Solid-stöds, protein-fri, dubbel fosfolipid lipidens membran (DLBM) kan omvandlas till komplexa och dynamiska lipid nanotube nätverk och kan fungera som 2D underifrån modeller av endoplasmatiska retiklet.
Vi presenterar en bekväm metod för att bilda en botten-upp strukturella organell modell för det endoplasmatiska retiklet (ER). Modellen består av mycket tät lipidic nanorör som, vad gäller morfologi och dynamik, som påminner om ER. Nätverken härleds från fosfolipid dubbel lipidens membran patchar följa ett transparent Al2O3 substrat. Vidhäftningen medieras av Ca2 + i omgivande bufferten. Efterföljande utarmning av Ca2 + med hjälp av BAPTA/EDTA medför indragning av membranet, vilket resulterar i spontana lipid nanotube nätverk bildas. Metoden endast består av fosfolipider och biochips ytor för enkel bildandet av en ER-modell och kräver inte tillsats av proteiner eller kemisk energi (t.ex. GTP eller ATP). I motsats till 3D morfologi av cellulära endoplasmatiska retiklet är modellen tvådimensionella (om än nanotube dimensionerna, geometri, struktur och dynamics bibehålls). Denna unika in vitro- ER modell består av endast ett fåtal komponenter, är lätt att konstruera och kan observeras under ett ljusmikroskop. Den resulterande strukturen kan dekoreras vidare för ytterligare funktioner, till exempel tillägg av ER-associerade proteiner eller partiklar att studera Transportfenomen bland rören. De artificiella nätverk som beskrivs här är lämpliga strukturella modeller för cellulära ER, vars unika karakteristisk morfologi har visat sig vara relaterade till biologiska funktion, medan detaljer angående bildandet av tubulär domänen och omflyttningar inom är fortfarande inte helt förstått. Vi noterar att denna metod använder Al2O3 tunna-filmdragerade mikroskopi coverslips, som är kommersiellt tillgängliga men som kräver särskild order. Därför är det tillrådligt att ha tillgång till en mikrofabrikation anläggning för beredning.
Akuten utför avgörande uppgifter i cellen biologisk inklusive proteinveckning, lipid syntes och kalcium förordning1,2. ER morfologi är inneboende till de funktioner som den utför. Den kombinerar planar stackar och tät-dynamiska tubulär domäner, som kontinuerligt samverkar med cytoskelettet och genomgå ständig rörelse och ombildning. Några av ombyggnaden att ER strukturer genomgå inkluderar den kontinuerlig omvandlingen mellan plana ark och rör, vesikler bildning från eller fusion till ER lumen, förlängning av redan existerande rören, tube dementi, fusion och brott3. Egendomlig struktur av tubulär nätverken är energetically unfavorable. De vägar och mekanismer som ER genererar och upprätthåller denna organisation samt hur detta hänger samman med dess funktion inte är ännu förstått det4,5.
Det är känt att ER krånglar när det förlorar sitt homeostatiska tillstånd, vilket resulterar i ER stress, ett tillstånd som orsakas av en ökning av proteinsyntesen, ansamling av felveckning proteiner, eller förändringar i Ca2 + och oxidativ balans. ER orsakar stress i sin tur deformation av naturliga morfologi av organell, speciellt genom att störa nätverk organisation6,7. Som svar aktiverar cellen en reparation mekanism att återgå till en homeostatiska tillstånd. Reparation kan leda till att ER-inducerad cell apoptos, vilket bidrar till flera metabola och degenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom, typ 2-diabetes, Parkinsons sjukdom, amyotrofisk lateral skleros och flera andra7, 8. Aktuell forskning mål organisationen av tubulär ER nätverken, och flera studier fokuserar på beredning av det ER in vitro-2. Några befintliga modeller2,9,10 behöver proteiner för att initiera och upprätthålla membran krökning3,11 och hjälpa organell nå sin form. Klart, modellsystem som speglar några av de viktigaste strukturella och organisatoriska funktionerna av ER och ge tillgång till avancerade experimentella studier är mycket efterfrågade.
Vi presenterar här förfaranden för utarbetandet av en lättköpt, protein eller kemisk energi-fri, dynamiska in vitro- modell för ER, som ger en grundläggande plattform för att studera ER morfologi och tillhörande funktioner4. Den här metoden är en ER-modell tillverkad med en bottom-up strategi använder endast några delar, där molekylerna av intresse kan integreras för att lägga till komplexiteten. I nätverket representerar ER struktur och dynamik. Dessutom reversibla omvandlingen mellan planar membranet och rören, vesikler bildning från rör, tube fusion, glidande och indragning kan alla observeras. Förutom som tjänar som en bottom-up-modell för ofullständigt förstådda cellulära ER, kan lipid rutten till nanotube nätverk beskrivs i detta protokoll vara tillämpliga för forskare som studerar självmontering, nanofluidik, single-molekyl och kolloid Transportfenomen, Marangoni flöde och andra relaterade områden. De bara molekylära byggstenarna som används i vår metod är fosfolipider. Protokollet kräver lite laborativt arbete och grundläggande utrustning och är tillgänglig för inkorporeringen av ytterligare element.
I den följande diskussionen beskrivs de kritiska steg, eventuella ändringar och begränsningar i protokollet. Ett första viktigt steg är korrekt montering av observation kammaren, eftersom vidhäftningen av PDMS ramen till Al2O3 ytan är egensäkra svag. I fall där ramen inte följer underlaget ordentligt, innehållet kommer att läcka från observation kammaren och experimentet kommer att avstanna. De viktigaste faktorerna som hindrar korrekt försegling av ytan och ram är 1) brist på noggrann rengöring av ramen PDMS (återanvändas) och 2) luftbubblor som ibland få anhållna mellan ram och substrat. En nyligen beredd eller grundligt rengjorda PDMS ram bör användas. Ramen bör sköljas före och efter varje användning med isopropanol, följt av sköljning med DI vatten och föning med kväve. Al2O3 ytor kräver inte någon föregående rengöring, eftersom de är tillverkade i renrum och förvaras i tillslutna behållare fram till användning. Amfotära pågrund av Al2O3, bör den inte utsättas för starkt sur eller basisk lösningar. Andra konstruktioner för observation kammaren kan användas, beroende på tillgänglighet av den enskilda inställningen. Viktiga funktioner i denna kammare är fri tillgång till flytande prov från den öppen toppen och hur inert ram material med avseende på begagnade lösningar och prover. Kammaren mått är också en viktig faktor, eftersom de bör rymma en volym från 0,5 till 1 mL. Eftersom de ytor som används är vanligtvis standardstorlek coverslips (24 x 60 mm), bestäms volymen av kammaren främst tjockleken av ramen. Till vår kunskap är distanser med storlek och djup som rymmer de provmängder som vanligtvis hanteras i detta protokoll inte kommersiellt tillgängliga. Vi har därför ägnat ett avsnitt i protokollet till Detaljer för tillverkning och montering av en prov kammare ram.
Det andra avgörande steget i detta protokoll är buffert utbyte. En utmaning i det här steget är timingen behövs för att utföra detta utbyte. Fördelningen av MLV vid kontakt med Al2O3 substratet är omedelbar, och en kontinuerlig utbyggnad av DLBM leder till dess spricker, avsluta experimentet (figur 2A, B). Därför fördelningen bör övervakas ständigt och buffert utbyte måste utföras i god tid. Utbyte bör inte utföras för snabbt efter initiering av spridning, för att möjliggöra membran patchar att nå en optimal storlek (100-200 µm i diameter). Däremot, orsakar kontinuerlig vidhäftning på ytan hög membran spänning, vilket leder till spricker. Således lappen alla membran så småningom brista om sprider inte avbryts. Tidpunkten för den spricker skiljer sig för varje plåster, eftersom det beror på storlek och inre strukturen av MLV och tillgängligheten av lipider däri. Tidpunkten för utbyte bör därför ordnas till en tidpunkt där un-brusten patchar med optimal storlekar representera en majoritet av hela befolkningen. En annan utmaning i buffert utbyte steg är den borttagning och tillägg av buffertar. Utför denna substitution för snabbt har en skadlig inverkan på de slutliga membranstrukturer (figur 2C-E). Överdriven utvinning av Ca2 +– HEPES bufferten utan att lämna en tunn vätskefilm på underlaget, resulterar i torkade och oåterkalleligt deformerade membran patchar (figur 2C). Även om en ordentlig mängd vätska bibehålls på ytan, orsakar abrupt tillägg av kelator-HEPES bufferten också störning av membranstrukturer. Figur 2 D,E visar det typiska utseendemässigt av hydrodynamiskt störd membran patchar. De övergripande morfologiska störningar påverkar inte nödvändigtvis de dynamiska egenskaperna hos de slutliga strukturerna (dvs, de rörformiga omflyttningar i återstående områden sker fortfarande). Det blir dock svårt att observera materiella omformningen på deformerade strukturer. Till exempel i figur 2D, skulle det vara svårt att bestämma riktningen mot som MLV DLBM dras in.
En möjlig ändring av protokollet är lipid sammansättning används. Tyngdpunkten har legat på fosfolipider som dominera ER sammansättningen hos däggdjur och jäst16 (e. g., fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), och fosfatidylinositol (PI). De ursprungliga experimenten utfördes med hjälp av PC och PI blandningar4. I de resultat som presenteras, användes en blandning av PC och knark och ett derivat av PE. Dock har inte alla godtyckliga lipid kompositioner hittats för att skapa de tubulära strukturer som erhållits genom detta protokoll. Några av andra försöksvis undersökta lipid blandningar innebär totala hjärtat extrakt, soy bean extrakt polar, E. coli extrakt polar, blandningar av PC med stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) i varierande proportioner och blandningar av PC-PE-PI-Posphatidyl serine (PS) i varierande proportioner. Eftersom tubulär membranstrukturer besitter hög krökningar och kräver särskilda arrangemang av enskilda lipid molekyler, förväntas det att det observerade fenomenet är lipid sammansättning-specifika.
En annan ändring tillämpas i detta protokoll är metoden för surface fabrication. Här användes ALD att fabricera den Al2O3 belagda coverslips. Detta skiljer sig från metoden ursprungligen rapporterade nedfall, reaktiv sputtring4. Medan detta indikerar att en alternativ yta fabrication metod fortfarande kan leda till ER-liknande tubulation, verkar en viktig begränsning vara specificiteten av ytmaterialet. Funktionsläget av spridning och styrka vidhäftning är starkt beroende av ytmaterialet, egenskaper som påverkar faktorer såsom elektrostatiska interaktioner, Vätbarheten, vattenavvisande egenskaper och ojämnheter på ytan. Al2O3 ytor ger optimal vidhäftning styrka och lipid filmer kan både koppla starkt nog att sprida som en dubbel lipid lipidens membran och lossa tubulär nätverk efter borttagning av Ca2 + joner. Vi testade tidigare samma experiment med SiO2, där de multilamellar blåsor sprida som en dubbel lipid lipidens membran, men ingen tubulär nätverk bildning observerades vid tillägg av kelater17. Avinstallation fastsättning och tube bildandet observeras endast på Al2O3 eller plasma etsade Al18. Våra undersökningar visade att parametern bidragande leder till sådant fenomen var zeta potential av ytor, för vilka Al och Al2O3 var nära noll (mV) och SiO2 avsevärd negativ. Zeta potential av borosilikatglas är liknande till SiO219; vidhäftning av lipid filmer på borosilikatglas är därför lika stark och oåterkalleliga. I själva verket leder multilamellar lipid reservoar kontakt med Borsilikat ytor vanligtvis till omedelbar bristning och bildandet av enda lipid lipidmonolager20. Al2O3 ytor krävs för detta protokoll är inte lätt eller kommersiellt tillgängliga. De kan dock vara anpassad beställas från specialitet glas och substrat tillverkare. Tillgång till renrum med tunnfilms-tillverkning utrustning rekommenderas.
De andra befintliga underifrån metoderna att tillverka ER-liknande tubulär nätverk2,10 involverar proteiner samt input av kemisk energi (t.ex., GTP och ATP). Rapoport och kollegor2 rapporterade bildandet av ER-nätverk på glas coverslips in vitro- genom att blanda de membran-bockning proteinerna som finns kvar i ER, med fosfolipider och GTP. Arbetet av Bachand o.a. 10 visar hur sådana dynamiska tubulär nät kan skapas med hjälp av molekylära motorer och ATP som energikälla. Detta protokoll presenteras kräver inte membranproteiner eller hydrolys av organiska föreningar för energi. Endast nödvändiga komponenter är fasta substrat och fosfolipider. Rening och utvinning av proteiner krävs inte. Detta protokoll ger, när det gäller enkelhet av konstituerande molekylerna, den mest grundläggande ER-modellen.
Med denna grundläggande, lipid-baserade ER modell etablerade, är bygga upp komplexiteten genom att lägga till ER-associerade komponenter av intresse, eftersom det gör det möjligt för utredning av enskilda effekter på systemet. Liknar de faktiska ER nätverk, rör i modellen är dynamiska. De konjugation till och migration av märkt membranproteiner eller fluorescerande partiklar i hela tubulär nätverket, kan ge information om membran rörelseriktning. Inkapsling och övervakning av fluorescerande vätskor inne i DLBM och rör under omformningen och ett möjligt kartläggning av intratubular innehåll transport kan tjäna som en annan inriktning. Slutligen kan en övergång från den 2D ER-modell som följd av detta protokoll mot en 3D slät modell antas genom inkapsling av näten i hydrogel arkitekturer.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Prof. Aldo Jesorka från Chalmers University of Technology i Sverige för hans ovärderliga synpunkter på manuskriptet. Detta arbete har gjorts möjlig genom ekonomiskt stöd från forskning rådet av Norge (norska) projektet bidraget 274433, UiO: biovetenskap konvergens miljö, Vetenskapsrådet (Vetenskapsrådet) projektet Grant 2015-04561, samt den startfinansiering som tillhandahålls av centrum för molekylärmedicin Norge & fakulteten för matematik och naturvetenskap vid universitetet i Oslo.
Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
Pressure meter – Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
Heating and drying oven – venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24×60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |