Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Een nieuwe draagbare In Vitro blootstelling Cassette voor aërosol bemonstering

Published: February 22, 2019 doi: 10.3791/58916
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemical and Life Science Engineering, Virginia Commonwealth University

Summary

Hier presenteren we een protocol te voeren draagbare cellulaire aërosol belichtingen en meten van de cellulaire reactie. De methode maakt gebruik van cellen, geteeld op de lucht-vloeistof-interface, het nabootsen van in vivo fysiologie. Cellulaire reactie op koperen nanoparticle aërosolen werd waargenomen als oxidatieve stress door middel van reactieve zuurstof soorten generatie en cytotoxiciteit als lactaat dehydrogenase release.

Abstract

Dit protocol introduceert een nieuwe in vitro blootstelling systeem, dat kan worden gedragen, met inbegrip van de karakterisering en de prestaties. Lucht-vloeistof (ALI) in vitro blootstelling interfacesystemen zijn vaak groot en volumineus, vervoer naar het veld en de werking bij de bron van de emissie of in de individuele ademzone bemoeilijken. Door middel van miniaturisatie van deze systemen, kan het lab naar het veld, de bespoediging van de verwerkingstijd en het verstrekken van een passender blootstelling methode die niets aan het aërosol verandert voordat u contact opneemt met de cellen worden gebracht. De Portable In vitro blootstelling Cassette (PIVEC) past een 37 mm filter cassette te voorzien in in vitro toxiciteit buiten de instelling van een traditioneel laboratorium. De PIVEC werd gekenmerkt met drie maten van koperen nanodeeltjes om te bepalen van de efficiëntie van de depositie op basis van gravimetrische en deeltje nummer concentratie analyse. Eerste cytotoxiciteit experimenten werden uitgevoerd met blootgestelde longkanker cellen om te bepalen van het vermogen van het systeem om te storten van deeltjes met behoud van de levensvatbaarheid van de cellen. De PIVEC biedt een vergelijkbare of hogere afzetting efficiëntie wanneer het vergelijken bij beschikbaar loodrecht stroom in vitro blootstelling apparaten. Ondanks de lagere doorvoersnelheid van de steekproef geeft de geringe omvang enkele voordelen aan de huidige in vitro ALI blootstelling systemen. Deze omvatten de mogelijkheid om te worden gedragen bij het toezicht op persoonlijke, mobiliteit van het laboratorium naar de bron van de emissie en de optie om meerdere systemen voor ruimtelijke resolutie met behoud van een lagere gebruiker kost. De PIVEC is een systeem dat kan verzamelen van aërosolen in het veld en in de individuele ademzone op een lucht-geïnterfacet, in vitro model.

Introduction

Persoonlijke bemonstering met behulp van in vitro technieken kon bieden uitgebreide informatie over de biologische effecten van aërosolen op de werkplek. 1 blootstelling aan verontreinigingen in de lucht zijn blootstelling aan de chemische stof zelf, voor de verzamelde lucht monsters, verzonken omstandigheden waar het gas wordt geïntroduceerd op de celsuspensie, intermitterende vorderingen met behulp van een apparaat zoals een rocker, of direct blootstelling aan de lucht-vloeistof-interface (ALI). 2 veel van deze technieken worden uitgevoerd met cellen gekweekt in de schorsing of het verzamelen van monsters vóór de blootstelling, die elk kan invloed hebben op de toxicologische studie vanwege mogelijke veranderingen in de spuitbus. 3 als u wilt voorkomen dat deze veranderingen, het laboratorium kan worden gebracht naar het veld met behulp van verscheidene in vitro ALI cultuur blootstelling systemen die worden gebruikt in literatuur,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 weinigen zijn echter commercieel beschikbaar. 8 , 9 , 12 deze systemen zijn vaak omvangrijk zijn, vooral wanneer met inbegrip van instrumenten voor het regelen van de temperatuur en de vochtigheid van de cellulaire omgeving en de stroomsnelheid van het monster aërosol. Met behulp van de PIVEC, kunnen blootstelling van de spuitbus worden uitgevoerd buiten de instelling van een traditionele lab of in de ademhalingszone terwijl het nabootsen van inhalatie voorwaarden.

De bepaling van het aërosol afzetting in vitro is belangrijk om het onderzoek naar de effecten op de gezondheid als gevolg van inhalatie. De ademhalingszone, het gebied binnen 30 cm vanaf de mond en neus,14 is van cruciaal belang voor het begrijpen van de blootstelling aan nanodeeltjes en voor het koppelen naar de biologische effecten in de longen. 2 vaak de depositie op cellen wordt gedefinieerd als een afzetting-efficiëntie, de deeltjes op gestort en in beslag genomen door de cellen verdeeld door de deeltjes toegediend aan het systeem6,15 , of op basis van massa van de dezelfde bedragen. 4 , 16 de huidige methoden voor het meten van aërosolen in de individuele ademzone zijn filter gebaseerd, vastleggen van deeltjes in de periode van een bepaalde bemonstering en met behulp van de filters te voeren verder te worden getest. 17 persoonlijke controle vereist een kleine systeem dat wordt geleverd met de afweging van minder monsters.

Er zijn vele benaderingen om te bepalen van de effecten op de gezondheid van blootstelling aan een aerosol. Het ALI-model voorziet de aërosol toegediend worden rechtstreeks naar de cellen door de lucht als in een echte blootstellingsscenario, maar is het kosteneffectiever en minder tijd intensief dan in vivo studies terwijl het nabootsen van de lucht-liquid belemmeringen, zoals de ogen, huid en longen. Longkanker cellen geteeld op de ALI hebben de mogelijkheid om het genereren van een gepolariseerde barrière laag,18,19 , die fysiologische eigenschappen die lijken op de in vivo Long epitheel produceert, met inbegrip van de productie van slijm en oppervlakteactieve stof in specifieke bronchiale of alveolaire cellijnen, cilia verslaan, strakke kruispunten van19 ,20 en cel polarisatie van de19,. 18 veranderingen zoals dit kunnen invloed hebben op het cellulaire antwoord gemeten in toxiciteit. 21 voorts ALI in vitro model resultaten zijn vaak gevoeliger dan cellen blootgesteld via schorsing modellen22 en kunnen naar model acute in vivo inhalatietoxiciteit. 23 , 24 daarom, een ALI blootstelling systeem welk vermag voeren metingen in de ademhalingszone is een natuurlijke volgende stap.

Door de cellen te aërosol direct bij de bron van de emissie bloot te stellen, doet zich voor onderzoek van de effecten van alle gassen, semi-vluchtige stoffen en deeltjes die betrokken zijn bij het mengsel. Wanneer het mengsel is verzameld op een filter, de gassen en vluchtige stoffen niet worden gevangen en het hele mengsel kan niet worden onderzocht. Daarnaast kan reconstitutie van deeltjes in een poeder of een vloeibare suspensie leiden tot de samenvoeging of particle-vloeistof interacties, zoals de ontbinding, de schorsing van de vloeibaar. 25 , 26 wanneer aërosol deeltjes worden toegevoegd aan de vloeistof, er is een hoger potentieel voor agglomeratie,25,27 vorming van een eiwit corona,28 of interactie met verbindingen in de vloeistof, die kan van invloed zijn op de depositie en de biologische reactie beïnvloeden. 29 , 30

Blootstelling bij de ALI is gebaseerd op de drie belangrijkste aërosol profielen, wolk beslechting, parallelle stroom en loodrecht stroom. Cloud afwikkeling, gebruikt door de Air-Liquide Interface cel blootstelling (ALICE),4 is een systeem van de partij waar de deeltjes storten door middel van zwaartekracht en diffusional regelen zoals het aërosol wordt behandeld als één eenheid. Parallelle stromen, gebruikt door de elektrostatische aërosol in vitro blootstelling systeem (DAKRAND)5 en multiculturele blootstelling kamer (MEC) II,6 afzetting door de toevoeging van de Brownse beweging via het profiel van stroom voorziet. Loodrecht stroom, gebruikt door een microsprayer,7 Nano Aerosol kamer voor In-Vitro toxiciteit (NACIVT),11 en commerciële ALI systemen8,9,10,12, voegt de impactie van deeltjes binnen de regio afzetting. Veel van deze blootstelling systemen zijn groot en volumineus, overtollige systemen voor aërosol preconditionering, pompen voor stroom, of zelfs verwarming kamers voor incubatie van cellen vereisen. Deze grote verkleind de overdraagbaarheid van het systeem. In plaats van bemonstering direct bij de bron van de emissie hebben deze systemen vaak monsters naar het lab of model aërosolen gegenereerd voor analyse gebracht. De complexiteit van het uitgestoten aërosol kan worden verloren in de vertaling uit het veld naar het lab. De PIVEC is kleiner dan de huidige systemen, met een externe oppervlakte van ongeveer 460 cm2 en weegt slechts 60 gram, met warmte en vochtigheid controle opgenomen in het systeem toe te staan voor een zeer draagbaar apparaat. De verminderde grootte en het gewicht zodat het systeem kan worden gedragen of genomen om de bron van blootstelling, directe bemonstering het toelaat.

De grote omvang van de huidige blootstelling systemen vermindert ook de mogelijkheid voor het uitvoeren van steekproeven om te onderzoeken ruimtelijke verlopen in concentraties. Deze resolutie is de sleutel bij de bepaling van de toxicologische effecten van vele potentiële milieu- en beroepsrisico's zoals autoverkeer uitlaat deeltjes materie of werkplek activiteiten waar de aerosolization plaatsvindt. Onmiddellijk na emissie, wordt er een ruimtelijke variantie in deeltje concentratie. Dit groeit met de tijd als de deeltjes in de hele atmosfeer verspreiden en deze effecten kunnen wijzigen op basis van de omgevingsomstandigheden, zoals temperatuur, druk, wind en zon. Deeltjes kunnen beginnen om te verouderen en ook eens uitgestoten31,32 oxideren en versnippering tarieven worden beïnvloed door de topografie; hogere concentraties zal worden gevonden in de canyons en tunnels, waar dispersie effecten zijn vertraagd, en lagere concentraties kunnen worden gevonden waar er een groot gebied voor verspreiding. 33 deze veranderingen in de tarieven van de dispersie significante effecten op de menselijke gezondheid kunnen hebben en kunnen worden gezien bij de vergelijking van het aantal astmatische volwassenen wonen in stedelijk versus op het platteland. 34 terwijl veel blootstelling systemen meerdere monsters tegelijk bieden, meerdere systemen nodig zijn met een overvloed van grote apparatuur voor het uitvoeren van ruimtelijke resolutie.

Doordat het lab naar het veld, kan het tijdstip van de analyse met behulp van de hele cel als een sensor worden verlaagd. Na de bekende biologische mechanismen en eindpunten kan helpen bij de bepaling van de aërosol samenstelling en grootte. Als gevolg van langzame klaring methoden, met inbegrip van de goedkeuring van de mucociliary en fagocytose translocatie, zijn deze deeltjes vaak interactie met cellen ongeveer dagen tot weken3 genereren van oxidatieve stress, ontsteking en zelfs de dood van de cel. Deze biologische eindpunten kunnen de uitgangspunten voor de ongunstige uitkomst trajecten voor hart-en vaatziekten of chronisch obstructief longlijden. Daarnaast uitgevoerd Wiemenn et al. een array van in vitro tests te vergelijken met de waarden van de literatuur voor korte termijn in vivo inhalatietoxiciteit. 35 In vivo reactie werd voorspeld met twee van de vier positieve resultaten van het testen van cytotoxiciteit via lactaat dehydrogenase release, oxidatieve stress van glutathion vermindering en waterstofperoxide vorming en release en ontsteking van potentiële de tumor necrose factor Alfa genen. Uit tien nanosized metaaloxiden getest, zes getest als actieve (titaniumoxide, zinkoxide en vier verschillende cerium oxide) met posities in vitro bevestiging in vivo. 

Onze lab ontwikkeld om te bestuderen van de effecten van aërosolen in een professionele omgeving, de PIVEC voor de vorderingen op het gebied. Bovendien, de PIVEC kan worden gedragen voor persoonlijke bemonstering te controleren en onderzoeken van blootstelling door inhalatie als de 37 mm filter cassette36 of meerdere systemen kunnen worden gebruikt om ruimtelijke resolutie binnen een bepaald gebied. In dit protocol, de karakterisering en het gebruik van de PIVEC besproken. Na de blootstelling, worden de biologische effecten waargenomen door middel van cytotoxiciteit testen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Exploitanten moeten het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. laboratoriumjas, handschoenen, bril) wanneer het uitvoeren van stap 1, 2, 3, 5 en 6.

1. voorbereiding van de materialen

  1. Materialen voor montage van het systeem en belichting om de herhaalbaarheid voor te bereiden.
    1. Zorg ervoor dat gebruik nieuwe of 70% ethanol gereinigd ¼" binnendiameter geleidende buis en ¼" buitendiameter connectors voor de montage van het systeem.
    2. Winkel test materialen met inbegrip van filters, PIVEC onderdelen, pincet en deeltje poeders in een goed gecontroleerde omgeving, met betrekking tot de temperatuur en vochtigheid, gedurende ten minste 24 uur vóór het experiment.
      Opmerking: Moet de temperatuur in de buurt van kamertemperatuur, ongeveer 20 ° C, relatieve vochtigheid, minder dan 35%. Dit is zeer belangrijk om de herhaalbaarheid tussen experimenten.
    3. Bereiden deeltjes teller met behulp van isopropanol te reinigen onderdelen en laat voor de opwarming van het systeem te berekenen overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant, met inbegrip van de scanning mobiliteit deeltje sizer (SMPS) en optische deeltjesgrootte sizer (OPS) voor het meten.

2. productie van droge Aerosol

Opmerking: Operators moeten uitvoeren aërosol generatie in een zuurkast.

  1. Monteren van een systeem voor het genereren van droge aërosolen
    Opmerking: De opschorting van de deeltjes in een gas of vloeistof moet geschikt zijn voor de gemodelleerde toepassing en cel-cultuur. De volgende methode kan worden uitgevoerd met behulp van een vloeistof gebaseerde aërosol. Het ontwerp van het systeem van droge aërosol is van Tiwari et al. 37 een schematische voorstelling van de droge versnippering systeem is afgebeeld in Figuur 1.
    1. Sluit de kogelklep aan elk uiteinde van de 4" 1/8 maat schroefdraad pijp, dit zal dienen als het deeltje hopper. 2" 1/8 grootte pijp verbinden met een klep.
    2. Weeg koperen nanodeeltjes, in deze studie de massaconcentratie voor elke grootte van de deeltjes constant gehouden werd terwijl de bepaling van het rendement van de depositie. Ongeveer 7,5 mg 40 nm koperen nanodeeltjes, 7 mg 100 nm koperen nanodeeltjes en 13 mg van 800 nm koperen nanodeeltjes per blootstelling te gebruiken. Plaats koper nanodeeltjes in de trechter van de deeltjes via het open einde.
      Nota: Het bedrag van de koper nanodeeltjes woog zal dienen als de massa op basis van door de overheid gereguleerde concentratie.
    3. Plaats een 3" stuk van ½" buitendiameter (OD) buis rond de 2" pijp en plaats een HEPA filter binnen deze korte buis zodanig dat de stroomrichting is via de kogelklep.
    4. De vacuüm generator verbinden met andere kogelkraan met behulp van threading. Vacuüm generator verbinden met lucht tank door het plaatsen van een 5/16" OD buizen op de duw-aan-lock-aansluiting. Gebruik ¼" OD buizen de uitlaat van de vacuüm generator verbinden met het experimentele opstelling door het plaatsen van de buis over de uitlaat van de vacuüm generator.
  2. Gebruik van droge aërosol systeem voor het genereren van droge aërosol
    1. Open de lucht tank door te draaien aan de hoofdafsluiter en toestaan dat de luchtstroom naar het systeem. Open de klep op de regulator van de stroom op de lucht tank en zo ingesteld dat de stroom in het systeem overeenkomt met de gewenste instellingen op de vacuümpomp.
    2. Open de kogelklep dichtst bij HEPA-filter en open vervolgens de kogelklep dichtst bij vacuüm generator. Deze openhouden voor ongeveer 3 s dat deeltjes worden getrokken in de luchtstroom.
    3. Sluit de kogelklep dichtst bij vacuüm generator en sluit kogelkraan dichtst bij HEPA-filter. Lucht uit de tank te stromen voor de duur van het experiment desgewenst toestaan.
    4. Sluit hoofd- en regelgever kleppen op lucht tank om te stoppen met de stroom. Schone kogelkranen en vacuüm generator met 70% ethanol. Autoclaaf metalen buizen voor sterilisatie.

3. afzetting efficiëntie meting met behulp van PIVEC

Opmerking: Operators moeten uitvoeren aërosol posities in een zuurkast.

  1. Het meten van de depositie door het verzamelen van de koperen nanoparticle aërosol gegenereerd in stap 2.2 op een vooraf gewogen filter. Gebruik de gedeponeerde dosis, gemeten met behulp van de verzamelde massa op het filter, en de toegediende dosis, gemeten aan de hand van de hoeveelheid gewogen Koper deeltjes, om de efficiëntie van de depositie.
    1. Houd 1.00 µm porie glasvezel filters onder lage luchtvochtigheid voorwaarden beschreven in 1.1.2, gedurende ten minste 24 uur vóór de pre blootstelling metingen. Weeg een ongebruikte filter drie keer en registreren van de gewichten van de filter. Plaats het ongebruikte filter in een cultuur van de cel invoegen.
    2. Kies gewenste cel cultuur invoegen adapter (6 goed of 24 goed) voor PIVEC ter ondersteuning van de cel cultuur invoegen met het filter. Plaats de celcultuur invoegen adapter stuk op de bovenkant van de base PIVEC, instellen op zijn plaats, zodat de boekwaarde van de adapter stuk breder dan de bovenkant is.
    3. Gebruik pincet te plaatsen van de cultuur van de cel van de filter geladen invoegen binnen adapter stuk. Plaats het bovenste stuk bovenop adapter stuk, settling in plaats zodat de boekwaarde van het bovenste stuk breder dan de bovenkant is. Wikkel PIVEC met een enkellaags plakband.
    4. Sluit 37 mm cassette stukken op de boven- en onderkant van de PIVEC door te drukken op zijn plaats. Breng ¼" prikkeldraad adapters in cassette inlaat en uitlaat.
    5. Wikkel de resistieve kachel rond PIVEC zodanig dat de draden aan de basis zijn. Tape om veilig te stellen.
    6. Wikkel PIVEC met ~ 8 rondes van aluminiumfolie voor isolatie. Beveiligen met tape.
    7. Verbinding 2" lang stuk van 1/2" buitendiameter flexibele slang aan de adapter op de top van PIVEC. Verwijder poreuze slangen uit steriel water en plaats binnen de buis op de top van PIVEC.
    8. Plaats PIVEC in de klem op de ring staan en veilig. Volledige set-up met de vacuümpomp, deeltjes teller en aërosol set-up.
      Opmerking: Het aantal gebaseerde gedeponeerde dosis kan worden bepaald, mits de deeltjesgrootte tellers worden geplaatst voor de PIVEC en na de PIVEC op aparte loopt.
    9. Bloot filters met behulp van stap 2.2 van het protocol en gewenste blootstelling tijd en stroom prijzen, in deze studie een belichtingstijd van 10 min op 0.5 LPM werd gebruikt. Verwijder de PIVEC uit de set-up. Neem uit de cel cultuur invoegen en plaats het blootgestelde filter in de filterhouder onder lage luchtvochtigheid voorwaarden gedurende ten minste 24 uur vóór de metingen.
    10. Schone PIVEC met 70% ethanol. Steriliseren met ultraviolet licht gedurende ten minste 30 minuten vóór het volgende experiment.
    11. Weeg het blootgestelde filter drie keer en registreren van de gewichten van de filter. Schakel de blootgestelde filter in een gelabelde filterhouder voor opslag.

4. berekening van de gedeponeerde dosis en efficiëntie van de depositie

Opmerking: Kennis van de neerlegging is belangrijk voor aërosol administratie en interpretatie van cellulaire respons.

  1. Berekenen van de depositie van massa gebaseerde metingen
    1. Bereken de gestorte massa op filters als het verschil tussen het gemiddelde gewicht van de pre blootstelling en post-exposure gemiddeld gewicht. Deze waarde is de massa gebaseerde gedeponeerde dosis voor het experiment.
    2. Gebruik toegediend massa, madmin, en massa gebaseerde gestort dosis bepaald in 4.1.1, mdep, voor de berekening van de massa-gebaseerde afzetting efficiëntie, ηm, voor het experiment.
      Equation
    3. Gemiddelde waarden van de punten 4.1.1 en 4.1.2 voor ten minste 3 experimenten om afzetting en efficiëntie van de depositie voor PIVEC voor deeltjesgrootte.
  2. Berekenen van de depositie van nummer gebaseerde metingen
    1. Zorg ervoor dat de metingen met deeltjes teller hebben verricht met items na de PIVEC en om te bepalen van de concentratie van de deeltjes vóór de PIVEC. Integreren van de concentratie van het deeltje na verloop van tijd voor de deeltjes teller dan integreren over de diameter van het deeltje te bepalen van de totale deeltjes gemeten.
    2. Het gedeponeerde deeltje getal berekenen als het verschil tussen de deeltjes toegediend en de deeltjes gemeten post-PIVEC. Deze waarde is het aantal gebaseerde gedeponeerde dosis voor het experiment.
    3. Gebruik toegediend deeltjes, nadmin, nummer gebaseerde gestort dosis, ndep, volumetrisch debiet, V, en de tijd t, voor de berekening van het aantal gebaseerde afzetting efficiëntie, ηn, voor het experiment.
      Equation
    4. Gemiddelde waarden van 4.2.2 en 4.2.3 voor ten minste 3 experimenten om afzetting en efficiëntie van de depositie voor PIVEC voor deeltjesgrootte.

5. aerosol blootstelling van cellen

Opmerking: Voor de cel cultuur op het raakvlak van de lucht-vloeistof de lezer wordt verwezen naar lege et al. 38 exploitanten moeten cel cultuur invoegen laden (stappen 5.1.2-5.1.4) binnen een kabinet bioveiligheid uitvoeren. Operators moeten uitvoeren aërosol posities in een zuurkast.

  1. Cultuur cellen bij Air-Liquide Interface
    1. Til A549 cellen uit cultuur kolf door trypsine-EDTA, 3 mL voor een T75 kolf of 1 mL voor een T25 kolf toe te voegen en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Toevoegen 7 mL van volledige media voor een T75 kolf of 4 mL van volledige media voor een T25 kolf aan kolf en spoelen kolf muur met celsuspensie te maximaliseren van het aantal herstelde cellen. De celsuspensie overbrengen in een steriele 15 mL conische buis dan centrifuge cellen bij 800 x g gedurende 3 minuten.
    2. Verwijder het supernatant bevat trypsine-EDTA en resuspendeer de pellet cel in 10 mL van de volledige media. 10 µL celsuspensie verwijderen en toevoegen aan de hemocytometer. Cellen met behulp van een hemocytometer om te bepalen van de concentratie en het totale aantal cellen te tellen.
    3. Breng 0,5 mL van volledige media aan elk putje binnen een 24 goed plaat. Schakel ongebruikte cel cultuur inzetstukken in putten. Cultuur van de cel van het zaad wordt ingevoegd op de apicale zijde op een celdichtheid in de buurt van 1 x 105 cellen/cm2 voor celtypes die groeien in een tempo in de buurt van verdubbeling per dag. Op zaad dat wordt A549 cellen binnen een 24 goed invoegen, zaad cellen bij een dichtheid van 1 x 105 cellen/cm2 door 35.000 cellen toe te voegen aan de cultuur van de cel invoegen.
      Opmerking: Cellen met een langzamere groei kunnen worden uitgezaaid op een verhoogde celdichtheid.
    4. Volledige media toevoegen aan de apicale zijde van cel cultuur invoegen te bereiken van het uiteindelijke volume (voor 24 goed plaat eindvolume 0,25 mL is).
    5. Cultuur voor 7 dagen in de verzonken voorwaarden, ter vervanging van media elke 1-2 dagen. Na 7 dagen, de apicale media en cultuur voor minimaal 1 dag in ALI voorwaarden, vervangen van alleen de basolaterale media te verwijderen.
  2. Monteren van PIVEC
    1. Cellen naar equilibreer aan de interface van de lucht-vloeistof gedurende ten minste 24 uur voorafgaand aan blootstelling toestaan.
    2. Kies gewenste cel cultuur invoegen adapter voor PIVEC ter ondersteuning van de cel cultuur invoegen met het filter. De cultuur van de cel van de plaats invoegen adapter stuk op de top van PIVEC basis, instellen op zijn plaats, zodat de boekwaarde van de adapter stuk breder dan de bovenkant is. Voeg 4 mL cel voedingsbodems naar de waterput van de basis van de PIVEC.
    3. Gebruik pincet te plaatsen van de cultuur van de cel invoegen binnen adapter stuk geplaatst in stap 5.2.3. Plaats top stuk bovenop adapter stuk, settling in plaats zodat de boekwaarde van het bovenste stuk breder dan de bovenkant is. Zorgvuldig, wikkel PIVEC met een enkellaags plakband.
    4. Sluit 37 mm cassette stukken op de boven- en onderkant van de PIVEC, door te drukken op zijn plaats. Breng ¼" prikkeldraad adapters in cassette inlaat en uitlaat.
    5. Wikkel resistieve kachel rond PIVEC zodanig dat de draden aan de basis zijn. Tape om veilig te stellen.
    6. Wikkel PIVEC met ~ 8 rondes van aluminiumfolie voor isolatie. Beveiligen met tape.
    7. Korte stuk van 1/2" buitendiameter flexibele buizen verbinden met de adapter op de bovenkant van PIVEC. Verwijder poreuze slangen uit steriel water en plaats binnen de buis op de top van PIVEC.
    8. Plaats PIVEC in de klem op de ring staan en veilig. Vul de installatie met de vacuümpomp en de aërosol set-up.
  3. Bloot cellen bij ALI met behulp van de PIVEC
    1. Afzetting efficiëntie bepaald in stap 2 gebruiken voor het berekenen van de massa van de deeltjes worden aërosol. Weeg passende massa en toevoegen aan het systeem van de spuitbus instellen na stap 2 in de zuurkast.
    2. Bloot cellen door volgende stap 2.2, in deze studie van biologische eindpunten de cellen werden blootgesteld aan ongeveer 3,5 mg koper nanodeeltjes met een debiet van 0.5 LPM en een blootstellingsduur van 10 min. Control studies uitgevoerd bevochtigde lucht gebruikt om te bepalen de invloed van de lucht alleen. Verwijder de PIVEC uit de set-up. Neem de cel cultuur invoegen, in de steriele goed plaat plaatsen en terug te keren naar de CO2 incubator (37 ° C, 5% CO2, 90% RH).
    3. Media uit PIVEC gecombineerd. Het uitvoeren van aanvullende experimenten, gebufferde rinse onderin PIVEC met fosfaat oplossing dan Herhaal stap 5.1 en 5.2.
    4. Schone PIVEC met 70% ethanol wanneer u klaar bent. Steriliseren met ultraviolet licht gedurende ten minste 30 minuten vóór het volgende experiment.
  4. Biologische bepaling Procedures
    Opmerking: Tests uitgevoerd in deze studie waren oxidatieve stress generatie via de DCFH-DA-assay en cytotoxiciteit via lactaat dehydrogenase (LDH) vrijmaking.
    1. Los DCFH-DA 24.4 mg in 50 mL methanol om 1 mM DCFH-DA oplossing te maken. Deze oplossing kan worden achtergelaten bij-20 ° C voor maximaal 4 maanden. Verdunnen 1 mM DCFH-DA-oplossing door het mengen van 0,1 mL van 1 mM DCFH-DA oplossing met 9.9 mL HBSS te maken 10 mL van 10 µM DCFH-DA.
    2. Verwijderen cel cultuurmedia en wassen cel cultuur invoegen met ongeveer 1 mL PBS. Voeg 0,5 mL 10 µM DCFH-DA oplossing aan elk putje, ter vervanging van inzetstukken wanneer u klaar bent. Afdekplaat met aluminiumfolie ter voorkoming van photoactivation van de kleurstof en 37° C incubator voor 1 h op terugkomen.
    3. Cellen verwijderen uit de incubator en de DCFH-DA-werkoplossing de putjes gecombineerd. Voeg 0,5 mL HBSS putjes en vervang cel cultuur inzetstukken.
    4. Laden van de goed plaat in plaat reader en maatregel basislijn fluorescentie met behulp van excitatie/emissie golflengten van 485/530 nm. Plaat uit plaat reader en belasting invoegen verwijderen in PIVEC voor blootstelling.
    5. Bloot cellen voor gewenste blootstellingsduur. Invoegen uit de PIVEC verwijderen en terugkeren naar goed plaat. 50 µL van basolaterale vloeistof uit goed plaat en plaats in de witte 96 goed plaat te verwijderen. Meten van de fluorescentie van DCF met behulp van excitatie/emissie golflengten van 485/530 nm elke 30 min na blootstelling gedurende 2 uur.
    6. Laat basolaterale vloeistof equilibreer tot kamertemperatuur voor 20-30 min. toevoegen 50 µL van LDH test oplossing, gemengde volgende protocol van de fabrikant, basolaterale vloeistof uit goed plaat en laat reageren voor 10 min. toevoegen 25 µL van eindeoplossing goed. Lezen van de fluorescentie van resorufin product met behulp van excitatie/emissie golflengten van 560/590 nm.
    7. Verwijder extra basolaterale vloeistof en herhaal stap 5.4.6 na 4 uur en 24 uur na blootstelling.

6 statistische methoden

  1. Analyse van biologische bepaling gegevens
    1. Verslag ROS productie als de verhoging van de intensiteit van de fluorescentie van de behandelde cellen ten opzichte van basislijnmetingen. Verslag LDH activiteit als de verhoging van fluorescentie intensiteit van de behandelde cellen ten opzichte van de onbehandelde cellen.
    2. Het uitvoeren van enkele factor ANOVA om statistische verschillen tussen gegevenssets te bepalen. In voorkomend geval, student t-tests op een waarde van betekenis van 0,05 uitvoert. Rapportgegevens als de gemiddelde ± standaardafwijking van ten minste drie metingen van de blootstelling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beroepsmatige in vitro toxicologie gaat om behoud van cellulaire levensvatbaarheid tijdens het uitvoeren van de blootstelling van de spuitbus. Het PIVEC systeem is afgebeeld in Figuur 2, met inbegrip van de temperatuur en vochtigheid controle en de versleten PIVEC. De temperatuur was onderhouden met behulp van een batterij-aangedreven resistieve kachel en het aërosol bevochtigde met verhoogd natuurlijke bevochtiging via een buis poreus, wordt bevochtigd. In een gecontroleerde aërosol instellen in een laboratorium, kunnen de PIVEC set-up voor blootstelling afgebeeld in Figuur 1. Karakterisering van het systeem zorgt voor de bepaling van de gedeponeerde dosis op de cellen die dan kunnen worden gecorreleerd aan de cellulaire respons.

De efficiëntie van de depositie is afhankelijk van de grootte van de deeltjes aan het systeem toegevoegd aangezien afzetting krachten impactie, sedimentatie, en verspreiding omvatten. Daarnaast is de afzetting afhankelijk van debiet, belichtingstijd en de kenmerken van het systeem van de blootstelling. Met deze informatie, kan de afzetting worden voorspeld. De efficiëntie van de afzetting van de PIVEC is vastgesteld door middel van twee methoden, Gravimetrische analyse en deeltje nummer tellen. Vergelijkingen 1 en 2 werden gebruikt om te bepalen van de efficiency van de depositie in tabel 1 met behulp van het filter gebaseerd, scannen mobiliteit deeltje sizer (SMPS) en optische deeltjesgrootte sizer (OPS) metingen, Figuur 3. Verhoogde afzetting wordt over het algemeen waargenomen voor de 24 goed ontwerp dan de 6 goed ontwerp en iets voor 100 afneemt nm in vergelijking met 40 nm en 800 nm Koper deeltjes. De afzetting in de 24 putten is zeer uniform over het invoegen, afzetting in het 6 goed ontwerp ontbreekt echter uniformiteit als de meeste van de storting van de deeltjes in de buurt van het centrum van het donormateriaal. Post-exposure analyse kan worden versneld door de dosis relatie tussen de 37 mm filter en de cel cultuur invoegen, verminderen de noodzaak om de dosis na cellulaire blootstelling vast te stellen. Vergelijking van de depositie binnen de 37 mm filter cassette en de PIVEC toont een sterke correlatie voor alle maten en putten met een Pearson correlatie van boven 0.7, echter alleen voor 800 nm is de correlatie aanzienlijke met een p < 0,05, Zie Figuur 4. 11,12 de efficiëntie van de afzetting van de PIVEC over het bereik van deeltjesgrootte getest is in vergelijking met soortgelijke systemen in de gehele literatuur, vergelijkbare of hogere over gerapporteerde waarden, waargenomen in Figuur 5. De efficiency van de depositie binnen de PIVEC kan worden verbeterd door het minimaliseren van verliezen aan het systeem ontwerpen van de PIVEC met elektrostatische dissipatief of geleidend kunststof of vergelijkbaar materiaal.

Filters zijn niet goed gedroogd in een vochtigheid-gecontroleerde omgeving vóór de blootstelling, overtollig water verhoogt de aanvankelijke massa als niet-fysieke, negatieve gedeponeerde dosissen kan produceren. Variabel debiet kunnen ook bevorderen inconsistent gedeponeerde doses binnen het systeem. Deze om problemen te vermijden, kunt u ten minste één dag vóór en na de blootstelling voor filters te drogen in een vochtigheid-gecontroleerde omgeving.

Cellulaire reacties zal worden beïnvloed door de gedeponeerde dosis en kunnen worden beïnvloed door de blootstellingsduur als de cellen worden niet goed onderhouden. A549 cellen, een cellijn alveolaire epitheliale carcinoom, werden blootgesteld voor 10 min naar verschillende groottes van koperen nanodeeltjes op een debiet van 0.5 LPM. Alternatieve loodrecht flow blootstelling systemen gebruik 0,005 LPM à 1,5 LPM voor een periode van aanhoudende blootstelling terwijl deze methode gebruikt een matige debiet tijdens een snelle blootstelling. Met behulp van de efficiëntie van de massa-gebaseerde afzetting gemeten en toegediende dosis, 1.58 ± 0,04 mg/cm2 van 40 nm koper, 0,30 ± 0,00 mg/cm2 van 100 nm Koper deeltjes, en 0.32 ± 0,01 mg/cm2 van 800 nm Koper deeltjes werden gestort op de cellen. Cytotoxiciteit en oxidatieve stress werden waargenomen gedurende de eerste vierentwintig uur na blootstelling. Cytotoxiciteit werd gemeten met behulp van het vrijkomen van lactaat dehydrogenase (LDH) uit beschadigde cellen onmiddellijk, 4 uur en 24 uur na blootstelling. Er werd geen significante toxiciteit van koperen nanodeeltjes hieronder 1.62 mg/cm2 binnen 4 uur na de blootstelling, Figuur 6b. Vierentwintig uur na blootstelling er was een statistisch significante afname van de levensvatbaarheid van de cellen van minder dan 20% levensvatbaarheid van cellen die zijn blootgesteld aan koper nanodeeltjes. De intracellulaire oxidatieve stress werd onderzocht met behulp van de DCFH-DA bepaling door de oxidatie van DCFH door reactieve zuurstof soorten binnen de eerste twee uur na blootstelling, Figuur 6a. Aanzienlijke mate van oxidatieve stress werden gemeten op dertig minuten post-exposure voor cellen blootgesteld aan koper nanodeeltjes van alle soorten en maten. De mate van oxidatieve stress blijven stijgen tegen vergelijkbare prijzen voor alle maten getest binnen de twee uur waargenomen.

Succes van de vorderingen kan worden bepaald door de herhaalbaarheid van de cellulaire reactie. Twee aanvaardingscriteria voorgesteld voor cytotoxiciteit tests omvatten: 1) de % totale LDH lekkage voor de positieve controle groter zijn dan 50%, en 2) de positieve en monster repliceren coëfficiënt van variaties moet moet binnen 50%. 39 als deze criteria niet voldaan, deze voorstellen verschillen tussen experimenten, zoals gewijzigde afzetting bedragen of slechte vochtigheid of temperatuur controle. Daarnaast kan observeren van metingen van de cytotoxiciteit leiden tot begrip van de experimentele besturingselementen en hulp bij het bepalen van de fout. Wanneer het debiet te hoog is, kunnen hoge bedragen van shear stress cellen sterven. Door het verlagen van het debiet, kan de stress op de cellen uit de stroom worden verlaagd.

Figure 1
Figuur 1. Schematische van droge versnippering systeem en experimentele opstelling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. PIVEC ontwerp. A) volledig ontwerp afgebeeld met 30 cm hoge doos voor vergelijking. B) PIVEC met temperatuur en vochtigheid controle afgebeeld met 30 cm hoge vak voor vergelijking. C) versleten PIVEC. D) PIVEC Top stuk. E) cel Adapter van de cultuur voor 24 goed (links) en 6 goed (rechts). F) onderste stuk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aantal gebaseerd afzetting rendement (%) Massa op basis van depositie rendement (%)
6 goed 40 nm 17.83 ± 32.13 5.85 ± 0,85
100 nm 0.47 ± 4.06 5.11 ± 0.94
800 nm 3.70 ± 35,00 6,39 ± 1.01
24 goed 40 nm 1.43 ± 2.43 12.61 ± 1.34
100 nm 1.37 ± 19.45 2.95 ± 0,75
800 nm 6,98 ± 3.93 15,95 ± 0,53

Tabel 1. PIVEC afzetting efficiëntie.

Figure 3
Figuur 3. Deeltje nummer concentratie van koperen nanoparticle aërosolen. A) SMPS meting. B) OPS meting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Relatie tussen depositie op cel invoegen en SKC 37 mm filter. Fout ± 0,002 mg. A) 40 nm Koper deeltjes. B) 100 nm Koper deeltjes. C) 800 nm Koper deeltjes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5. De efficiëntie van de afzetting van PIVEC ten opzichte van loodrecht Flow blootstelling systemen in de literatuur. Literatuur waarden uit loodrecht Flow blootstelling systemen zijn uitgezet in solide Markers en PIVEC waarden zijn in lege Markers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6. Cellulaire reactie op koper nanodeeltjes post-exposure (PE). Voor alle metingen, n = 3 en p < 0.05. A) oxidatieve Stress bepaald met behulp van de DCFH-DA-Assay. B) bepaald met behulp van de LDH-bepaling van de cytotoxiciteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Filter cassettes bieden een eenvoudige, goedkope methode voor het verzamelen van aërosolen in de individuele ademzone; echter aërosol monsters geëxtraheerd uit filters niet vertegenwoordigen het gehele aërosol (dat wil zeggen gassen, vluchtige stoffen en deeltjes) en dus het beperken van de beoordeling van aanverwante biologische effecten. Met het oorspronkelijke ontwerp van de 37 mm filter cassette, is de PIVEC ontworpen om onderhouden draagbaarheid en bootsen de in vivo afzetting van deeltjes uit inademing. De PIVEC is aanzienlijk kleiner dan de huidige ALI blootstelling systemen, ongeveer de grootte van een tissue doos met temperatuur en vochtigheid besturingselement is opgenomen. De grootte is vergelijkbaar met persoonlijke trapsgewijs botslichamen terwijl het aanbieden van gegevens over de cellulaire reactie op het aërosol bovendien. Terwijl de PIVEC ruimte voor één monster in vergelijking met andere huidige systemen van de blootstelling bevat, de kleine afmetingen mogelijk meerdere systemen worden gebruikt in een keer, daarom verhoging van de grootte van de steekproef en rekening houdend met de ruimtelijke verdeling te worden gevolgd.

Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. Om te bepalen van de depositie-efficiëntie, is het essentieel om de conditie goed de filters, zoals beschreven in stap 1. Bovendien is het belangrijk om goed wegen de koperen nanodeeltjes voorafgaand aan blootstelling en de filter post blootstelling aan het bepalen van de massa-gebaseerde afzetting efficiëntie. De nummer afzetting efficiëntie moet worden bepaald met behulp van het verschil in depositie tussen de initiële aerosol concentratie en de eindconcentratie bepaald met behulp van de deeltjes teller. Als de efficiëntie van de depositie niet goed wordt bepaald, is het moeilijk om de biologische reactie verschillen tussen aërosoltypes te bepalen. Wijzigingen aan de afzetting omvatten veranderen de afzetting. Afzetting kan worden verhoogd door het wijzigen van de flow-rate en blootstelling duur. Dit kan ook invloed hebben op de levensvatbaarheid van de cellen met het potentieel van de cellen uitdrogen. Dé oliemachine van aërosolen wordt vaak uitgevoerd ter compensatie van fysiologische kenmerken zoals lichaamstemperatuur en bevochtiging in de luchtwegen. Verhoogde vochtigheid, meer dan 50%, de Nabootsers van de ingeademde lucht en verlaagt celdood als gevolg van blootstelling van het voertuig. 43 als temperatuur en vochtigheid zijn niet goed gecontroleerd, kan er het cellulaire antwoord worden beïnvloed. Door het verlagen van het debiet, zal extra deeltjes van alle soorten en maten storten, verhoging van de depositie. Blootstellingsduur is evenredig aan depositie, waardoor meer deeltjes te storten over een langere experimentele periode. Conditionering van het aërosol is belangrijk wanneer de blootstellingsduur te verhogen zodat de cellen niet uitdrogen waardoor biologische reacties.

De PIVEC maakt gebruik van loodrecht stroom te deponeren deeltjes via impactie, sedimentatie, en de verspreiding naar de cellen die het potentieel hebben om uitdrogen van de cellen tot en met de stroom en spanning op de cellen worden toegevoegd. De afzetting efficiëntie is afhankelijk van de grootte van het deeltje door de krachten van de depositie. Veel van de huidige systemen van de blootstelling met loodrecht stroom hebben een rendement van de depositie van minder dan 10% en veel dichter tot 1%. De PIVEC heeft een efficiëntie van de depositie bepaald door Gravimetrische analyse van 3 tot 16 procent voor een 24 goed cel cultuur invoegen. De deeltjes depositie nummer gebaseerde efficiëntie is ongeveer 1% tot 7% voor de dezelfde invoegen. Bij het gebruik van een 6 goed cultuur van de cel wordt ingevoegd, deze aantallen dalen, met uitzondering van de kleinste grootte van de deeltjes, als gevolg van de stroomlijning van het aërosol, zoals meer deeltjes zijn beperkt in de cel cultuur invoegen zonder ruimte voor de stroom te ontwikkelen. De 6 goed cel cultuur inserts toestaan de aërosol streams te omzeilen afzetting. Andere loodrecht stroom systemen gekenmerkt op een grootschalige basis met 60 nm fluoresceïne deeltjes40, 80 nm en 180 nm Koper deeltjes16en 60 nm adipine-zure deeltjes41. De resulterende afzetting efficiencyeffecten zijn over het algemeen tussen de 0.05% en 11%. Op basis van getal, hebben deze systemen zijn gekenmerkt met polystyreen deeltjes12,15, koolstof nanodeeltjes12en silica deeltjes42, efficiëntie tussen 0,2% en 11% oplevert. De PIVEC biedt, vergelijkbare of hogere, afzetting in vergelijking met de beschikbare cellulaire blootstelling apparaten.

Cel posities werden uitgevoerd met behulp van koperen nanodeeltjes van 40 nm, 100 nm, en 800 nm. Levensvatbaarheid van de cellen was gedefinieerd met behulp van de LDH-assay met geen significante afname van de levensvatbaarheid binnen vier uur na blootstelling. De LDH-assay werd gebruikt met een commerciële blootstelling systeem voor 74 ng/cm2 na 2 uur en 148 ng/cm2 na 4 uur van 9.2 nm koper oxide deeltjes44 en 1 µg/cm2 na een opeenvolgende blootstelling 4 uur incubatie gedurende 2 gestort uur, dan een andere blootstelling gedurende 4 uur 25 nm koper oxide deeltjes40beide meten significante dalingen in de levensvatbaarheid van de cellen. Cytotoxiciteit werd waargenomen in een ander systeem voor 1.6-7,6 µg/cm2 van 180 nm deeltjes koperen nanodeeltjes16 gemeten door trypan blauwe kleurstof uitsluiting. Blootstelling aan 15 minuten voor 40-80 nm koper oxide nanodeeltjes daalde van levensvatbaarheid, 24 uur bericht blootstelling gemeten. De lagere toxiciteit waargenomen met behulp van de PIVEC was waarschijnlijk te wijten aan de kortere belichtingstijd van 10 minuten en korter post meting belichtingstijden. Na vier uur na blootstelling daalde de levensvatbaarheid van de cellen die in de PIVEC worden blootgesteld. Cellen blootgesteld aan vochtige lucht besturingselementen geen significante cytotoxiciteit, in overleg met andere studies 9,40,44,45,46waargenomen. De oxidatieve stress werd bepaald met behulp van de DCFH-DA-bepaling. De productie van reactieve zuurstof soorten, zoals waterstofperoxide of zuurstof radicalen, gegenereerd een hoeveelheid stress die tot groei arrestatie of cel dood leiden kan. Na de posities van de cel was er een minimale stijging in oxidatieve stress voor cellen bewaard in de incubator als besturingselement en cellen blootgesteld aan vochtige lucht. Verhoogde oxidatieve stress plaatsgevonden voor alle deeltjesgrootte, toenemende binnen 30 minuten na blootstelling. In één studie, 9.2 nm koperoxide deeltjes44 en 25 nm koperoxide deeltjes geïnduceerde40 ook oxidatieve stress gemeten via de carboxy-DCFH-DA-bepaling. Verhoogde blootstellingstijd van 2 uur tot 4 uur verhoogde oxidatieve stress voor 9.2 nm koperoxide deeltjes44. Na vier uur van de blootstelling, de 9.2 nm koper oxide deeltjes geproduceerd een soortgelijke oxidatieve reactie als de opeenvolgende blootstelling van 25 nm koper oxide deeltjes40, wat suggereert dat de blootstelling duur heeft een hogere invloed op oxidatieve stress-respons dan de grootte van de deeltjes. Cellen binnen de PIVEC blootgesteld geproduceerd verhoogde oxidatieve stress ten opzichte van die studie, echter, de deeltjes blootgesteld in het alternatieve systeem koperoxide zijn en minder snel dan de koper binnen de PIVEC blootgesteld zal oplossen. Studies uitgevoerd op de ontbinding van de koper op basis van de samenstelling en grootte van de deeltjes stemt ermee in dat de grotere deeltjes en de metaaloxiden vrijgeven ionen langzamer dan metaaldeeltjes of hun nanoparticle tegenhangers16,47 , 48 , 49 zoals de vochtige lucht besturingselementen niet grote hoeveelheden oxidatieve stress in vergelijking met de controle van de incubator produceren, de invloed van koper deeltjes voor het opwekken van oxidatieve stress is overeenstemming binnen de PIVEC vergelijkbaar in vitro blootstelling systemen. De biologische respons waargenomen met behulp van de PIVEC blijkt dat de PIVEC een passend systeem voor cellulaire blootstelling.

Hoewel de karakterisering en cellulaire studies van de PIVEC eens goed met literatuur, heeft9,16,40,44,46 het apparaat beperkingen. Het kleine ontwerp vermindert het aantal monsters dat gelijktijdig kan worden blootgesteld in één enkel apparaat in vergelijking met andere systemen van de blootstelling. Andere systemen zijn voorzien van ten minste drie cellulaire blootstelling aan de dezelfde aërosol9,12 te repliceren metingen te vergemakkelijken. Hoewel de PIVEC voorziet slechts in één invoegen per systeem, zorgt de geringe omvang voor meerdere systemen te gemakkelijk worden gebruikt, bij het verzachten van dit probleem. Terwijl andere persoonlijke bewakingssystemen gebruik geen cellen, moet de PIVEC worden gehouden in de buurt van verticale om morsen van de cel voedingsbodems nodig zijn voor het behoud van cellulaire levensvatbaarheid. Hoewel de PIVEC heeft nog niet geoptimaliseerd voor specifieke deeltje bereiken (bijvoorbeeld PM10PM2.5, PM0.1), was de PIVEC voor een bereik van deeltjesgrootte gekenmerkt. Gelijkaardig aan andere systemen loodrecht stroom, het PIVEC toont een verminderde capaciteit om te storten van deeltjes in de buurt van 100 nm in diameter, terwijl 40 nm en 800 nm deeltjes gestort met een vergelijkbare efficiëntie.

De analyse van cellen post-exposure kan worden versneld door het uitvoeren van een parallelle collectie van aërosolen binnen de PIVEC en een SKC 37 mm filter cassette. Een hoge correlatie van gravimetrische gebaseerde afzetting staat voor de schatting van de massa van de deeltjes verzameld op de cellen van gegevens die zijn verzameld met behulp van 37 mm filters. Vergelijking van het donormateriaal op de cassette filter vermindert de noodzaak om aanvullende monsters en aanvullende metingen om de dosis te verzamelen. Work in progress omvat de integratie van een real-time monitoring systeem voor cytotoxiciteit, oxidatieve stress of andere biologische eindpunten. De geringe omvang van de PIVEC kan worden gebruikt in een verscheidenheid van instellingen, zoals op het lichaam als een persoonlijke monitor op een drone boven een chemische fabriek, of buiten in het milieu voor ruimtelijke resolutie. Deze methode is het gebruik van de PIVEC voor de verzameling van aërosol deeltjes op celculturen geteeld op de ALI gebleken. Door de conditionering van het aërosol 37 ± 1 ° C en een relatieve luchtvochtigheid van > 80%, kan cellulaire levensvatbaarheid worden gehandhaafd tijdens acute blootstelling. Deze methode is geschikt voor zowel druppel vloeibare en vaste deeltjes gebaseerde aërosolen en is aangetoond dat het storten van deeltjes tussen 40 nm en 800 nm in cel cultuur inzetstukken. De veelzijdigheid van de PIVEC maakt deze methode moet worden gebruikt in meerdere montages met een verscheidenheid van biologische eindpunten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De aansluiting van de auteurs is zoals aangegeven op het voorblad. De auteurs zijn financieel ondersteund door Virginia Commonwealth University, waar het werk werd voltooid in Richmond, VA. De auteurs zijn verantwoordelijk voor het schrijven en de inhoud van dit document. De auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen.

Acknowledgments

De auteurs bedank Boris Solomonov en de Virginia Commonwealth innovatie Machine Shop voor hulp bij snelle prototyping het apparaat. De auteurs ook bedank Cristian Romero-Fuentes van de Lewinski groep, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov en de Virginia Commonwealth nanomaterialen Core karakterisering faciliteit voor hun hulp met de karakterisering van het deeltje. Dit werk werd gesteund door opstarten middelen verstrekt aan de Dr. Lewinski door de College of Engineering op de Virginia Commonwealth University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3 (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013 (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51 (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. , Elsevier. (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26 (2), 84-93 (2013).
  17. Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. , CRC Press. Boca Raton. (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10 (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. , 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97 (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20 (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 20 (2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. , 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8 (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9 (1), 33 (2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103 (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. , 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36 (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19 (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 16 (2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41 (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47 (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19 (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27 (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26 (0), 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29 (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9 (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5 (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5 (3), 389-399 (2009).

Tags

Milieuwetenschappen kwestie 144 blootstelling systeem inhalatie Nanoparticle toxicologie afzetting efficiëntie persoonlijke controle
Een nieuwe draagbare <em>In Vitro</em> blootstelling Cassette voor aërosol bemonstering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Secondo, L. E., Wygal, N. J.,… More

Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter