפה הרכב. 43 כאשר הטמפרטורה והלחות לא טוב נשלטים, התגובה התאית יכולים להיות מושפעים. על ידי הפחתת קצב הזרימה, חלקיקים נוספים בכל הגדלים תוכלו להפקיד, הגדלת התצהיר. משך זמן החשיפה הוא יחסי התצהיר, ומאפשר יותר חלקיקים להפקיד דולרית ניסיוני. מיזוג בתרסיס חשוב בעת הגדלת משך החשיפה כך התאים לא יתייבש אשר יכולים להשפיע על תגובות ביולוגיות.

PIVEC משתמשת בניצב זרימה כדי הפקדת חלקיקים דרך פקק, שיקוע, דיפוזיה על גבי התאים אשר יש פוטנציאל להתייבש תאים דרך הזרם והוסיף לחץ על התאים. היעילות התצהיר תלויה בגודל של החלקיק עקב הכוחות של התצהיר. רבים של מערכות החשיפה הנוכחית עם זרימה בניצב יש יעילות התצהיר להלן 10%, הרבה יותר קרוב ל- 1%. PIVEC יש על יעילות התצהיר נקבע על ידי גרווימטריה של 3-16% עבור בגודל 24 טוב תא תרבות הוספה. היעילות התצהיר המבוססת על מספר החלקיקים היא כ 1% עד 7% עבור תותב אותו. בעת שימוש 6 טוב תרבית תאים מוסיף, להקטין את המספרים האלה, פרט לגודל החלקיקים הקטנים ביותר, בשל התייעלות של תרסיס כמו חלקיקי יותר מרותק את תותב התרבות התא ללא מרחב זרימה לפתח. הכיסויים של תרבות תא טוב 6 היתר הזרמים תרסיס כדי לעקוף את התצהיר. אפיינו מערכות זרימה בניצב אחרים על בסיס המוני באמצעות 60 ננומטר fluorescein חלקיקים40, 80 ננומטר 180 ננומטר נחושת חלקיקים16ו 60 ננומטר adipic חלקיקים חומצה41. היעילות התצהיר וכתוצאה מכך הם בדרך כלל בין 0.05% 11%. על בסיס מספר, מערכות אלו יש כבר מאופיין באמצעות חלקיקים פוליסטירן12,15, חלקיקי פחמן12סיליקה חלקיקים42, מניב היעילות בין 0.2% ל- 11%. PIVEC מספק, התצהיר דומים או מוגבר, לעומת חשיפה הסלולר זמינים התקנים.

תא חשיפות בוצעו באמצעות חלקיקים נחושת של 40 nm, 100 ננומטר, ו-800 ננומטר. תא הכדאיות הוגדרה באמצעות וזמינותו LDH אין שינוי משמעותי בירידה הכדאיות תוך 4 שעות לאחר חשיפה. LDH וזמינותו שימש עם מערכת מחשיפה מסחרית ng/cm 742 אחרי 2 שעות ו- ng/ס מ 1482 אחרי 4 שעות של 9.2 nm נחושת אוקסיד חלקיקים44 ו 1 של µg ס מ2 שהופקדו לאחר חשיפה רציף 4 שעות, דגירה 2 שעות ולאחר מכן חשיפה נוספת למשך 4 שעות 25 ננומטר נחושת אוקסיד חלקיקים40, שתי ירידות משמעותיות מדידה תא הכדאיות. Cytotoxicity נצפתה במערכת אחרת עבור 1.6-7.6 µg/cm2 180 ננומטר חלקיקים חלקיקים נחושת16 נמדד על ידי trypan צבע כחול הדרה. חשיפות של 15 דקות 40-80 ננומטר נחושת אוקסיד חלקיקים ירד הכדאיות, נמדד 24 שעות פוסט החשיפה. רעילות נמוכה שנמדדו באמצעות את PIVEC היה סביר בשל הזמן חשיפה קצר של 10 דקות פעמים מידה של חשיפה פוסט קצר יותר. לאחר ארבע שעות לאחר חשיפה, ירד הכדאיות של נחשפו PIVEC חוליות. התאים חשופים פקדים אוויר לח נצפתה אין cytotoxicity משמעותית, מסכים עם אחרים מחקרים 9,40,44,45,46. סטרס חמצוני נקבע באמצעות DCFH-DA וזמינותו. הייצור של מינים חמצן תגובתי, כגון מי חמצן או רדיקלים, שנוצר כמות של מתח זה יכול להוביל למוות מעצר או התא צמיחה. לאחר החשיפה תא, היתה עלייה מזערית סטרס חמצוני על תאים כל הזמן בחממה כפקד ועל תאים נחשפים אוויר לח. סטרס חמצוני גבוהות אירעה עבור כל גודל החלקיקים, הגדלת בתוך 30 דקות לאחר חשיפה. במסגרת מחקר אחד, 9.2 nm נחושת אוקסיד חלקיקים44 ו- 25 חלקיקי תחמוצת נחושת nm40 המושרה גם סטרס חמצוני נמדד באמצעות carboxy-DCFH-DA וזמינותו. חשיפה מוגברת זמן מ 2 שעות 4 שעות סטרס חמצוני גבוהות 9.2 nm נחושת אוקסיד חלקיקים44. אחרי ארבע שעות של חשיפה, חלקיקי תחמוצת נחושת nm 9.2 הפיק תגובה חמצוני דומה כמו חשיפת רציפים 25 ננומטר נחושת אוקסיד חלקיקים40, רומז כי החשיפה משך יש השפעה גבוהה יותר על תגובת עקה מאשר גודל החלקיקים. נחשפו בתוך PIVEC חוליות המיוצר סטרס חמצוני גבוהות בהשוואה המחקר הזה, לעומת זאת, החלקיקים חשוף למערכת החלופית נמצאים נחושת אוקסיד, יתמוסס פחות מהר יותר הנחושת חשופים בתוך PIVEC. מחקרים שבוצעו על פירוק נחושת מבוסס על ההרכב, גודל של חלקיקים מסכים כי חלקיקים גדולים יותר, את תחמוצות מתכת לשחרר יונים איטי יותר חלקיקי מתכת או שלהם ננו-חלקיק עמיתיהם16,47 , 48 , 49 כפי הפקדים אוויר לח לא לייצר כמויות משמעותיות של סטרס חמצוני בהשוואה הפקד חממה, ההשפעה של החלקיקים נחושת לזירוז סטרס חמצוני הוא עקבי בתוך PIVEC דומה במבחנה חשיפה מערכות. תגובות ביולוגיות שנמדדו באמצעות PIVEC את מראים כי PIVEC הוא מערכת המתאימה לחשיפה הסלולר.

אפיון ולימודי הסלולר של PIVEC מסכים עם ספרות,9,16,40,44,46 המכשיר יש מגבלות. עיצוב קטן מקטינה את מספר דוגמאות זה ניתן לחשוף בו זמנית בתוך מכשיר יחיד לעומת מערכות אחרות-חשיפה. מערכות אחרות לאפשר חשיפות הסלולר לפחות שלושה באותו תרסיס9,12 הקלת שכפל מדידות. למרות PIVEC מאפשר רק עבור הוספה אחד לכל מערכת, גודל קטן מאפשר למערכות מרובות בקלות לשמש, עוזר להקל על בעיה זו. בעוד אחרים מערכות ניטור אישיות לא תשתמש תאים, PIVEC חייב להישמר ליד אנכי כדי להפחית לשפוך התקשורת התרבות התא הדרושים לשמר את הכדאיות הסלולר. אמנם עדיין לא הותאם PIVEC טווחי חלקיק מסוים (למשל PM10, PM2.5, PM0.1), PIVEC מאפיין עבור מגוון של גודל החלקיקים. בדומה למערכות אחרות זרימה בניצב, PIVEC מראה לך היכולת ירד הפקדת חלקיקים קרוב למאה nm בקוטר, תוך 40 ננומטר וחלקיקים nm 800 להפקיד עם יעילות דומה.

הניתוח של התאים לאחר חשיפה יכולה להחיש על-ידי ביצוע אוסף מקבילים של אירוסולים בתוך את PIVEC ואת קלטת מסנן של SKC 37 מ מ. מתאם גבוה של התצהיר מבוסס gravimetric מאפשר הערכת של מסה חלקיקים שנאספו על התאים מן הנתונים שנאספו באמצעות מסננים 37 מ מ. השוואה של הקדמי בקלטת מסנן מקטין את הצורך לאסוף דוגמאות נוספות ומדידות נוספות כדי לקבוע את המינון. בתהליך עבודה כוללת השילוב של מערכת ניטור בזמן אמת עבור cytotoxicity, סטרס חמצוני או נקודות קצה ביולוגיים אחרים. גודל קטן PIVEC מאפשר להשתמש במגוון של הגדרות, כמו למשל על הגוף כמו מוניטור אישי, על דבור מעל מפעל כימיקלים, או בחוץ בסביבה עבור רזולוציה מרחבית. שיטה זו מראה את השימוש PIVEC עבור האוסף של חלקיקי אירוסול על תרביות תאים גדל החייזרי. על ידי מיזוג בתרסיס 37 ± 1 ° C ו > 80% לחות יחסית, הכדאיות הסלולר יכול להישמר במהלך חשיפות חמור. שיטה זו מתאימה עבור droplet נוזלי וגם אירוסולים מבוסס חלקיק מוצק ולא הוכח הפקדת חלקיקים בין 40 ננומטר ו-800 nm, מוסיף התרבות תאים. צדדיות של PIVEC מאפשר בשיטה זו כדי להשתמש בהגדרות מרובים עם מגוון רחב של נקודות קצה ביולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לשיוך המחברים הוא כפי שמוצג בעמוד השער. המחברים נתמכים כלכלית על ידי אוניברסיטת וירג'יניה חבר העמים, לאן שהעבודה הושלמה בריצ'מונד, va המחברים יש אחריות מלאה הכתיבה והתוכן של המאמר. המחברים מצהירים כי ישנם אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות בוריס סולומונוב, החנות המכונה החדשנות של חבר העמים הבריטי וירג'יניה לעזרה עם שטנץ מהירה המכשיר. המחברים רוצה גם להודות Cristian רומרו-פואנטס של קבוצת Lewinski, ד ר Vitaliy Avrutin, ד ר דמיטרי Pestov, וירג'יניה קהיליה ננו הליבה אפיון המתקן על עזרתם עם איפיון חלקיקים. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הפעלה סופק לו ד ר Lewinski על ידי המכללה האקדמית להנדסה באוניברסיטת וירג'יניה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3 (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013 (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51 (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. , Elsevier. (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26 (2), 84-93 (2013).
  17. Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. , CRC Press. Boca Raton. (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10 (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. , 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97 (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20 (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 20 (2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. , 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8 (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9 (1), 33 (2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103 (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. , 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36 (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19 (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 16 (2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41 (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47 (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19 (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27 (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26 (0), 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29 (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9 (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5 (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5 (3), 389-399 (2009).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 144 חשיפה מערכת אינהלציה ננו-חלקיק טוקסיקולוגיה יעילות התצהיר ניטור אישי
חדש נייד <em>במבחנה</em> חשיפה קלטת לדיגום אירוסול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Secondo, L. E., Wygal, N. J.,… More

Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter