Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتنفيذ التعرض الأيروسول الخلوية المحمولة وقياس الاستجابة الخلوية. يستخدم الأسلوب الخلايا، نمت في واجهة الهواء السائل، ومحاكاة في فيفو فسيولوجيا. وقد لوحظ الاستجابة الخلوية للهباء الجوي نانوحبيبات النحاس الأكسدة عن طريق توليد أنواع الأكسجين التفاعلية وسيتوتوكسيسيتي كالإصدار نازعة لاكتات.
Abstract
ويدخل هذا البروتوكول في المختبر تعرض نظام جديد، يمكن أن يجري البالية، بما في ذلك في توصيف والأداء. واجهة الهواء السائل (على) في المختبر التعرض النظم غالباً ما تكون كبيرة وضخمة، مما يجعل النقل الميدانية والعملية في المصدر الانبعاث أو داخل منطقة التنفس صعباً. عن طريق تصغير هذه النظم، يمكن أن يمثل المختبر إلى الميدان، وتعجيل وقت المعالجة وتوفير أنسب أسلوب تعرض لا يغير الأيروسول قبل الاتصال الخلايا. المحمولة في المختبر كاسيت التعرض (بيفيك) تكيف كاسيت تصفية 37 ملم للسماح للسمية في المختبر على اختبار خارج إعداد مختبر تقليدية. بيفيك تميزت باستخدام ثلاثة أحجام من جسيمات نانوية النحاس لتحديد كفاءة الترسيب استناداً إلى قياس الجاذبية وتحليل تركيز عدد الجسيمات. وأجريت التجارب الأولية سيتوتوكسيسيتي مع خلايا الرئة المعرضة لتحديد قدرة النظام على إيداع الجسيمات مع المحافظة على بقاء الخلية. بيفيك يوفر من ترسب مماثلة أو زيادة كفاءة عند مقارنة بتدفق عمودي متوفرة في المختبر أجهزة التعرض. وعلى الرغم من انخفاض الإنتاجية عينة، يعطي صغر حجم بعض المزايا للحالي في المختبر على نظم للتعرض. وتشمل هذه القدرة على أن ترتديه للرصد الشخصي، والتنقل من المختبر إلى مصدر للانبعاثات، والخيار لإنشاء أنظمة متعددة للقرار المكانية مع الحفاظ على مستخدم أقل تكلفة. بيفيك نظام قادر على جمع الهباء الجوي في الميدان وداخل منطقة التنفس على الهواء-ربطه، نموذجا في المختبر .
Introduction
شخصية أخذ العينات باستخدام تقنيات في المختبر يمكن أن توفر معلومات شاملة بشأن الآثار البيولوجية للهباء الجوي في مكان العمل. 1 التعرض للملوثات في الهواء وتشمل التعرض لهذه المادة الكيميائية ذاتها، أن عينات الهواء التي تم جمعها، تحت ظروف المغمورة حيث عرض الغاز إلى تعليق خلية، التعرض المتقطع استخدام جهاز مثل الروك، أو مباشرة التعرض في واجهة الهواء السائل (على). 2 كثير من هذه التقنيات تجري مع الخلايا التي نمت في تعليق أو جمع العينات قبل التعرض، كل منها يمكن أن تؤثر على الدراسة السمية نظراً للتغيرات المحتملة في الأيروسول. 3 تجنب هذه التغييرات، المختبر يمكن نقله إلى الحقل باستخدام عدة في المختبر على الثقافة تعرض النظم المستخدمة في الأدب،،،من45،،من67 8،،من910،11،،من1213 ولكن قليلة متوفرة تجارياً. 8 , 9 , 12 هذه النظم غالباً ما تكون ضخمة، لا سيما عندما بما في ذلك أدوات لتنظيم درجة الحرارة والرطوبة للبيئة الخلوية ومعدل تدفق الأيروسول عينة. باستخدام بيفيك، التعرض للهباء الجوي يمكن أن يؤديها خارج إعداد مختبر تقليدية أو داخل منطقة التنفس أثناء محاكاة ظروف استنشاق.
أن تحديد من الهباء الجوي ترسب في المختبر مهم للتحقيق في الآثار الصحية بسبب استنشاق. منطقة التنفس، منطقة حدود 30 سم من الفم والأنف،14 حاسمة الأهمية لفهم التعرض للجسيمات النانوية وربط التأثيرات البيولوجية الموجودة في الرئتين. 2 في كثير من الأحيان، الترسب في الخلايا يعرف كفاءة ترسيب، الجسيمات المودعة على وتناول الخلايا مقسوماً على الجسيمات التي تديرها إلى6،نظام15 أو بصورة جماعية بنفس المبالغ. 4 , 16 الأساليب الحالية لقياس الهباء الجوي في منطقة التنفس هي عامل التصفية على أساس والتقاط الجزيئات على مدى فترة معينة أخذ عينات واستخدام عوامل التصفية لإجراء مزيد من التجارب. 17 الرصد الشخصي يتطلب نظام صغيرة التي تأتي مع المفاضلة العينات أقل.
هناك الكثير من النهج لتحديد الآثار الصحية الناجمة عن التعرض للهباء الجوي. النموذج على يسمح للأيروسول تدار مباشرة إلى الخلايا عن طريق الهواء كما هو الحال في سيناريو تعرض حقيقي، حتى الآن أكثر فعالية من حيث التكلفة ووقتاً أقل كثافة مما في فيفو الدراسات بينما يقلد الحواجز الهواء السائل مثل العيون، الجلد، والرئتين. خلايا الرئة نمت على لديها القدرة على توليد طبقة حاجز الاستقطاب،18،19 التي تنتج الصفات الفسيولوجية التي تشبه في فيفو الرئة ظهارة، بما في ذلك إنتاج مخاط والفاعل بشكل خاص خطوط خلايا الشعب الهوائية أو التهاب، أهداب الضرب وتقاطعات ضيق19 ،19،20 وخلية الاستقطاب. 18 تغييرات كهذه يمكن أن تؤثر على الاستجابة الخلوية قياسه في دراسات السمية. 21 بالإضافة إلى ذلك، على نموذج في المختبر نتائج يتعرضون غالباً أكثر حساسية من الخلايا عن طريق تعليق نماذج22 ، وهم قادرون لنموذج السمية الحادة في فيفو استنشاق. 23 , 24 لذلك، نظام تعرض على التي قادرة على إجراء قياسات داخل منطقة التنفس خطوة تالية طبيعية.
بتعريض الخلايا للهباء الجوي مباشرة على مصدر للانبعاثات، يحدث التحقيق في آثار جميع الغازات والمركبات شبه المتطايرة، والجسيمات المتورطين في الخليط. عندما يتم جمع الخليط في عامل تصفية، لم يتم التقاطها بالغازات والمركبات المتطايرة ولا يمكن التحقيق في الخليط كله. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي إعادة تشكيل الجزيئات في شكل مسحوق أو تعليق سائل إلى التجميع أو التفاعلات الموائع والجسيمات، مثل حل، في تعليق السائل. 25 , 26 عندما تتم إضافة جسيمات الهباء الجوي إلى السائل، هناك إمكانية أعلى للتكتل، وتشكيل27 25،كورونا البروتين أو28 أو التفاعل مع المركبات في السائل، التي يمكن أن تؤثر على الترسيب و تؤثر في استجابة بيولوجية. 29 , 30
التعرض على يستند إلى ثلاثة ملامح الهباء الجوي الرئيسية وسحابة تسوية، موازية وتدفق وتدفق عمودي. سحابة تسوية، يستخدم قبل التعرض للخلية واجهة الهواء السائل (ALICE)،4 نظام مجموعة حيث إيداع الجسيمات من خلال الجاذبية وديفوسيونال تسوية كما الأيروسول تعامل كوحدة واحدة. تدفق مواز، يستخدمها الالكتروستاتيكي الهباء الجوي في المختبر نظام التعرض (الطنف)5 والتعدد الثقافي التعرض الدائرة (MEC) ثانيا،6 يسمح للترسيب من خلال إضافة البراونية من خلال الشخصية تدفق. تدفق عمودي، المستخدمة من قبل ميكروسبرايير،7 "نانو الأيروسول الدائرة" للسمية في المختبر (ناسيفت) و11 والتجاريه على أنظمة8،،من910،12، يضيف انحشار من جسيمات داخل منطقة الترسيب. كثير من هذه النظم التعرض الكبيرة والضخمة، التي تتطلب نظم الزائدة للهباء الجوي قبل التكييف، مضخات للتدفق، أو حتى تدفئة الغرف للحضانة للخلايا. هذا الحجم الكبير يقلل من قابلية للنظام. بدلاً من أخذ العينات مباشرة على مصدر للانبعاثات، هذه النظم غالباً ما يكون إلى الهباء مختبر أو النموذج التي تم إنشاؤها لتحليل العينات. يمكن أن تضيع تعقيد الأيروسول المنبعثة في الترجمة من الميدان إلى المعمل. بيفيك أصغر من النظم الحالية، مع مساحة سطح خارجي حوالي 460 سم2 وتزن 60 غراما فقط، مع التحكم في الحرارة والرطوبة تدمج في نظام يسمح لجهاز محمول للغاية. انخفاض حجم ووزن السماح للنظام بأن ترتديه أو اتخاذها مصدرا للتعرض، وتسمح بأخذ العينات مباشرة.
الحجم الكبير لنظم التعرض الحالي يقلل أيضا من قدرة على القيام بأخذ العينات للتحقيق في التدرجات المكانية في تركيزات. هذا القرار مفتاح عند تحديد الآثار السمية للعديد من الإمكانيات البيئية والمخاطر المهنية مثل أنشطة هذه المسألة أو مكان العمل جسيمات عوادم المركبات التي يحدث فيها هباء. فورا بعد انتهاء الانبعاثات، يصبح هناك تباين المكاني في تركيز الجسيمات. وهذا ينمو مع الوقت تفريق الجزيئات في جميع أنحاء الغلاف الجوي، ويمكن تغيير هذه الآثار استناداً إلى الظروف المحيطة، مثل درجة الحرارة والضغط والرياح والشمس. يمكن أن تبدأ جسيمات إلى سن وأكسدة كذلك مرة المنبعثة31،32 ومعدلات تشتيت تتأثر بالتضاريس؛ سيتم العثور على تركيزات أعلى في الوديان والإنفاق، وهي تباطؤ آثار التشتت، حيث يمكن العثور على تركيزات أقل حيث هناك مساحة كبيرة للتشتت. 33 هذه التغييرات في معدلات انتشارها يمكن أن تكون لها آثار كبيرة على صحة الإنسان ويتبين عند مقارنة عدد البالغين المصابين بالربو الذين يعيشون المناطق الحضرية مقابل في البيئات الريفية. 34 بينما العديد من التعرض لنظم تقديم عينات متعددة في وقت واحد، أنظمة متعددة اللازمة مع وفرة معدات كبيرة لتنفيذ القرار المكانية.
من خلال جلب المختبر إلى الميدان، يمكن تقليل وقت التحليل باستخدام الخلية كله كجهاز استشعار. بعد الآليات البيولوجية المعروفة ونقاط النهاية يمكن أن تساعد في تحديد تكوين الهباء الجوي وحجم. بسبب أساليب إزالة بطيئة، بما في ذلك إزالة mucociliary والبلعمه إزفاء، غالباً ما تتفاعل هذه الجسيمات مع الخلايا تقريبا من أيام لأسابيع3 توليد الأكسدة والالتهابات، وموت الخلية حتى. هذه النهاية البيولوجية يمكن أن يكون نقطة انطلاق لمسارات النتيجة السلبية لأمراض القلب والأوعية الدموية أو مرض الانسداد الرئوي المزمن. وبالإضافة إلى ذلك، يقوم وييمين et al. صفيف فحوصات في المختبر لمقارنة مع قيم الأدب للمدى القصير في فيفو سمية الاستنشاق. 35 وكان من المتوقع في فيفو استجابة مع اثنين من أربع نتائج إيجابية من اختبار سيتوتوكسيسيتي عن طريق الإفراج نازعة لاكتات، الأكسدة من الجلوتاثيون تشكيل الحد وفوق أكسيد الهيدروجين والإصدار، والتهاب المحتملة من الجينات عامل نخر الورم ألفا. من أصل عشرة أكاسيد معدنية نانوسيزيد اختبار، اختبار ستة كنشط (أكسيد التيتانيوم وأكسيد الزنك وأكسيد السيريوم مختلفة أربعة) استخدام التعرض في المختبر مع التأكيد في فيفو.
من أجل دراسة آثار الهباء الجوي في بيئة مهنية، وضعت لدينا مختبر بيفيك للتعرض في الميدان. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ارتداؤها بيفيك لأخذ العينات الشخصي رصدها والتحقيق فيها التعرض لاستنشاق مثل كاسيت تصفية مم 3736 أو أنظمة متعددة يمكن استخدامها لتحقيق القرار المكانية داخل منطقة معينة. هذا البروتوكول، بتوصيف واستخدام بيفيك يناقش فيه. بعد التعرض، ولوحظت الآثار البيولوجية من خلال فحوصات سيتوتوكسيسيتي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
مشغلي يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثل مختبر معطف، قفازات، نظارات) عند تنفيذ الخطوات 1، 2، 3، 5 و 6.
1-إعداد المواد
-
إعداد مواد لنظام الجمعية والتعرض للتأكد من التكرار.
- تأكد من استخدام جديد أو الإيثانول 70 ٪ تنظيفها ¼ "القطر الداخلي موصلة الأنابيب و ¼" القطر الخارجي موصلات للجمعية النظام.
- تخزين مواد الاختبار بما في ذلك المرشحات ومكونات بيفيك، ملاقط ومساحيق الجسيمات في بيئة تسيطر عليها جيدا، وفيما يتعلق بدرجة الحرارة والرطوبة، على الأقل 24 ساعة قبل التجربة.
ملاحظة: ينبغي أن تكون درجة الحرارة القرب من درجة حرارة الغرفة، حوالي 20 درجة مئوية، مع الرطوبة النسبية أقل من 35%. وهذا مهم جداً لتحقيق التكرار بين التجارب. - تعد عدادات الجسيمات باستخدام الكحول لتنظيف الأجزاء والسماح للاحماء النظام وفقا لتوصيات الشركة المصنعة، بما في ذلك المسح تحجيم الجسيمات التنقل (المكاتب الصغيرة) وتحجيم الجسيمات الضوئية (OPS) لقياس.
2-توليد الهباء الجوي الجاف
ملاحظة: يجب إجراء مشغلي توليد الهباء الجوي في غطاء دخان.
-
تجميع نظام لتوليد الهباء الجوي الجاف
ملاحظة: ينبغي أن تكون المناسبة لثقافة التطبيق وخلية على غرار تعليق الجسيمات في غاز أو سائل. يمكن تنفيذ الطريقة التالية باستخدام الهباء الجوي على أساس سائل. تصميم نظام الهباء الجوي الجاف من تيواري وآخرون. 37 وتخطيطي للنظام تشتت الجافة يرد في الشكل 1.- الاتصال صمام الكرة بكل نهاية الأنبوب حجم الخيوط 4 "1/8، وهذا سيكون بمثابة هوبر الجسيمات. قم بتوصيل 2 "1/8 حجم الأنابيب صمام واحد.
- وزن النحاس الجسيمات النانوية، في هذه الدراسة كان إبقاء التركيز الشامل لكل حجم من أحجام الجسيمات ثابتة أثناء تحديد كفاءة الترسيب. تقريبا استخدام 7.5 ملغ من 40 نانومتر النحاس nanoparticles و 7 مغ من 100 نانومتر النحاس جسيمات نانوية 13 ملغ 800 نانومتر النحاس nanoparticles الواحدة والتعرض. ضع جسيمات نانوية النحاس إلى هوبر الجسيمات من خلال نهاية مفتوحة.
ملاحظة: كمية جسيمات نانوية النحاس وزنها ستكون بمثابة الكتلة التركز التي تدار على أساس. - ضع 3 "قطعة من القطر الخارجي (OD) أنابيب ½" حول 2 الأنابيب ومكان هيبا تصفية داخل هذه الأنابيب قصيرة أن اتجاه التدفق من خلال صمام الكرة.
- قم بتوصيل مولد فراغ صمام الكرة الأخرى باستخدام مؤشر الترابط. الاتصال مولد فراغ خزان الهواء عن طريق وضع أنابيب OD 5/16 "إلى دفع لتأمين الاتصال. استخدام ¼ "OD أنابيب للاتصال منفذ مولد فراغ الإعداد التجريبية بوضع الأنابيب عبر منفذ مولد فراغ.
-
استخدام نظام الأيروسول الجافة لتوليد الهباء الجوي الجاف
- فتح خزان الهواء عن طريق تحويل الصمام الرئيسي، والسماح بتدفق الهواء إلى النظام. فتح الصمام على منظم التدفق على خزان الهواء وتعيين أن التدفق من خلال النظام يكافئ الإعدادات المطلوبة في مضخة فراغ.
- فتح صمام الكرة الأقرب إلى هيبا فلتر ثم فتح صمام الكرة الأقرب إلى مولد فراغ. إبقاء هذه مفتوحة لحوالي 3 ثانية للسماح للجسيمات ليتم سحبها في مجرى الهواء.
- إغلاق صمام الكرة الأقرب إلى فراغ مولد ثم إغلاق صمام الكرة الأقرب إلى مرشح هيبا. تسمح للهواء من خزان لتدفق طوال فترة التجربة حسب الضرورة.
- إغلاق الصمامات الرئيسية ومنظم في خزان الهواء لوقف التدفق. تنظيف الكرة الصمامات ومولد فراغ استخدام الإيثانول 70%. اﻷوتوكﻻف أنابيب معدنية للتعقيم.
3-ترسب قياس كفاءة استخدام بيفيك
ملاحظة: يجب إجراء عوامل التعرض الهباء الجوي في غطاء دخان.
- قياس الترسيب بجمع الأيروسول نانوحبيبات النحاس التي تم إنشاؤها في الخطوة 2، 2 في عامل تصفية قبل موزون. استخدام الجرعة المودعة، تقاس باستخدام كتلة التي تم جمعها في عامل التصفية، والجرعة المعطاة، يتم قياسها باستخدام كمية جسيمات النحاس موزون، لتحديد كفاءة الترسيب.
- الحفاظ على الزجاج المسام ميكرومتر 1.00 الألياف المرشحات تحت ظروف الرطوبة المنخفضة، الموصوفة في 1.1.2, لمالا يقل عن 24 ساعة قبل التعرض قبل القياسات. وزن عامل تصفية غير مستخدمة ثلاث مرات وسجل الأوزان عامل التصفية. إدراج مكان عامل التصفية غير مستخدمة في ثقافة خلية.
- اختر الخلية المناسبة الثقافة إدراج محول (6 بئر أو بئر 24) بيفيك لدعم إدراج ثقافة الخلية مع عامل التصفية. مكان ثقافة الخلية إدراج قطعة محول على رأس القاعدة بيفيك، وضع موضع التنفيذ أن قاعدة قطعة محول أوسع من الأعلى.
- إدراج استخدام الملقط لوضع التصفية تحميل خلية ثقافة داخل قطعة محول. وضع رأس قطعة فوق قطعة محول، تسوية في مكان يكون قاعدة رأس قطعة أكبر من الأعلى. التفاف بيفيك مع طبقة واحدة من شريط لاصق.
- ربط قطعة كاسيت 37 ملم في أعلى وأسفل بيفيك طريق دفع في مكانها. ضع ¼ "الشائكة محولات في كاسيت مدخل ومخرج.
- لف سخان مقاوم حول بيفيك أن الأسلاك في الأساس. الشريط لتأمين.
- التفاف بيفيك ~ 8 جولات من رقائق الألومنيوم للعزل. تأمين مع الشريط.
- الاتصال 2 قطعة طويلة من 1/2 "القطر الخارجي أنابيب مرنة بالمحول على رأس بيفيك. إزالة الأنابيب المسامية من الماء المعقم ومكان داخل الأنابيب على رأس بيفيك.
- بيفيك مكان داخل المشبك العصابة على الوقوف وآمنة. اكتمال الإعداد مع مضخة فراغ وعدادات الجسيمات، والهباء الجوي الإنشاء.
ملاحظة: يمكن تحديد الجرعة المودعة على أساس عدد إلا إذا عدادات الجسيمات يتم وضعها قبل بيفيك وبعد بيفيك في تشغيل منفصلة. - كشف عوامل تصفية باستخدام الخطوة 2-2 من البروتوكول ومعدلات التعرض المطلوب الوقت والتدفق، في هذه الدراسة تم استخدامه لوقت تعرض 10 دقيقة في 0.5 LPM. إزالة بيفيك من الإنشاء. تأخذ بها إدراج ثقافة الخلية وتصفية المكشوفة في الفلتر تحت ظروف الرطوبة المنخفضة لمالا يقل عن 24 ساعة قبل القياسات.
- بيفيك نظيفة مع الإيثانول 70%. تعقيم بالأشعة فوق البنفسجية لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل التجربة المقبلة.
- وزن عامل التصفية تعرض ثلاث مرات وسجل الأوزان عامل تصفية. مكان التصفية المكشوفة في حامل تصفية مسمى للتخزين.
4-حساب جرعة المودعة وكفاءة الترسيب
ملاحظة: معرفة الترسب أمر مهم للإدارة الهباء الجوي وتفسير الاستجابة الخلوية.
-
حساب ترسب من القياسات المستندة إلى كتلة
- حساب كتلة المودعة في عوامل التصفية كالفرق بين متوسط الوزن للتعرض لما قبل وبعد التعرض متوسط الوزن. هذه القيمة هي الجرعة المودعة المستندة إلى كتلة للتجربة.
- استخدام إدارة الإعلام، مالمشرف، والمستندة إلى كتلة أودعت الجرعة تحدد في 4.1.1، مdep، لحساب كفاءة الترسيب المستندة إلى كتلة، ηم، للتجربة.
- متوسط القيم من 4.1.1 و 4.1.2 للتجارب على الأقل 3 لتحديد ترسب وترسب كفاءة بيفيك لحجم الجسيمات.
-
حساب ترسب من القياسات على أساس عدد
- التأكد من أن القياسات مع عدادات الجسيمات قد أجريت مع عدادات بعد بيفيك ولتحديد تركيز الجسيمات قبل بيفيك. دمج تركيز الجسيمات على مر الزمن للعداد الجسيمات ثم دمج أكثر الجسيمات القطر لتحديد المجموع الجسيمات قياسه.
- حساب عدد الجسيمات المودعة كالفرق بين الجسيمات التي تديرها والجسيمات قياس الوظيفة-بيفيك. هذه القيمة هي الجرعة المودعة على أساس عدد للتجربة.
- استخدام إدارة الجسيمات، نالمشرف، على أساس عدد أودعت تي الجرعة، نdep، معدل التدفق الحجمي، والخامس، والوقت،، لحساب كفاءة الترسيب على أساس عدد, ηن، للتجربة.
- متوسط القيم من 4.2.2 و 4.2.3 للتجارب على الأقل 3 لتحديد الترسب وكفاءة الترسيب بيفيك لحجم الجسيمات.
5-الأيروسول التعرض للخلايا
ملاحظة: للخلية يشار الثقافة في واجهة الهواء السائل القارئ فارغة وآخرون. 38 مشغلي يجب إجراء إدراج ثقافة الخلية تحميل (الخطوات 5.1.2-5.1.4) داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. ينبغي أداء مشغلي التعرض الهباء الجوي في غطاء دخان.
-
خلايا الثقافة في واجهة الهواء السائل
- رفع خلايا A549 من قارورة الثقافة عن طريق إضافة التربسين-يدتا، 3 مل لقارورة T75 أو 1 مل لقارورة T25 واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. إضافة مل 7 وسائط كاملة لقارورة T75 أو 4 مل من وسائل الإعلام كاملة T25 قارورة بقارورة وشطف الجدار قارورة مع تعليق خلية إلى أقصى حد عدد الخلايا المستردة. نقل تعليق خلية أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل ثم خلايا أجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 3 دقائق.
- إزالة طافية المحتوية على التربسين-يدتا وريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من وسائل الإعلام كاملة. إزالة 10 ميليلتر من تعليق خلية، وإضافة إلى هيموسيتوميتير. حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير لتحديد التركيز والعدد الكلي للخلايا.
- ضع 0.5 مل وسائط كاملة لكل بئر داخل صفيحة جيدا 24. مكان إدراج ثقافة الخلايا غير المستخدمة في الآبار. إدراج ثقافة الخلية البذور على الجانب قمي في كثافة خلية قرب 1 × 105 خلايا/سم2 لأنواع الخلايا التي تنمو بمعدل قرب مضاعفة في اليوم الواحد. للبذور A549 إدراج الخلايا ضمن 24 جيدا، وإدراج خلايا البذور في كثافة 1 × 105 خلايا/سم2 بإضافة خلايا 35,000 في ثقافة الخلية.
ملاحظة: يمكن المصنف الخلايا بمعدل نمو أبطأ في بكثافة خلية زيادة. - إضافة وسائط كاملة إلى جانب قمي إدراج ثقافة الخلية للوصول إلى وحدة التخزين النهائي (للوحة جيدا 24 الحجم النهائي 0.25 مل).
- الثقافة لمدة 7 أيام في ظروف المغمورة، واستبدال وسائط الإعلام كل يوم 1-2. بعد 7 أيام، إزالة قمي وسائط الإعلام والثقافة لمدة يوم واحد على الأقل في ظروف على، واستبدال وسائط الإعلام باسولاتيرال فقط.
-
تجميع بيفيك
- السماح بحجته إلى واجهة الهواء السائل لمالا يقل عن 24 ساعة قبل التعرض للخلايا.
- اختر الخلية المناسبة الثقافة إدراج محول بيفيك لدعم إدراج ثقافة الخلية مع عامل التصفية. إدراج ثقافة الخلية مكان قطعة محول على رأس بيفيك قاعدة، وضع موضع التنفيذ أن قاعدة قطعة محول أوسع من الأعلى. إضافة 4 مل من خلية ثقافة وسائل الإعلام من قاعدة بيفيك جيدا.
- إدراج استخدام الملقط لوضع ثقافة الخلية داخل قطعة محول وضعت في الخطوة 5.2.3. وضع رأس قطعة فوق قطعة محول، تسوية في مكان يكون قاعدة رأس قطعة أكبر من الأعلى. بعناية، التفاف بيفيك مع طبقة واحدة من شريط لاصق.
- ربط قطعة كاسيت 37 ملم في أعلى وأسفل بيفيك، عن طريق دفع في مكانها. ضع ¼ "الشائكة محولات في كاسيت مدخل ومخرج.
- لف سخان مقاوم حول بيفيك أن الأسلاك في الأساس. الشريط لتأمين.
- التفاف بيفيك ~ 8 جولات من رقائق الألومنيوم للعزل. تأمين مع الشريط.
- قم بتوصيل قطعة قصيرة من 1/2 "القطر الخارجي أنابيب مرنة للمحول على رأس بيفيك. إزالة الأنابيب المسامية من الماء المعقم ومكان داخل الأنابيب على رأس بيفيك.
- بيفيك مكان داخل المشبك العصابة على الوقوف وآمنة. إكمال إنشاء مضخة فراغ والهباء الجوي الإنشاء.
-
تعرض الخلايا على استخدام بيفيك
- استخدام كفاءة الترسيب المحدد في الخطوة 2 لحساب كتلة الجزيئات لتكون الضبوبيه. وزن الكتلة المناسبة وإضافة إلى النظام الأيروسول أنشئت في أعقاب الخطوة 2 داخل غطاء الدخان.
- فضح الخلايا عن طريق اتباع الخطوة 2، 2، وفي هذه الدراسة من نقاط النهاية البيولوجية الخلايا قد تعرضت لحوالي 3.5 ملغ من جسيمات نانوية النحاس بمعدل تدفق 0.5 LPM ومدة تعرض للحد الأدنى 10 دراسات مراقبة أداء استخدام الهواء هوميديفيد لتحديد تأثير الهواء وحدها. إزالة بيفيك من الإنشاء. تأخذ بها إدراج ثقافة الخلية ومكان في لوحة جيدا العقيمة والعودة إلى الحاضنة2 CO (37 درجة مئوية، 5% CO2، 90% رطوبة نسبية).
- نضح وسائل الإعلام من بيفيك. إذا كان إجراء المزيد من التجارب، مخزنة أسفل شطف بيفيك مع الفوسفات الحل ثم كرر الخطوة 5، 1 و 5-2.
- بيفيك نظيفة مع الإيثانول 70% عند الانتهاء. تعقيم بالأشعة فوق البنفسجية لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل التجربة المقبلة.
-
إجراءات المقايسة البيولوجية
ملاحظة: فحوصات القيام في هذه الدراسة تم توليد الأكسدة عن طريق التحليل دا دكفه وسيتوتوكسيسيتي من خلال إطلاق سراح نازعة لاكتات (رابطة حقوق الإنسان).- حل 24.4 مغ من دكفه دا في الميثانول 50 مل لجعل الحل 1 مم دكفه دا. ويمكن تخزين هذا الحل في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أشهر. تمييع 1 مم دكفه دا الحل عن طريق خلط 0.1 مل من 1 مم دا دكفه حل مع 9.9 مل حبس جعل 10 مل من 10 ميكرون دكفه-da.
- إزالة إدراج الثقافة خلية الإعلام الثقافة والغسيل الخلية مع حوالي 1 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 0.5 مل من 10 ميكرون دا دكفه حل لكل بئر، الاستعاضة عن إدراج عند الانتهاء. وتغطي اللوحة برقائق الألومنيوم لمنع فوتواكتيفيشن الصبغة والعودة إلى 37 درجة مئوية حاضنة ح 1.
- إزالة خلايا من الحاضنة ونضح الحل العامل دكفه دا من الآبار. إضافة 0.5 مل حبس للآبار واستبدال إدراج ثقافة الخلية.
- تحميل لوحة جيدا في لوحة قارئ والتدبير الأساس الفلورية استخدام أطوال موجية الإثارة/الانبعاثات من 485/530 نانومتر. إزالة لوحة من إدراج القارئ وتحميل لوحة إلى بيفيك للتعرض.
- تعرض الخلايا لمدة التعرض المرجوة. إزالة إدراج من بيفيك والعودة إلى لوحة جيدا. إزالة 50 ميليلتر من السوائل basolateral من لوحة جيدا والمكان في اللوحة البيضاء 96 جيدا. قياس الأسفار من منتدى التعاون الإنمائي استخدام أطوال موجية الإثارة/الانبعاثات من 485/530 نانومتر كل 30 دقيقة بعد التعرض ح 2.
- واسمحوا السائل basolateral حجته إلى درجة حرارة الغرفة عن 20-30 دقيقة إضافة 50 ميليلتر من رابطة حقوق الإنسان المقايسة الحل، بروتوكول الشركة المصنعة التالية مختلطة، والسوائل basolateral من لوحة جيدا وترك الرد للحد الأدنى 10 إضافة 25 ميليلتر من موقف حل جيد. قراءة الأسفار منتج ريسوروفين باستخدام موجات الإثارة/الانبعاثات من 560/590 نانومتر.
- إزالة السوائل باسولاتيرال إضافية وكرر الخطوة 5.4.6 في ح 4 و 24 ساعة بعد التعرض.
6 الأساليب الإحصائية
- تحليل بيانات المقايسة البيولوجية
- تقرير الإنتاج روس كزيادة كثافة fluorescence الخلايا المعالجة بالنسبة لقياسات أساسية. تقرير نشاط رابطة حقوق الإنسان كزيادة كثافة fluorescence الخلايا المعالجة بالنسبة للخلايا غير المعالجة.
- أداء عامل وحيد ANOVA لتحديد الفروق الإحصائية بين مجموعات البيانات. عند الاقتضاء، إجراء الطالب تي-اختبارات في قيمة الأهمية 0.05. الإبلاغ عن البيانات يعني ± الانحراف المعياري للقياسات التعرض ثلاثة على الأقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
علم السموم المهنية في المختبر ينطوي على الحفاظ على استمرارية الخلوية أثناء أداء التعرض الهباء الجوي. ويرد النظام بيفيك في الشكل 2، بما في ذلك درجة الحرارة والرطوبة المراقبة بيفيك البالية. وأبقى درجة الحرارة باستخدام سخان مقاوم البطارية وزيادة الأيروسول هوميديفيد باستخدام الترطيب الطبيعية عن طريق أنبوب المليئة بالثغرات، وترطب. في الهباء الجوي الخاضعة للرقابة وضع داخل مختبر، يمكن بيفيك الإعداد للتعرض هو مبين في الشكل 1. توصيف النظام يسمح لتحديد الجرعة المودعة على الخلايا التي يمكن أن تكون مرتبطة ارتباطاً ثم بالاستجابة الخلوية.
كفاءة الترسيب فيعتمد على حجم الجسيمات المضافة إلى النظام حيث تشمل القوات ترسب انحشار والترسيب، ونشرها. وباﻹضافة إلى ذلك، الترسيب تعتمد على معدل التدفق، وزمن التعرض للضوء، وخصائص النظام التعرض. مع هذه المعلومات، يمكن التنبؤ بالترسب. تم تحديد كفاءة الترسيب بيفيك من خلال طريقتين وتحليل الجاذبية والعد عدد الجسيمات. واستخدمت المعادلات 1 و 2 لتحديد أوجه الكفاءة التي ترسب في الجدول 1 باستخدام عامل التصفية على أساس، مسح حركة الجسيمات تحجيم (المكاتب الصغيرة)، والجسيمات الضوئية تحجيم (OPS) القياسات، الرقم 3. لوحظ زيادة ترسب عموما 24 تصميم جيدا من 6 تصميم جيد وينقص قليلاً عن 100 نانومتر بالمقارنة مع 40 نانومتر و 800 نانومتر النحاس الجسيمات. الترسب في الآبار 24 موحدة جداً على مدى الإدراج، إلا أن ترسب في تصميم جيدا 6 تفتقر إلى التوحيد كمعظم إيداع الجسيمات قرب المركز للإدراج. تحليل بعد التعرض يمكن التعجيل بتحديد الجرعة العلاقة بين عامل التصفية 37 ملم وإدراج ثقافة الخلية، تتناقص ضرورة لتحديد الجرعة بعد التعرض للهاتف الخلوي. وتظهر مقارنة الترسب داخل كاسيت تصفية 37 ملم وبيفيك ارتباط قوي لجميع الأحجام والآبار مع ارتباط بيرسون من أعلاه 0.7، ولكن فقط من أجل 800 نانومتر هو ارتباط كبير مع أ ف < 0.05، انظر الشكل 4. بالمقارنة مع نظم مماثلة في جميع أنحاء الأدب،11،12 كفاءة الترسيب بيفيك عبر نطاق أحجام الجسيمات اختبار قابلة للمقارنة أو زيادة على القيم المبلغ عنها، ولاحظ في الشكل 5. يمكن تحسين كفاءة الترسيب داخل بيفيك من خلال تقليل الخسائر إلى النظام باستخدام المواد البلاستيكية أو ما شابه الالكتروستاتيكي المسرف أو موصلة إلى تصميم بيفيك.
إذا كانت عوامل التصفية هي لم يجف جيدا في بيئة تسيطر عليها الرطوبة قبل التعرض، فائض المياه يزيد الكتلة الأولية ويمكن أن تنتج جرعات المودعة غير المادية، والسلبية. يمكن أيضا أن تعزز معدلات تدفق متغير جرعات المودعة غير متناسقة داخل النظام. لتجنب هذه المشاكل، السماح ليوم واحد على الأقل قبل وبعد التعرض لعوامل التصفية لتجف في بيئة تسيطر عليها الرطوبة.
سوف تتأثر بالجرعة المودعة الاستجابات الخلوية ويمكن أن تتأثر بمدة التعرض إذا كان لا يتم الاحتفاظ الخلايا بشكل صحيح. خلايا A549، خط خلية سرطان طلائي السنخية، تعرضوا لمدة 10 دقيقة إلى أحجام مختلفة من جسيمات نانوية النحاس بمعدل تدفق 0.5 LPM. تدفق عمودي البديلة استخدام نظم التعرض بين 0.005 LPM و 1.5 LPM لمدة تعرض مستمر بينما يستخدم هذا الأسلوب بمعدل تدفق معتدلة خلال تعرض سريع. استخدام كفاءة الترسيب المستندة إلى كتلة تقاس وتدار الجرعات، 1.58 ± 0.04 ملغ/سم2 من 40 نانومتر النحاس، 0.30 ± 0.00 ملغ/سم2 100 نانومتر النحاس الجسيمات، وأودعت 0.32 ± 0.01 ملغ/سم2 800 نانومتر النحاس الجسيمات على الخلايا. ولوحظ خلال أربع وعشرين ساعة الأولى بعد التعرض سيتوتوكسيسيتي والأكسدة. وتم قياس سيتوتوكسيسيتي استخدام إصدار نازعة لاكتات (رابطة حقوق الإنسان) من الخلايا التالفة فورا، 4 ساعات، ومدة 24 ساعة بعد التعرض. وكان هناك لا سمية كبيرة من الجسيمات النانوية النحاس أقل من 1.62 ملغ/سم2 خلال 4 ساعات تعرض، و الشكل 6b. أربع وعشرين ساعة بعد التعرض هناك كان انخفاضا يعتد به إحصائيا في بقاء الخلية أقل من 20% البقاء للخلايا المعرضة لجسيمات نانوية النحاس. كان التحقيق الأكسدة داخل الخلايا باستخدام مقايسة دا دكفه عن طريق أكسدة دكفه حسب الأنواع الأكسجين التفاعلية داخل أول ساعتين بعد التعرض، الشكل 6a. تم قياس مستويات كبيرة من الأكسدة في ثلاثين دقيقة بعد التعرض للخلايا المعرضة لجسيمات نانوية النحاس من جميع الأحجام. استمر مستوى الأكسدة زيادة في معدلات مماثلة لجميع الأحجام اختبارها خلال ساعتين ولاحظ.
ويمكن تحديد نجاح التعرض من خلال التكرار الاستجابة الخلوية. اثنين من معايير القبول المقترحة لتشمل فحوصات سيتوتوكسيسيتي: تسرب رابطة حقوق الإنسان مجموع % 1) لعنصر التحكم الإيجابي يجب أن تكون أكبر من 50%، و 2) معامل تكرار الإيجابية وعينه من الاختلافات ينبغي أن يكون ضمن 50%. اجتمع 39 إذا لم تكن هذه المعايير، هذه الاختلافات يوحي بين التجارب، مثل المبالغ ترسب غيرت، أو ضعف مراقبة درجة الحرارة أو الرطوبة أو. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن مراقبة القياسات سيتوتوكسيسيتي يؤدي إلى فهم عناصر تجريبية والمساعدة في تحديد الخطأ. عند معدل تدفق مرتفع جداً، قد تموت الخلايا من كميات عالية من إجهاد القص. عن طريق خفض معدل التدفق، يمكن تقليل الضغط على الخلايا من التدفق.
رقم 1. التخطيطي نظام تشتت الجافة والإعداد التجريبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. تصميم بيفيك. A) تصميم كامل الصورة مع مربع طوله 30 سم للمقارنة. ب) الصورة بيفيك مع درجة الحرارة والرطوبة التحكم مع 30 سم مربع طويل القامة للمقارنة. ج) بيفيك البالية. د) بيفيك رأس قطعة. ﻫ) خلية محول الثقافة 24 جيدا (يسار) وكذلك 6 (يمين). و) أسفل قطعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| عدد أساس كفاءة الترسيب (%) | الشامل على أساس كفاءة الترسيب (%) | ||||||
| 6 جيدا | 40 نانومتر | 17.83 | ± | 32.13 | 5.85 | ± | 0.85 |
| 100 نانومتر | 0.47 | ± | 4.06 | 5.11 | ± | 0.94 | |
| 800 نانومتر | 3.70 | ± | 35.00 | 6.39 | ± | 1.01 | |
| 24 جيدا | 40 نانومتر | 1.43 | ± | 2.43 | 12.61 | ± | 1.34 |
| 100 نانومتر | 1.37 | ± | 19.45 | 2.95 | ± | 0.75 | |
| 800 نانومتر | 6.98 | ± | 3.93 | 15.95 | ± | 0.53 | |
الجدول 1. بيفيك كفاءة الترسيب.
الشكل 3. تركيز عدد الجسيمات هباء نانوحبيبات النحاس. A) قياس المكاتب الصغيرة. ب) القياس مكتب خدمات المشاريع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. العلاقة بين الترسيب في إدراج خلية وتصفية 37 ملم سكك. خطأ ± 0.002 ملغم. A) 40 نانومتر النحاس الجسيمات. ب) 100 نانومتر النحاس الجسيمات. ج) 800 نانومتر النحاس الجسيمات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. كفاءة الترسيب بيفيك مقارنة بنظم تدفق عمودي للتعرض في الأدب. "قيم الأدب" من "نظم التعرض تدفق عمودي" يتم رسم "علامات الصلبة" و "القيم بيفيك" في "علامات فارغة". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. الاستجابة الخلوية للنحاس جسيمات نانوية بعد التعرض (PE)- لكل القياسات، n = 3 وف < 0.05. A) الأكسدة تحدد باستخدام "مقايسة" دا دكفه. ب) سيتوتوكسيسيتي تحدد باستخدام "مقايسة رابطة حقوق الإنسان". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أشرطة الكاسيت تصفية توفر طريقة بسيطة وغير مكلفة لجمع الهباء الجوي في منطقة التنفس؛ غير أن الهباء الجوي العينات المستخرجة من المرشحات تمثل الأيروسول كاملة (أي غازات والتطاير والجسيمات) وبالتالي الحد من تقييم الآثار البيولوجية ذات الصلة. استخدام التصميم الأولى للكاسيت تصفية 37 ملم، بيفيك يهدف إلى الحفاظ على قابلية وتقليد في فيفو ترسب الجسيمات من استنشاق. بيفيك أصغر بكثير من النظم الحالية على التعرض، بحجم مربع الأنسجة مع مراقبة درجة الحرارة والرطوبة وشملت تقريبا. الحجم مشابه لتتالي شخصية الرواطم حين تقدم البيانات في الاستجابة الخلوية للهباء الجوي بالإضافة إلى ذلك. في حين بيفيك يتضمن مساحة لنموذج واحد بالمقارنة مع النظم الأخرى التعرض الحالي، صغر حجم تصاريح أنظمة متعددة لاستخدامها في وقت واحد، لذلك، زيادة حجم العينة، والسماح للتوزيع المكاني رصد.
وهناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول. لتحديد كفاءة الترسيب، من الضروري بشكل صحيح حالة عوامل التصفية، كما هو موضح في الخطوة 1. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن تزن جسيمات نانوية النحاس قبل التعرض وتعرض وظيفة عامل التصفية لتحديد كفاءة الترسيب المستندة إلى كتلة بشكل صحيح. يجب أن تحدد كفاءة الترسيب عدد الفرق في الترسب بين تركيز الهباء الجوي الأولية والتركيز النهائي المحدد باستخدام عدادات الجسيمات باستخدام. إذا لم يتم تحديد كفاءة الترسيب بشكل صحيح، من الصعب تحديد الفروق البيولوجية واستجابة بين أنواع الهباء الجوي. وتشمل التعديلات إلى الترسب تغيير الترسب. ويمكن زيادة ترسب بتغيير مدة التعرض ومعدل التدفق. هذا قد تؤثر أيضا على بقاء الخلية مع إمكانات التجفيف خارج الخلايا. غالباً ما يتم تكييف الهباء الجوي للتعويض عن الصفات الفسيولوجية مثل درجة حرارة الجسم والترطيب في الخطوط الجوية. يحاكي الهواء المستنشق زيادة الرطوبة، أكثر من 50%، ويقلل من موت الخلايا نتيجة للتعرض للمركبات. 43 عند درجة الحرارة والرطوبة لا تسيطر جيدا، يمكن أن يتأثر الاستجابة الخلوية. خلال خفض معدل التدفق، ستودع جزيئات إضافية من جميع الأحجام، زيادة الترسب. مدة التعرض غير متناسب إلى ترسب، السماح لجزيئات أكثر من إيداع لفترة تجريبية طويلة. تكييف للأيروسول مهم عند زيادة مدة التعرض لكي لا تجف الخلايا التي يمكن أن تؤثر على استجابات بيولوجية.
بيفيك يستخدم التدفق العمودي لإيداع الجسيمات عبر انحشار والترسيب، ونشرها على الخلايا التي يمكن أن تجف الخلايا عن طريق التدفق وأضاف الإجهاد على الخلايا. كفاءة الترسيب فيعتمد على حجم الجسيمات بسبب القوى للترسيب. العديد من أنظمة التعرض الحالي مع تدفق عمودي بكفاءة ترسيب أقل من 10% والكثير أقرب إلى 1%. بيفيك قد ترسب كفاءة يحدده تحليل الجاذبية من 3% إلى 16% 24 خلية أيضا إدراج الثقافة. كفاءة الترسيب على أساس عدد الجسيمات هو حوالي 1% إلى 7% لإدراج نفس. عند استخدام 6 كذلك إدراج خلية ثقافة، وتنخفض هذه الأرقام، باستثناء أصغر حجم الجسيمات، نتيجة لتبسيط الأيروسول كما تقتصر جسيمات أكثر في إدراج ثقافة الخلية دون مساحة لتدفق إلى تطوير. إدراج ثقافة الخلية جيدا 6 تسمح بتيارات الهباء الجوي لتجاوز الترسيب. تتسم نظم تدفق عمودي الأخرى على أساس جماعي استخدام 60 نانومتر fluorescein الجسيمات40، 80 180 نانومتر النحاس الجسيمات16، شمال البحر الأبيض المتوسط و جزيئات حمض الأديبيك شمال البحر الأبيض المتوسط 6041. الكفاءة الترسب الناتجة بصفة عامة بين 0.05% و 11%. على أساس عدد، تميزت هذه الأنظمة باستخدام جزيئات البوليستيرين12،15و جسيمات نانوية الكربون12السيليكا الجسيمات42، مما أسفر عن زيادة الكفاءة بين 0.2% و 11%. بيفيك يوفر، ترسب مماثلة أو زيادة، مقارنة بأجهزة التعرض الخلوية المتوفرة.
أجريت التعرض الخلية باستخدام الجسيمات النانوية النحاس 40 نانومتر، 100 نانومتر، و 800 نانومتر. تم تعريف بقاء الخلية باستخدام مقايسة رابطة حقوق الإنسان مع أي انخفاض كبير في البقاء ضمن أربع ساعات بعد التعرض. مقايسة رابطة حقوق الإنسان كان المستخدمة مع نظام تجاري تعرض ل 74 نانوغرام/سم2 بعد ساعتين و 148 نانوغرام/سم2 بعد 4 ساعات من 9.2 جسيمات أكسيد النحاس شمال البحر الأبيض المتوسط44 و 1 ميكروغرام/سم2 تودع بعد تعرض متسلسلة 4 ساعات، حضانة 2 ساعات، ثم تعرض آخر لمدة 4 ساعات من 25 نانومتر النحاس أكسيد الجسيمات40، كل قياس انخفاض كبير في بقاء الخلية. ولاحظ سيتوتوكسيسيتي في نظام آخر ل 1.6 7.6 ميكروغرام/سم2 من 180 نانومتر الجسيمات جسيمات نانوية النحاس16 قياس تريبان الأزرق صبغ الاستبعاد. انخفضت إمكانية التعرض لمدة 15 دقيقة إلى 40-80 نانومتر النحاس أكسيد جسيمات نانوية، قياس التعرض بعد 24 ساعة. كان أقل سمية ولاحظ استخدام بيفيك احتمالاً بسبب وقت التعرض أقصر من مدة 10 دقائق وأوقات قياس التعرض وظيفة أقصر. بعد أربع ساعات بعد التعرض، صلاحية الخلايا مكشوف في بيفيك تناقص. الخلايا عرضه لعناصر الهواء الرطبة ولاحظ لا سيتوتوكسيسيتي كبيرة، باﻻتفاق مع سائر الدراسات40، 9،44،،من4546. مصممة الأكسدة باستخدام مقايسة دا دكفه. إنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية، مثل فوق أكسيد الهيدروجين أو الأكسجين الجذور، التي تم إنشاؤها بمقدار الضغط الذي يمكن أن يؤدي إلى وفاة القبض أو الخلية النمو. بعد التعرض الخلية، هناك زيادة ضئيلة في الأكسدة للاحتفاظ بها في الحاضنة كمراقبة الخلايا والخلايا المعرضة للهواء الرطبة. حدثت الأكسدة مرتفعة بالنسبة لجميع أحجام الجسيمات، زيادة في غضون 30 دقيقة بعد التعرض. في دراسة واحدة، وجسيمات أكسيد النحاس شمال البحر الأبيض المتوسط 9.244 وجسيمات أكسيد النحاس شمال البحر الأبيض المتوسط 25 أيضا40 الناجم عن الأكسدة يقاس عن طريق الإنزيم كاربوكسي-دكفه-دا. زيادة التعرض الوقت من ساعتين إلى 4 ساعات الأكسدة مرتفعة ل جسيمات أكسيد النحاس شمال البحر الأبيض المتوسط 9.244. بعد أربع ساعات تعرض، تنتج جسيمات أكسيد النحاس نانومتر 9.2 استجابة عنصر مؤكسد مماثلة متسلسلة تعرض 25 نانومتر النحاس أكسيد الجسيمات40، مما يوحي بأن التعرض مدة له تأثير أكبر على استجابة الأكسدة من حجم الجسيمات. إنتاج خلايا مكشوف داخل بيفيك الأكسدة مرتفعة مقارنة بتلك الدراسة، ولكن الجسيمات مكشوف في نظام بديل أكسيد النحاس وسوف تذوب بسرعة أقل من النحاس يتعرض داخل بيفيك. إجراء دراسات على انحلال النحاس على أساس التكوين وتوافق حجم الجسيمات أن الجسيمات الأكبر حجماً وأكاسيد معدنية الإفراج عن أيونات أبطأ من جزيئات معدنية أو على نظرائهم نانوحبيبات16،47 , 48 , 49 كعناصر الهواء الرطبة لا تنتج كميات كبيرة من الأكسدة بالمقارنة مع سيطرة حاضنة، تأثير جسيمات النحاس للحث على الأكسدة يتسق داخل بيفيك مماثلة في المختبر التعرض نظم. الاستجابات البيولوجية ولاحظ استخدام بيفيك تشير إلى أن بيفيك نظام مناسب للتعرض للهاتف الخلوي.
بينما توصيف والدراسات الخلوية بيفيك تتفق تماما مع الأدب،9،،من1640،،من4446 الجهاز على القيود. تصميم صغير يقلل من عدد العينات التي يمكن أن تتعرض لها في وقت واحد داخل جهاز واحد بالمقارنة مع غيرها من نظم التعرض. تسمح النظم الأخرى للتعرض الخلوية ثلاثة على الأقل إلى نفس الهباء الجوي9،12 تيسير تكرار القياسات. رغم أن بيفيك يسمح فقط بإدراج واحدة كل نظام، صغر حجم يسمح لأنظمة متعددة استخدامها بسهولة، تساعد على التخفيف من حدة هذه المشكلة. بينما نظم الرصد شخصية أخرى لا تستخدم الخلايا، بيفيك يجب أن يبقى قرب العمودي للحد من تسرب وسائل الإعلام ثقافة الخلية ضرورية للحفاظ على استمرارية الخلوية. على الرغم من أن ليس بعد الأمثل بيفيك لنطاقات معينة من الجسيمات (مثلاً الساعة10، م2.5م0.1)، اتسمت بيفيك لطائفة من أحجام الجسيمات. مماثلة لغيرها من نظم تدفق عمودي، بيفيك يظهر انخفاض قدرة على إيداع الجسيمات قرب 100 نانومتر في القطر، بينما 40 نانومتر و 800 نانومتر الجسيمات المودعة بكفاءة مماثلة.
يمكن التعجيل بتحليل الخلايا بعد التعرض عن طريق تنفيذ مجموعة موازية من الهباء الجوي داخل بيفيك وسكك 37 ملم تصفية كاسيت. ارتباط ارتفاع ترسب يستند إلى قياس الجاذبية يسمح لتقدير كتلة الجسيمات التي تم جمعها في الخلايا من البيانات التي تم جمعها باستخدام مرشحات 37 ملم. مقارنة يضاف إلى كاسيت تصفية يقلل الحاجة إلى جمع عينات إضافية وقياسات إضافية لتحديد الجرعة. التقدم في العمل يتضمن إدماج نظام الرصد في الوقت الحقيقي سيتوتوكسيسيتي، والأكسدة، أو نقاط النهاية البيولوجية الأخرى. صغر حجم بيفيك يسمح لها باستخدامها في مجموعة متنوعة من الإعدادات، كما هو الحال في الجسم كجهاز شخصي، على طائرة بدون طيار فوق مصنع للمواد كيميائية، أو خارجها في البيئة للقرار المكانية. وقد أظهرت هذا الأسلوب استخدام بيفيك لجمع جزيئات الهباء الجوي على الثقافات الخلية التي نمت في على. بتكييف الأيروسول 37 ± 1 درجة مئوية والرطوبة النسبية > 80 ٪، يمكن الحفاظ على استمرارية الخلوية أثناء التعرض الحاد. هذا الأسلوب المناسب للقطرة السائلة والصلبة المستندة إلى جسيمات الهباء الجوي، ولقد ثبت أن تودع الجزيئات بين 40 نانومتر و 800 نانومتر في إدراج ثقافة الخلية. براعة بيفيك يسمح هذا الأسلوب لاستخدامها في إعدادات متعددة مع مجموعة متنوعة من نقاط النهاية البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
انتماء الكتاب كما موضح في صفحة الغلاف. الكتاب معتمدة ماليا بجامعة فرجينيا كومنولث، حيث اكتمل العمل في ريتشموند، فرجينيا. المؤلفين قد المسؤولية الوحيدة لكتابة ومضمون هذه الورقة. الكتاب يعلن أن هناك لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر سولومونوف بوريس وفرجينيا كومنولث الابتكار آلة متجر للحصول على تعليمات النماذج الأولية السريعة الجهاز. الكتاب أيضا يود أن يشكر كريستيان روميرو-فوينتيس الفريق ليونسكي والدكتور فيتالي أفروتين، الدكتور ديمتري بيستوف، وفرجينيا كومنولث المواد النانوية الأساسية توصيف مرفق لمساعدتهم مع توصيف الجسيمات. وأيد هذا العمل بدء التشغيل الأموال المقدمة للدكتور ليونسكي من كلية الهندسة في جامعة فرجينيا كومنولث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scanning mobility particle sizer (SMPS) | TSI, Inc. | 3910 | NanoSMPS |
| Optical particle sizer (OPS) | TSI, Inc. | 3330 | |
| Stainless Steel Pipe, 4" Long | McMaster-Carr | 4830K116 | Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size |
| Brass Ball Valve with Lever Handle | McMaster-Carr | 4112T12 | Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female |
| Steel Pipe, 2" Long | McMaster-Carr | 7753K121 | Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size |
| HEPA filter | GE Healthcare | 09-744-12 | HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule |
| Vacuum Generator | PISCO USA | VCH10-018C | |
| PIVEC | VCU | For design please contact authors | |
| Resistive heater | |||
| 1/4" barbed connectors | Zefon International, Inc. | 459743 | |
| Porous tubing | Scientific Commodities, Inc. | BB2062-1814A | Hydrophilic 10 um pores |
| Battery power bank | |||
| Cell culture insert | Fisherbrand | 353095 | 24 well plate insert |
| Filter Forceps | Fisherbrand | 09-753-50 | |
| Transfer Pipette | ThermoScientific | 13-711-27 | |
| Glass Fiber Filters | SKC | 225-7 | Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore |
| Ultra Micro Balance | A&D | BM-22 | Housed in environmental chamber |
| 37 mm filter cassette | SKC | 225-3250 | Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene |
| Variable flow vacuum pump | SKC | 220-5000TC | AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min |
| Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1090 | 40 nm |
| Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1088 | 100 nm |
| Copper Particles | U.S. Research Materials, Inc. | US1117M | 800 nm |
References
- Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
- Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
- Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 76-85 (2010).
- Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
- de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
- Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
- Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3 (4), 348-354 (2009).
- Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
- Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013 (1), 1-15 (2013).
- Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
- Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
- Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
- Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51 (9), 5259-5269 (2017).
- Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. , Elsevier. (1995).
- Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
- Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26 (2), 84-93 (2013).
- Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. , CRC Press. Boca Raton. (2005).
- de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
- Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10 (10), 2852-2864 (2014).
- Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
- Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
- Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. , 1-32 (2016).
- Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97 (1), 163-180 (2007).
- Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20 (May 2007), 319-337 (2008).
- Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 20 (2014).
- Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
- Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. , 1-15 (2015).
- Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8 (3), 2439-2455 (2014).
- Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9 (1), 33 (2012).
- Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103 (1), 108-115 (2008).
- Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. , 167-175 (2016).
- Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36 (7), 896-932 (2005).
- Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19 (Suppl. 1), 229-239 (2007).
- Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
- Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 16 (2016).
- Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41 (2), 135-153 (1997).
- Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47 (11), 1267-1275 (2013).
- Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19 (3), 392-405 (2006).
- Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
- Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27 (1), 164-173 (2013).
- Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26 (0), 228-235 (2013).
- Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
- Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
- Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29 (3), 502-511 (2015).
- Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
- Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
- Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9 (7), 970-982 (2013).
- Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5 (2), 269-281 (2011).
- Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5 (3), 389-399 (2009).
