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Immunology and Infection

चूहों में मेजबान-रोगज़नक़ प्रतिक्रियाओं और वैक्सीन प्रभावकारिता का मूल्यांकन

Published: February 22, 2019 doi: 10.3791/58930
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

Summary

यहां हम वैक्सीन प्रभावशीलता और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के vivo मूल्यांकन में के लिए एक सुरुचिपूर्ण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल वैक्सीन मॉडल है कि अध्ययन वायरल, बैक्टीरियल, या परजीवी रोगजनकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Abstract

टीके एक 20वीं सदी चिकित्सा चमत्कार कर रहे हैं । वे नाटकीय रूप से रुग्णता और संक्रामक रोगों की वजह से मृत्यु दर को कम किया है और दुनिया भर में जीवन प्रत्याशा में एक हड़ताली वृद्धि करने के लिए योगदान दिया । फिर भी, टीका प्रभावकारिता का निर्धारण एक चुनौती बनी हुई है । उभरते सबूत पता चलता है कि वर्तमान अकोशिक वैक्सीन (apv) बोर्डेटेला पर्टुसिस (बी पर्टुसिस) के लिए सबऑप्टिमल प्रतिरक्षा लाती । इसलिए, एक बड़ी चुनौती एक अगली पीढ़ी के टीके को डिजाइन कर रही है जो पूरे सेल वैक्सीन (डब्ल्यूपीवी) के प्रतिकूल दुष्प्रभावों के बिना सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा लाती है । यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन है कि हम एक होनहार, उपंयास सहायक है कि एक सुरक्षात्मक Th1/Th17 phenotype के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं skews की प्रभावकारिता का परीक्षण करते थे और एक बी की एक बेहतर मंजूरी को बढ़ावा देता है । मूरीन श्वसन पथ से चुनौती । यह लेख माउस प्रतिरक्षण, बैक्टीरियल टीका, ऊतक संचयन, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । इस विधि का उपयोग करना, हमारे मॉडल के भीतर, हम सफलतापूर्वक एक आशाजनक, अगली पीढ़ी के अकोशिकीय पर्टुसिस टीका द्वारा हासिल महत्वपूर्ण तंत्र आविर्भाव है । यह विधि किसी भी संक्रामक रोग मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है ताकि टीका प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए ।

Introduction

टीके 20 वीं सदी के महानतम सार्वजनिक स्वास्थ्य उपलब्धियों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं, फिर भी हम पूरी तरह से जो सफल टीके सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा को उत्तेजित तंत्र समझ में नहीं आता । आणविक हस्ताक्षरों की पहचान (जैसे, कोशिका सक्रियण मार्करों, सेलुलर उपप्रकारों का विस्तार, और जीन अभिव्यक्ति के पैटर्न) टीकाकरण के बाद प्रेरित एक प्रभावोत्पादक की भविष्यवाणी और सृजन के लिए ढेर सारी जानकारी प्रदान करता है प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया । होस्ट-रोगज़नक़ प्रतिक्रियाओं की जटिलता को विट्रो सेल कल्चर सिस्टम्स1में उपयोग करके पर्याप्त रूप से दोहराया नहीं जा सकता है । vivo में वैक्सीन मॉडल concomitantly मेजबान के भीतर कई प्रतिरक्षा सेल प्रकार का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । यह एक लाभ प्रदान करता है जब विशेषता टीका antigen प्रसंस्करण और प्रस्तुति, अंतर साइटोकाइन स्राव, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विस्तार । यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रणालीगत और स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन और ब्याज के ऊतकों में रोगज़नक़ बोझ के परिमाणन के माध्यम से टीका प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है । यहाँ दिए गए उदाहरण में रोगजनक बोर्डेटेला पर्टुसिस (बी. पर्टुसिस) के लिए प्रयोगात्मक टीके की प्रभावकारिता का परीक्षण किया गया है ।

B. पर्टुसिस एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु है कि श्वसन रोग काली खांसी (पर्टुसिस)2,3के ईटियोलॉजिकल एजेंट है । संक्रमित व्यक्तियों के साथ घनिष्ठ संपर्क (रोगसूचक या स्पर्शोन्मुख) संचरण, उपनिवेशन, और रोग की ओर जाता है । महत्वपूर्ण वैश्विक वैक्सीन4कवरेज के बावजूद, पर्टुसिस दुनिया भर के कई देशों में एक रोग resurging माना जाता है और रोके बचपन की मौतों का एक प्रमुख कारण है5,6,7, 8. २०१५ में, बी पर्टुसिस और पर्टुसिस एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान में शामिल थे (niaid) उभरते संक्रामक रोगज़नक़/रोग सूची, एक बेहतर वैक्सीन के विकास की आवश्यकता पर बल देते है कि प्रदान लंबे समय तक सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा रहते थे ।

वर्तमान में, जांच का एक सक्रिय क्षेत्र पर्टुसिस पुनरुत्थान को नियंत्रित करने के लिए एक अगली पीढ़ी के एकोशिलर पेटुसिस वैक्सीन (apv) का विकास है, जो पूरे सेल द्वारा विकसित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की नकल करने के लिए उपन्यास समायोजित करता है और एंटीजन का इष्टतम संयोजन के साथ पर्टुसिस वैक्सीन (wpv)9. वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हमने हाल ही में बताया है कि एक मौजूदा एफडीए के संशोधन-अनुमोदित apv एक उपंयास सहायक के अलावा द्वारा, बोर्डेटेला उपनिवेशन कारक एक (bcfa), बी की अधिक कुशल कमी के परिणामस्वरूप . पर्टुसिस बैक्टीरियल लोड से माउस फेफड़ों10,11। इस वृद्धि की सुरक्षा के साथ एक alum-प्रेरित Th1/Th2 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और अधिक सुरक्षात्मक Th1/Th17 प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल के विघूर्णन के साथ किया गया था10। इस प्रोटोकॉल विस्तृत और व्यापक है, जांचकर्ता सक्षम करने के लिए मेजबान और रोगजनकों की एक किस्म के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के समवर्ती मूल्यांकन के माध्यम से अधिक से अधिक जानकारी प्राप्त करते हैं ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित प्रतिनिधि वैक्सीन अनुसूची, चित्रा 1में दिखाया गया है, इष्टतम मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को सुनिश्चित करने के लिए ।

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Protocol

iacuc दिशानिर्देश के अनुसार ओहियो राज्य विश्वविद्यालय iacuc द्वारा अनुमोदित एक प्रोटोकॉल के बाद जीवित पशुओं के साथ सभी प्रयोगों का आयोजन किया गया । C57BL/6 चूहों सभी टीकाकरण और संक्रमण में इस्तेमाल किया गया । nih दिशानिर्देशों के अनुसार प्रत्येक समूह में नर और मादा दोनों चूहों का उपयोग किया जाता है । प्रति समूह पशुओं की संख्या प्रायोगिक समूहों के बीच परिणाम में अनुमानित मतभेद के आधार पर बिजली की गणना द्वारा निर्धारित किया गया था । उदाहरण के लिए, समूह प्रति 8 चूहों α = ०.०५ (2 पक्षीय) में ८०% बिजली उपज 2 नमूना टीपरीक्षण के लिए १.३३ मानक विचलन (sds) के हित के परिणाम में मतभेद का पता लगाने के लिए होगा ।

1. चूहों का प्रतिरक्षण

  1. ऐसे खारा या डीपीएस के रूप में एक बाँझ शारीरिक बफर में एक मास्टर वैक्सीन मिश्रण तैयार करें ।
    नोट: मिश्रण में कुल मात्रा पूरे समूह के टीकाकरण के लिए आवश्यक है कि 10% से अधिक शामिल होना चाहिए । वैक्सीन संरचना की सांद्रता नीचे दिए गए चरणों में विस्तृत कर रहे हैं 1.1.1 और 1.1.2. बर्फ पर वीवेरियम के लिए आइटम परिवहन ।
    1. B. पर्टुसिस अध्ययनों के लिए, निम्नलिखित वैक्सीन समूह शामिल हैं: apv और apv + bcfa. इसके अलावा, उपयोग alum, वैक्सीन अकेले एंटीजन (fha, और prn), और भोली (गैर-प्रतिरक्षण) चूहों नियंत्रण समूह के रूप में ।
      नोट: apv है 1/5th एक एफडीए की मानव खुराक-अनुमोदित apv, जो टेटनस टोक्शहॉइड से बना है, कम डिप्थीरिया टोक्शहॉइड, पर्टुसिस टोक्शहॉइड (पीटी), तंतुमय hemagglutinin (एफए), और पर्टुसिस (prn) एल्यूमीनियम लवण के लिए adsorbed. वर्तमान पर्टुसिस एपीवी की एक मानव खुराक ०.५ मिलीलीटर है, इसलिए, एक खुराक की 1/5वीं ०.१ मिलीलीटर है । apv + bcfa के लिए वॉल्यूम apv की ०.१ मिलीलीटर (1/5वें मानव खुराक) हैं + ०.०४६ मिलीलीटर बीसीएफए (30 μg) प्रति माउस । अधिकतम मात्रा है कि सुरक्षित रूप से एक मांसपेशी को दिया जा सकता है ०.१ मिलीलीटर है । क्योंकि apv + bcfa वैक्सीन की मात्रा से अधिक है ०.१ मिलीलीटर, वैक्सीन दोनों कंधे में वितरित किया जाना चाहिए, मोटे तौर पर समान रूप से विभाजित, आदेश में सुरक्षित रूप से प्रशासित किया जा करने के लिए.
    2. एक प्रयोगात्मक वैक्सीन तैयार करने के लिए, एक खुराक के लिए 1 μg fha और ०.५ μg prn के ५० μg के साथ बाँझ पीबीएस में एल्यूमीनियम हाइड्रॉक्साइड जेल का मिश्रण । प्रयोगात्मक apv 15 मिनट के लिए एक प्रयोगशाला रोलर पर कमरे के तापमान (आरटी) पर मिश्रण करने के लिए अनुमति दें । बाद में, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १८,००० एक्स जी पर ट्यूब स्पिन । सतह पर तैरनेवाला निकालें और बाँझ pbs के 1 मिलीलीटर में सामग्री resuspend ।
  2. vivarium में, निश्चेतना मशीन (चित्रा 2) की स्थापना की ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि उपयोग करने से पहले उनके संबंधित टैंकों में ऑक्सीजन और आइसोफ्लूराने के पर्याप्त स्तर हैं । वज़न को आइसोफ्लूराने मेहतर कनस्तर और बदलें जब इसका वजन ५० ग्राम तक बढ़ जाता है ।
  3. जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) को अच्छी तरह साफ करें और बीएससी के अंदर क्लीन इंडक्शन चैंबर लगाएं । संज्ञाहरण और मेहतर लाइनों संज्ञाहरण मशीन से प्रेरण चैंबर के लिए कनेक्ट. ऑक्सीजन टैंक को खोलने के लिए नियामक के माध्यम से आक्सीजन सुनिश्चित करने के लिए बह रहा है और स्तर 1.5-2 एल/
  4. वांछित आयु (6-12 सप्ताह) के चूहों को प्रेरण कक्ष में रखें । 2.5-3% करने के लिए आइसोफ्लूराने चालू करें ताकि चूहों को हल्के से एनेस्थेटाइज़ कर सकें । जानवरों की निगरानी जब तक वे चैंबर में नहीं जा रहे हैं और उनकी सांस लेने में धीमा है.
  5. किसी भी स्वतुल्य आंदोलन के लिए देख, पैर की अंगुली चुटकी द्वारा प्रेरण के स्तर का परीक्षण. अगर कोई नहीं है, तो चूहे इंजेक्शन के लिए तैयार हैं ।
    नोट: इस प्रयोग में पशुओं के पूरे पिंजरे को एक ही बार में एनेस्थेटाइज्ड किया गया । एक इंजेक्शन के लिए व्यक्तिगत रूप से जानवरों को एनेस्थेटिज़ करने के लिए या संज्ञाहरण के बिना जानवरों सुई लगाने के लिए चुन सकते हैं । या तो इन विधियों का उचित है ।
  6. इस बीच, 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज (28g1/2) के साथ ०.१ मिलीलीटर वैक्सीन प्रत्येक तैयार करें । जब जानवरों को पूरी तरह से प्रेरित कर रहे हैं, चैंबर से एक जानवर को हटाने और एक तौलिया या बेंच पैड पर चूहे बल रखना ।
  7. टीका intramuscularly प्रशासन । सिरिंज के साथ एक ४५ ° कोण पर और बेवल का सामना करना पड़ के साथ, सिरिंज ~ 5 मिमी माउस के तिकोना में डालने और टीका सुई.
    नोट: हिंद क्वार्टर/flank एक इंजेक्शन साइट के बजाय deltoid के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  8. इंजेक्शन के बाद, सुई को मांसपेशियों में डालने के लिए ~ 5-10 s रखें । एक बार मात्रा वितरित किया जाता है, १८० डिग्री पर सिरिंज को घुमाएँ ताकि बेवल एक मुहर बनाने के लिए दूर चेहरे और टीके के रिसाव को रोकने के लिए । फिर, धीरे से सुई को इंजेक्शन साइट से बाहर खींचें ।
  9. पिंजरे में चूहे को लौटाएं । निर्दिष्ट समूह में सभी जानवरों के साथ प्रक्रिया को दोहराएं ।
  10. आइसोफ्लूराने को बंद करें और चूहों के अगले पिंजरे को एनेस्थेटिज़िंग से पहले ऑक्सीजन के साथ प्रेरण कक्ष को फ्लश कर दें ।
  11. जानवरों की निगरानी जब तक वे सभी सचेतक और पिंजरे में जा रहे हैं । पिंजरे को आवास स्थान पर लौटाएं ।
  12. जानवरों पर नजर रखने के लिए हर 12 एच पोस्ट टीकाकरण, अप करने के लिए ४८ ज, ऐसे किसी न किसी के रूप में रुग्णता के नैदानिक लक्षणों के लिए/ यदि लक्षण जारी रहती है, संस्थागत पशुचिकित्सा के साथ प्रदान और अगर जरूरत अध्ययन से चूहों को हटा दें ।
  13. प्रारंभिक टीकाकरण के बाद चार सप्ताह, एनेस्थेटिज़िंग द्वारा चूहों को बढ़ावा देने और एक ही टीका निर्माण कि पहले दिया गया था के साथ माउस की सही तिकोना में इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन का प्रबंध.
  14. फिर, किसी भी नैदानिक लक्षणों के लिए पशु की निगरानी । एक अतिरिक्त 2 सप्ताह के लिए घर जानवरों और फिर संक्रमण के साथ आगे बढ़ना ।

2. B. पर्टुसिस उपभेदों और संक्रमण inoculum की तैयारी की वृद्धि

  1. जमे हुए शेयरों से [cryopreserved पर-८० ° c में 15% ग्लिसरोल, stainer में प्लवकीय विकास से जमे हुए-विद्वान (SS) मीडिया12], बाहर लकीर B. पर्टुसिस बोर्डेट-gengou पर (BG) आगर13 प्लेट्स 10% डिफाइनेरिनेट भेड़ के साथ पूरक चयन के लिए रक्त और १०० μg/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (10% बीजी + एसएम) । 4 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं ।
  2. उठाओ ~ 8-10 थाली से तनाव (एस) के व्यक्तिगत कालोनियों और एसएस मीडिया के संरोपण 3 मिलीलीटर २२.८ मिमी एल के साथ पूरक-cysteine, ३.६ एमएम फेरस सल्फेट, ३.३ एमएम नियासिन, ४८.८ एमएम ग्लूटाथिओन, २२७ एमएम एस्कॉर्बिक एसिड, 1 मिलीग्राम/एमएल हेप्टाकिस, और १०० μg/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन । 16-24 एच के लिए ६० आरपीएम पर एक रोलर ड्रम में ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति बढ़ाएँ.
  3. अगले दिन, प्राथमिक संस्कृति को पतला 1:600, 1:300, 1:120, 1:60, 1:30, और 1:15 पूरक एसएस मीडिया के 3 मिलीलीटर में । 16-24 एच के लिए ६० आरपीएम पर रोलर ड्रम में ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते हैं ।
  4. बैक्टीरियल संस्कृतियों के लिए ६०० एनएम (ओडी६००) पर ऑप्टिकल घनत्व माप प्रदर्शन । स्पेक्ट्रोफोटोमीटर कुवेट्स का उपयोग करके, संस्कृतियों को पतला करने के लिए 1:10 तरल संस्कृतियों के ०.१ मिलीलीटर को बाँझ पीबीएस के ०.९ मिलीलीटर में जोड़कर ।
  5. आयुध डिपो६००≈ 0.8-1.2 के साथ एक संस्कृति का चयन करें । 1 ओडी (चित्रा 3) प्राप्त करने के लिए आवश्यक आयतन की गणना कीजिए । 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ६००० एक्स जी में एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में मात्रा नीचे स्पिन । महाप्राण और पुनर्जीवित जीवाणुरोधी कोशिका गोली बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में 1 आयुध डिपो की एक घनत्व प्राप्त करने के लिए [1-3 x 109 कॉलोनी बनाने इकाइयों (cfu)/एमएल] ।
  6. का एक संरोप तैयार करने के लिए ~ 5 x 105 करने के लिए १.५ x 106 cfus/चूहे में 40-50 μl, भंवर और प्रश्नपत्र पतला जीवाणु समाधान (चरण २.५ से) १००-बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में गुना ~ 1-3 x 107 cfus/एमएल (चित्रा 4ए) प्राप्त करने के लिए । बर्फ पर विवरियम के लिए संरोप परिवहन ।

3. मुरीन intranasal संक्रमण मॉडल

  1. vivarium में, सेट ऑक्सीजन और संज्ञाहरण स्थितियों के रूप में १.३ और १.४ चरणों में वर्णित है । चरण १.५ में वर्णित के रूप में, चूहों कक्ष में एनेस्थेटाइज़ करने के लिए रखें । संज्ञाहरण प्रभाव लेता है जब तक जानवरों की निगरानी ।
  2. जब चूहों एनेस्थेटाइज्ड कर रहे हैं, प्रेरण चैंबर से एक समय में एक जानवर को हटा दें. कंधे ब्लेड और गर्दन के पीछे, पृष्ठीय thorax के कूड़ा द्वारा माउस उठाओ । नाक तक पहुंचने के लिए माउस को सीधा रखें ।
  3. एक २०० μl पिपेट टिप का उपयोग कर, धीरे से (प्रत्येक नरे में 20-25 μl) माउस के नासारंध्र के लिए जीवाणु संरोप के 40-50 μl लागू होते हैं । माउस पकड़ो जब तक पूरे संरोप जानवर द्वारा सांस किया गया है । यदि कुछ संरोप बाहर बुलबुले, बुलबुले इकट्ठा और nares में फिर से पैदा । नकारात्मक नियंत्रण के रूप में चूहों के एक समूह के लिए बाँझ पीबीएस की एक बराबर राशि उद्धार.
  4. के रूप में कदम 1.10-1.12 में किया, उनके पिंजरे में inoculated जानवरों वापसी और जानवरों की निगरानी जब तक वे सतर्क और आगे बढ़ रहे हैं. पिंजरे वापस रैक पर अपने मूल आवास अंतरिक्ष के लिए लौटें । पशुओं के अगले सेट को एनेस्थेटिज़िंग से पहले अवशिष्ट आइसोफ्लूराने को निकालने के लिए ऑक्सीजन के साथ प्रेरण कक्ष को फ्लश करें । ४८ एच पोस्ट संक्रमण के लिए जानवरों की निगरानी ।
  5. प्रयोगशाला में, inoculum के प्लेट धारावाहिक dilutions, बाँझ pbs में, वास्तविक सीपस चूहों को दिया सत्यापित करने के लिए. प्लेट ०.१ मिलीलीटर की dilutions पर 10% BG + Sm प्लेट्स (चित्रा 4A) । प्लेटों को ३७ डिग्री सेल्सियस इनकोबेटर में रखें और 4 दिनों तक बढ़ें । गिनती और गणना करने के लिए माउस को दिया संरोप से cfus (चित्रा 4बी) ।

4. संक्रमण के बाद पशु ऊतक की कटाई

  1. माउस विच्छेदन और ऊतक फसल के लिए तैयार करें ।
    1. एक ऑटोक्लेव में प्रसंस्करण के ऊतकों के लिए आवश्यक सभी उपकरण (मोटे और ठीक कैंची, घुमावदार कैंची, ठीक संदंश, गोली pestles, और त्रिकोण स्प्रेपर्स) जीवाणुरहित । नसबंदी पाउच में औजार सील । लपेटें गिलास dounce में homogenizers पन्नी और जोड़ें आटोक्लेव टेप बाँझपन से संकेत मिलता है ।
    2. आगार प्लेट्स तैयार करें 1 या 2 दिन पहले ऊतक फसल के लिए सुनिश्चित करें कि प्लेटें उपयोग करने से पहले जम रहे हैं । B. pertussis के लिए, 10% BG + Sm का उपयोग करें । वांछित dilutions के साथ प्रत्येक माउस के लिए नाक septum, श्वासनली, और फेफड़ों के लिए लेबल प्लेट्स, प्रत्येक प्रयोग के लिए empirically निर्धारित किया है ।
    3. भरें और लेबल cfu कमजोर पड़ने ट्यूबों । बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए बाँझ pbs की ०.९ मिलीलीटर जोड़ने की प्रक्रिया और अंग प्रति dilutions के अंगों की संख्या पर आधारित है ।
    4. ऊतक संग्रह के लिए भरण और लेबल ट्यूबों:
      1. नाक पट और श्वासनली: pbs (Ca2 + और मिलीग्राम2 +-मुक्त) में बाँझ 1% कैसिइन के ०.३ मिलीलीटर के साथ एक बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब भरें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      2. फेफड़े: पीबीएस में 1% कैसिइन की 2 मिलीलीटर को एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें । फेफड़ों को काटने के लिए, 10% तटस्थ buffered formalin (nbf) और आरटी में स्टोर के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
      3. प्लीहा: एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए rpmi + 5% fbs की 3 मिलीलीटर जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
      4. रक्त: १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के दो सेट लेबल, पूरे रक्त के लिए एक और सीरम के लिए एक ।
    5. ताजा ७०% इथेनॉल विच्छेदन के लिए यूरिन और स्प्रे बोतलों को भरने के लिए तैयार किया जाना चाहिए ।
  2. फसल के दिन पर एक गाड़ी पर वीवेरियम के लिए सभी सामग्रियों परिवहन । बीएससी साफ और १.३ और १.४ चरणों में के रूप में संज्ञाहरण मशीन की स्थापना की ।
  3. चूहों को प्रेरण कक्ष में विच्छेद किया जा करने के लिए जगह और, ऑक्सीजन बहने के साथ, आइसोफ्लूराने पर 5% करने के लिए बारी और जानवरों बेहोश हो जब तक इंतजार. एक समय में एक चूहे को हटा दें, और cervically मौत सुनिश्चित करने के लिए एक द्वितीयक विधि के रूप में जानवर गडबडा । ग्रीवा अव्यवस्था के बाद, इच्छामृत्यु एक श्वसन दर और/या वापसी पलटा (पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण) की अनुपस्थिति की अनुपस्थिति से पुष्टि की जानी चाहिए ।
  4. स्थिति माउस, अधर पक्ष का सामना करना पड़, विच्छेदन बोर्ड पर और हाथ और पैर खुला पिन । ७०% इथेनॉल के साथ माउस के शरीर के नीचे स्प्रे ।
  5. forceps का उपयोग करना, श्रोणि के केंद्र में, पेट के नीचे त्वचा अकवार । तेज कैंची का उपयोग करते हुए, एक ऊर्ध्वाधर कट अप करने के लिए मंदिबल । फिर, दो परतों के अलावा धक्का द्वारा पेरिटोनियल दीवार से दूर त्वचा काटना, कैंची बंद के साथ छोटे से गतियों का उपयोग. त्वचा को बाँझ अंग फसल के लिए एक अबाधित क्षेत्र बनाने के लिए लोथ के पक्षों के लिए जगह है ।
  6. पर या जिगर के आसपास रिब पिंजरे के नीचे बरकरार पेरिटोनियम समझ और यह रिब पिंजरे की ओर बढ़ खुला काट. कम पाचन तंत्र का पर्दाफाश और तिल्ली खुलासा बाईं ओर बृहदांत्र चाल । घुमावदार संदंश का प्रयोग, तिल्ली समझ और कैंची के साथ संयोजी ऊतक दूर काटना. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में प्लीहा रखें जिसमें 3 मिलीलीटर rpmi + 5% एफबीएस हो और ट्यूब को बर्फ पर रखें ।
  7. असिरूप प्रक्रिया में रिब पिंजरे को स्थिर करने और डायाफ्राम खोलने में कटौती करने के लिए संदंश का उपयोग करें । फेफड़ों को संकुचन करना चाहिए और रीढ़ की ओर गिर जाना चाहिए । स्तन प्लेट को हटाने के लिए किनारों पर रिब केज को काटें ।
  8. अलग और सही फेफड़ों14के बेहतर पालि निकालें, फेफड़े की धमनियों और नसों को काटने । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पालि को 10% nbf से युक्त रखें और ऊतकों को ठीक करने के लिए कम से 24 एच के लिए ट्यूब को आरटी पर रखें । सही फेफड़ों और बाईं फेफड़ों के शेष पालियों को अलग करें । पीबीएस में 1% कैसिइन की 2 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में lobes रखें और इसे बर्फ पर रखें ।
  9. फेफड़े की नसों और धमनियों को काटने के बाद फेफड़ों को काटना, छाती गुहा को माउस के रूप में रक्त के साथ भरने की अनुमति देते हैं । टिप के साथ एक 1 मिलीलीटर pipetman का उपयोग करना, रक्त इकट्ठा करने और यह पूर्व लेबल के लिए स्थानांतरण १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब. बर्फ पर ट्यूब प्लेस ।
  10. फिर, गर्दन से, कोमल ऊतक (कर्णमूल, sublingual, और अधोजंभ ग्रंथियों और लिम्फ नोड्स) कि श्वासनली को कवर हटा दें । श्वासनली के आसपास की सुरक्षात्मक झिल्ली को खोलें और निकालें । नाजुक, ठीक संदंश और कैंची का उपयोग, घुटकी से श्वासनली अलग और किसी भी अन्य संयोजी ऊतक collarbones के ऊपर से मंडिबल के नीचे करने के लिए.
  11. forceps का उपयोग, श्वासनली के लिए पर पकड़ और clavicle के शीर्ष पर ट्रेकिआ में कटौती । लोच को अधिकतम करने के लिए नीचे श्वासनली खींचो और गला के ठीक ऊपर मंडिबल के नीचे श्वासनली में कटौती, जितना संभव हो (~ 1 सेमी) अलग । एक पूर्व में अंग प्लेस-लेबल १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब pbs में 1% कैसिइन की ०.३ मिलीलीटर के साथ और बर्फ पर जगह है ।
  12. माउस को अनपिन करें और नाक के स्पष्ट उपयोग के लिए शोधकर्ता का सामना करने वाले माउस के साथ इसे ventrally रखना । ७०% इथेनॉल के साथ माउस के सिर स्प्रे और, हाथ का उपयोग कर, खोपड़ी के पीछे सीधे माउस समझ ।
  13. कैंची का प्रयोग, नाक के नीचे से शुरू और ऊपर की ओर बढ़ रहा है, थूनी के नरम मांस काट । इसके अलावा, नाक के चारों ओर फर, त्वचा, और मूंछ को हटा दें । फिर, संदंश और घुमावदार कैंची के साथ, के साथ नासारंध्र में कैंची के सुझावों डालें घटता बताया जावक, और आंखों की ओर नाक पारित खुला, एक वी की तरह गठन बनाने में कटौती ।
  14. ठीक संदंश का उपयोग, निर्मित गठन के भीतर नाक पट और कोमल ऊतक इकट्ठा । एक पूर्व में ऊतक प्लेस-१.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब pbs में 1% कैसिइन की ०.३ एमएल के साथ लेबल और बर्फ पर जगह है ।
  15. एक biohazard बैग में लोथ के निपटान । अगले जानवर विदारक से पहले, विआयनीकृत पानी के साथ उपकरण कुल्ला, और फिर एक बीकर में जगह ७०% इथेनॉल से भरा । उपकरण निकालें, अतिरिक्त इथेनॉल बंद हिला, और फिर अगले विच्छेदन के साथ आगे बढ़ना
  16. चरण 4.3-4.14 के बाद प्रत्येक माउस को काटना ।
  17. नीचे वर्णित के रूप में ऊतकों की प्रक्रिया ।

5. प्लीहा का प्रसंस्करण

  1. spleens वियोजित करने के लिए, एक ६० मिमी ऊतक संस्कृति पकवान में एक ७० μm सेल छलनी जगह है । तिल्ली डालो और फिल्टर में मीडिया के साथ, एक 3 मिलीलीटर सिरिंज के प्लंजर का उपयोग कर. ध्यान से अंग मैश जब तक यह पूरी तरह से अलग है और सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर ।
  2. टिशू कल्चर डिश में rpmi + 5% fbs के 3 mL के साथ फ़िल्टर को कुल्ला करें । सेल निलंबन लीजिए और इसे अपने मूल 15 मिलीलीटर ट्यूब में रखें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० एक्स जी पर ट्यूब अपकेंद्रिकी कोशिकाओं को गोली करने के लिए ।
  3. महाप्राण या डीसेंट को सुपरनाटैंट और लाल रक्त कोशिकाओं को रीसपेंडिंग करके पेलेट को 2 मिलीलीटर में अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम (ACK) बफर (१५० एमएम अमोनियम क्लोराइड, 10 मिमी पोटेशियम बाइकर्बोनेट, ०.१ एमएम सोडियम ईडीटीए) से मुक्त करें । आरटी में 3 मिनट के लिए सेते (25 डिग्री सेल्सियस) ।
  4. ट्यूबों को भरने के लिए 8 मिलीलीटर rpmi के साथ + 5% fbs और सेंट्रेसेज ट्यूबों ४५० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर । महाप्राण या डिकनैंट । rpmi + 5% fbs के 5 मिलीलीटर में सेल छर्रों को पुनर्जीवित करें और एक हीमोसिटोमीटर और माइक्रोस्कोप का उपयोग करके splenocytes गिनती ।
  5. अच्छी तरह से प्रति २.५ x 106 कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा की गणना । एक ४८ में अच्छी तरह से थाली, बीज टी के ०.५ एमएल सेल मीडिया में कोशिकाओं (rpmi १६४० + 10% fbs, 10 μg/एमएल gentamicin, और ५० μm β-mercaptoethanol) प्रति अच्छी तरह से ।
  6. उपरोक्त गणना के आधार पर, सेल निलंबन की आवश्यक मात्रा को एक ताजा ट्यूब और गोली-कोशिकाओं में ४५० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
  7. टी सेल मीडिया की आवश्यक मात्रा में गोली resuspend । एक B. पर्टुसिस संक्रमण मॉडल के लिए, टीका एंटीजन के लिए antigen-विशिष्ट साइटोकाइन प्रतिक्रिया का परीक्षण: पर्टुसिस (prn) और तंतुमय hemagglutinin आसंजन (fha) । इसलिए, 3 उपचार की जरूरत है: 1) कोई उत्तेजना (एन एस, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में), 2) prn, और 3) एफए । परख के लिए, ७.५ एक्स टी सेल मीडिया के १.५ एमएल में 106 कोशिकाओं की आवश्यकता है (२.५ x प्रति ०.५ मिलीलीटर 106 कोशिकाओं) ।
  8. एक ४८-अच्छी थाली में सेल निलंबन के aliquot ०.५ मिलीलीटर ।
  9. कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए, टी-सेल मीडिया में 2 बार वांछित एकाग्रता में एंटीजन मिक्स करें । prn और fha = 1 μg/ml और ०.५ μg/एमएल की अंतिम सांद्रता क्रमशः । इसलिए, मिश्रण 2 μg/एमएल prn या 1 μg/एमएल fha में ०.५ मिलीलीटर । फिर, प्रत्येक नामित अच्छी तरह से उत्तेजना माध्यम के aliquot ०.५ मिलीलीटर, एक अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर के अंतिम मात्रा में 1x करने के लिए antigen उपचार पतला.
  10. 5% CO2में ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को सेते हैं । पूर्व लेबल microcentrifuge ट्यूबों में supernatants के दिन 7 और aliquot ०.५ मिलीलीटर पर supernatants लीजिए । एलिसा (चित्र 6) द्वारा प्रतिजन-विशिष्ट साइटोकिन्स का परीक्षण करने के लिए तैयार होने तक एक-20 डिग्री सेल्सियस में नमूनों को स्टोर करें ।

6. फेफड़ों की प्रोसेसिंग

  1. फेफड़ों स्थानांतरण (2 मिलीलीटर में 1% केसिइन pbs में) एक बाँझ में, 15 मिलीलीटर dounce homogenizer । ऊतक homogenize करने के लिए खल का उपयोग करें । वियोजित जब तक ऊतक के कोई बड़े कणों रहते हैं । homogenized निलंबन मूल 15 मिलीलीटर ट्यूब में वापस रखें ।
  2. सीयूएस को चढ़ाना के लिए ०.३ मिलीलीटर एलिक्वेट को निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४५० एक्स जी पर सेंटेट करें । लीजिए और पूर्व में ०.५ मिलीलीटर aliquot में सतह पर तैरनेवाला aliquot-लेबल microcentrifuge ट्यूबों । elisa द्वारा साइटोकिन्स के विश्लेषण तक एक-20 डिग्री सेल्सियस में नमूनों की दुकान.
  3. प्रश्नपत्र पतला करके चुने गए dilutions तैयार करें ०.१ मिलीलीटर कमजोर पड़ने ट्यूबों में homogenized फेफड़ों निलंबन की (०.९ मिलीलीटर बाँझ pbs) । प्लेट ०.१ empirically चुना dilutions पूर्व पर-10% BG + एसएम प्लेटों लेबल और बाँझ त्रिकोण स्प्रेडर का उपयोग कर फैला ।
  4. 4 दिनों के लिए कमरे में हवा में ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों सेते ।
  5. cfus/फेफड़ों की गणना और गणना करें (चित्र 6) । संक्षेप में, प्लेट के कमजोर पड़ने कारक द्वारा cfu संख्या बरामद गुणा, तो भी कुल मात्रा में जो अंग संसाधित किया गया था. cfu गणना तो प्रत्येक जानवर और graphed के लिए लॉग10 मूल्यों में तब्दील हो रहे हैं ।
    1. 30-300 कालोनियों के साथ प्लेटें आसानी से और सही गिना जाता है । से कम 6 कालोनियों के साथ प्लेटें गणना के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए के बाद से ऐसी कम कॉलोनी संख्या15त्रुटि परिचय । का पता लगाने की एक निचली सीमा को प्राप्त करने के लिए, कुल मात्रा जिसमें एक अंग homogenized किया गया था की मात्रा से विभाजित करने के लिए एक थाली पर हाजिर करने के लिए इस्तेमाल undiluted homogenized (उदाहरणके लिए, 2 मिलीलीटर कुल मात्रा से विभाजित ०.१ मिलीलीटर undiluted homogenized की निचली सीमा के बराबर होती है 20 सीयूएस डिटेक्टेबल) ।

7. नाक septum और श्वासनली का प्रसंस्करण

  1. 1% pbs के ०.३ मिलीलीटर में ऊतक homogenize/केसीन के साथ गोली खल ताररहित मोटर homogenize । ऊतक को मोटे तौर पर वियोजित होने तक 0.5 -1 मिनट के लिए ऊतक homogenize । बैक्टीरिया निलंबन में बहाया जाना चाहिए ।
  2. ०.१ मिलीलीटर के सीरियल तनुकरण द्वारा चुनी गई 10x dilutions को तैयार करें dilutions ट्यूबों में homogenized निलंबन के ०.९ मिलीलीटर बाँझ पीबीएस की । डॉट ०.१ पूर्व पर प्रत्येक कमजोर पड़ने की मिलीलीटर-10% BG + Sm प्लेटें लेबल और एक त्रिकोण स्प्रेडर है कि एक ७०% इथेनॉल धोने और लौ द्वारा निष्फल किया गया है का उपयोग कर निलंबन फैल गया ।
  3. 4 दिनों के लिए कमरे में हवा में ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों सेते ।
  4. ६.५ (चित्र 6) के रूप में सीयूएस/अंग की गणना और गणना करें । पता लगाने की एक निचली सीमा को प्राप्त करने के लिए, कुल मात्रा जिसमें एक अंग homogenized किया गया था खंड से विभाजित करने के लिए उपयोग की गई एक थाली से undiluted homogenized (उदाहरणके लिए, ०.३ मिलीलीटर कुल मात्रा से विभाजित ०.१ एमएल undiluted की निचली सीमा के बराबर 3 cfus डिटेक्टा ble).

8. रक्त की प्रोसेसिंग

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए १८,००० एक्स जी में पृथक पूरे रक्त युक्त ट्यूबों को गोली लाल रक्त कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र ।
  2. ध्यान से एक पूर्व लेबल सीरम microcentrifuge ट्यूब में सीरम सतह पर तैरनेवाला और पिपेट बंद ले । आगे के बहाव के विश्लेषण के लिए तैयार जब तक-20 डिग्री सेल्सियस में ट्यूबों स्टोर (यानी, कुल और विशिष्ट आईजी elisa) ।

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Representative Results

वर्णित मॉडल के लिए एक विधि से पता चलता है टीका दक्षता और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के दौरान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन । चित्रा 1 के विश्लेषण के लिए चूहों और फसल ऊतकों को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल प्रतिनिधि वैक्सीन अनुसूची को दर्शाया गया है । चित्रा 2 चूहों को प्रेरित करने के लिए कार्यरत संज्ञाहरण प्रणाली के सेटअप को दर्शाता है, टीकाकरण और बैक्टीरियल inoculums वितरित करने के लिए जांचकर्ताओं को सक्षम करने. चित्रा 3 उदाहरण से पता चलता है आयुध डिपो६०० माप और गणना करने के लिए एक 1 ओडी बैक्टीरियल निलंबन प्राप्त करने के लिए तैयार करने के लिए १००-गुना पतला बैक्टीरियल संरोप चूहों को वितरित करने के लिए. चित्रा 4 संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया संरोप तैयारी, धारावाहिक dilutions की चढ़ाना योजना, और सीरियल dilutions चढ़ाना पर आधारित सीयूएस वितरित cfus गणना करने के लिए इस्तेमाल किया उदाहरण गणना दर्शाया गया है । चित्रा 5 antigen-विशिष्ट याद प्रतिक्रियाओं टीका antigen fha के साथ उत्तेजना के सात दिनों के बाद हासिल से पता चलता है । संयोजन वैक्सीन समूह से प्रतिरक्षण प्लीहा कोशिकाओं, alum/fha/bcfa, ifnγ और il-17 का उत्पादन किया, जबकि काफी downregulating आईएल-5. यह प्रभाव बी पर्टुसिस संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के एक Th1/Th17 ध्रुवीकरण को बढ़ावा देता है । साइटोकिन्स की पृष्ठभूमि का स्तर केवल मीडिया के साथ प्रतिरक्ष्य प्लीहा कोशिकाओं की ऊष्मायन द्वारा उत्पादित किया गया था, संकेत मिलता है कि साइटोकिन्स का पता चला प्रतिरक्षण के लिए प्रतिक्रियाओं को याद कर रहे थे (डेटा नहीं दिखाया गया). चित्र 6 एक उदाहरण के रूप में दर्शाया गया है cfu बैक्टीरिया की गणना एक प्रतिरक्षण माउस के श्वसन पथ के ऊतकों से बरामद, बी पर्टुसिस ऊतक के धारावाहिक dilutions का उपयोग कर homogenates 10% BG + Sm प्लेटों पर चढ़ाया । कच्चे गिनती कमजोर पड़ने कारक और ऊतक lysate की कुल मात्रा से गुणा किया गया और डेटा बदल लॉग इन थे । टीकाकरण पशुओं से सीयूएस तो टीका के सुरक्षात्मक प्रभाव को निर्धारित करने के लिए गैर-टीकाकरण (भोली) जानवरों की तुलना में कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्रतिनिधि वैक्सीन अनुसूची । चूहों 0 दिन पर टीकाकरण कर रहे हैं और फिर बढ़ाया ~ 4 सप्ताह बाद (d28) उपयुक्त apv के साथ. बी पर्टुसिस के साथ चूहों का संक्रमण चूहों को बढ़ाने के बाद ~ 2 सप्ताह (d42) होता है । संक्रमण के बाद जानवरों को विभिन्न दिनों (d43) के बाद टीका मारा जाता है । ऊतक और रक्त डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एकत्र किया जाता है (जैसे, सीएफयू गणना, साइटोकिने और एंटीबॉडी एलिसस) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: निश्चेतना मशीन सेटअप । दिखाया संलग्न प्रेरण चैंबर और मेहतर प्रणाली (जैविक सुरक्षा कैबिनेट के अंदर) के साथ एक संवेदनाहारी vaporizer है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : 1 ओडी६०० बैक्टीरियल सस्पेंशन की तैयारी । OD६०० मान पतला प्राथमिक B. पर्टुसिस संस्कृतियों से प्राप्त किए गए थे । लॉग चरण में एक संस्कृति संक्रमण के लिए 1 ओडी६०० संस्कृति में एक संस्कृति प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. संक्षेप में, 1 का एक आयुध डिपो६०० वांछित संस्कृति की गणना ओडी६०० द्वारा विभाजित किया गया था एक मात्रा प्राप्त करने के लिए 1 ओडी संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए. संक्षेप में, 1 की एक OD600 को वांछित संस्कृति के परिकलित OD600 से विभाजित किया गया था ताकि संक्रमण के लिए इस्तेमाल की जाने वाली 1 ओडी बराबर मात्रा प्राप्त की जा सके । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4 : वितरित intranasal inoculum की गणना । (क) संक्रमण के संरोप कि 10-4, 10-5, और 10-6के लिए पतला है के धारावाहिक कमजोर पड़ने के योजनाबद्ध । इन dilutions 10% BG + Sm पर चढ़ाया, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए incubated और फिर गिना जाता है । (ख) १०-४, १०-५, और १०-६ डिल्यूटियों से गणना की जाती है तो उसे इंट्राऐसलेट वितरित सीयूएस की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : प्लीहा कोशिकाओं द्वारा cytokine उत्पादन fha, alum के साथ प्रतिप्रतिकृत/fha, bcfa/fha, और alum/bcfa/fha. वियोजित कोशिकाओं 7 दिनों के लिए fha के साथ सुसंस्कृत थे । supernatants (एक) ifn-γ, (ख) आईएल-17, और (सी) आईएल-5 के लिए सैंडविच elisa द्वारा परीक्षण किया गया । त्रुटियों सलाखों प्रत्येक समूह के माध्य के मानक विचलन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, n = 5 प्रति समूह । पी < ०.००१. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन10से अनुकूलित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए । 

Figure 6
चित्रा 6 : B. चूहों से काटा ऊतक से पर्टुसिस सीपस और गणना । (क) ख. पर्टुसिस सीपस को अनुमनित माउस ऊतक से. ०.१ मिलीलीटर सीरियल की dilutions 4 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर incubated । (ख) homogenized श्वासनली से प्राप्त cfus पर आधारित गणना । cfus संबंधित कमजोर पड़ने से गुणा कर रहे थे और फिर 10 से गुणा करने के लिए प्रति मिलीलीटर सीयूएस प्राप्त । प्रति अंग cfu प्राप्त करने के लिए, cfu प्रति मिलीलीटर कुल मात्रा में जो अंग homogenized (०.३ मिलीलीटर) से गुणा किया गया । प्रति अंग सीस तो लाग रूपान्तरित हो गए. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए । 

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Discussion

व्यापक प्रोटोकॉल यहां वर्णित करने के लिए वैक्सीन का अध्ययन करने के लिए प्रेरित प्रतिरक्षा बी पर्टुसिस संक्रमण भी अंय रोगजनकों की एक किस्म के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन की अनुमति होगी । प्रोटोकॉल रोगज़नक़ चुनौती के बाद वैक्सीन प्रभावकारिता का निर्धारण, और प्रतिरक्षा समारोह के समानांतर विच्छेदन, टीकाकरण देने के तरीकों पर चर्चा करता है । अन्य रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूल करने में, कई मापदंडों को संशोधित करने की आवश्यकता होगी । ये शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, पशु संज्ञाहरण की विधा, वैक्सीन संरचना, खुराक, और प्रशासन के मार्ग. इसके अलावा, ब्याज की चुनौती दी रोगज़नक़ के प्रशासन की खुराक और मार्ग, फसल के लिए चयनित ऊतक, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के डाउनस्ट्रीम मूल्यांकन कारक है कि रोगज़नक़ के लिए संशोधित किया जा सकता है/

बी पर्टुसिस संक्रमण का माउस मॉडल व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है और रोगजनन और vaccinology अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है16,17,18,19,20। मूरीन मॉडल मानव संक्रमण के लिए कई समानताएं प्रदर्शन, सहित: मैं) बैक्टीरिया श्वसन पथ तक ही सीमित है और तेजी से गुणा, द्वितीय) युवा पशुओं अपेक्षाकृत गंभीर संक्रमण प्रदर्शित, iii) टीके कि रक्षा के बीच अच्छा पत्राचार पर्टुसिस के खिलाफ बच्चों और उन है कि संक्रमण के खिलाफ चूहों की रक्षा, और iv) B. पर्टुसिस-विशिष्ट टी कोशिकाओं और एंटीबॉडी मध्यस्थता प्राकृतिक और वैक्सीन-प्रेरित सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा21,22, 23 , 24. इसलिए, मूरीन मॉडल जीवाणु निकासी25पर प्रतिरक्षण प्रभाव के अध्ययन परमिट । मॉडल बी के लिए चूहों का उपयोग करने का एक और लाभ पर्टुसिस संक्रमण आनुवंशिक रूप से संशोधित पीटकर और ट्रांसजेनिक पशुओं की उपलब्धता वैक्सीन में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों का अध्ययन करने के लिए प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं19,26है ।

टीकाकरण के बहुमत विशेष रूप से इंट्रामस्कुलर (आइएमएस) मार्ग के माध्यम से, parenterally प्रशासित रहे हैं । इस मार्ग को वरीयता दी जाती है क्योंकि यह न्यूनतम स्थानीय reactogenicity27,28,29के साथ प्रणालीगत प्रतिरक्षा को elicits । इंट्रामस्कुलर इंजेक्शन के विकल्प में चमड़े के नीचे (एस॰सी॰) या intraperitoneal (आईएफपीए) डिलीवरी शामिल है, जो प्रणालीगत प्रतिक्रियाओं को भी प्रेरित करते हैं । चमड़े के नीचे मार्गों भी आकर्षक हैं, के रूप में वहां निवासी antigen की एक बड़ी आबादी नाड़ी और लसीका प्रणालियों के लिए उपयोग के साथ डर्मिस के भीतर कोशिकाओं (apc) पेश30। हालांकि, पर्टुसिस वैक्सीन के लिए intradermal डिलीवरी का पता नहीं लगाया गया है । प्रायोगिक apv के intraperitoneal वितरण इंट्रामस्कुलर प्रतिरक्षण के लिए इसी तरह प्रतिरक्षा उत्पन्न करता है31 और एक विश्वसनीय इंजेक्शन मार्ग के लिए murine अध्ययन, नैदानिक उपयोग के लिए अव्यवहारिक है.

इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल आइएमएस प्रतिरक्षण मार्ग, जो फेफड़ों में सुरक्षा प्रदान करता है, लेकिन nasopharynx३२नहीं है । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक intranasal (i.n.) टीका एक स्थानीय, श्लेष्मल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि ऊपरी और निचले श्वसन इलाकों की रक्षा करता है, विशेष रूप से नाक, जो बैक्टीरिया है कि बाद में अन्य के लिए प्रेषित किया जा सकता है की एक जलाशय के रूप में कार्य करता है को बढ़ावा देता है संगे३३. इसके अलावा, i.n. प्रतिरक्षण ऊतक निवासी स्मृति है कि प्रणालीगत प्रतिरक्षण३३,३४द्वारा उत्पंन नहीं है उत्पंन दिखाया गया है । इसलिए, वैक्सीन प्रशासन मार्ग के विकल्प वैक्सीन के प्रकार पर बहुत निर्भर करता है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रोग के खिलाफ की रक्षा के लिए आवश्यक है ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित बैक्टीरियल डिलीवरी का इंट्रानेसल मार्ग श्वसन रोगजनकों के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है जो सुरक्षित रूप से और लगातार एक जीवाणु संरोप को सीधे एनेस्थेटाइज्ड चूहों के श्वसन पथ में बचाता है । हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करता है एक उच्च मात्रा खुराक (40-50 μl) कि nasopharynx में साँस है और निचले श्वसन पथ में यात्रा. एक कम मात्रा में संरोप (10-20 μl) nasopharynx उपजाना होगा, लेकिन फेफड़ों के उपनिवेशन कम हो जाएगा३५। हालांकि, बी पर्टुसिसयुक्त हवा बूंदों की साँस लेना व्यक्तियों और संचरण के संक्रमण की प्राकृतिक विधा माना जाता है । प्रशासन के इस मार्ग में विभिन्न पशु मॉडलों में३६,३७का उपयोग किया गया है । प्रत्यक्ष i.n. inoculation करने के लिए संक्रमण के तुलनीय स्तर को प्राप्त करने के लिए, बैक्टीरियल संरोप की काफी उच्च सांद्रता (109-1011 cfus/एमएल) और प्रसव के समय की आवश्यकता है३८.

माउस श्वसन पथ के उपनिवेशन स्थापित करने के लिए, यह प्रोटोकॉल ताजा बैक्टीरिया का उपयोग करता है, तरल संस्कृति में उगाया यह सुनिश्चित करने के लिए कि टीका लगाने के लिए इस्तेमाल बैक्टीरिया उग्र चरण में हैं और लॉग चरण में नकल कर रहे हैं । experimenters भी पूर्व titrated, जमे हुए शेयरों से एक संरोप का उपयोग कर सकते हैं । इस cfus माउस को प्रशासित किया जा रहा है की एक ज्ञान सक्षम बनाता है । हालांकि, इन inoculums में बैक्टीरिया गैर-उग्र चरण में हो सकता है, जो श्वसन पथ औपनिवेशीकरण३९की क्षमता को कम कर सकते हैं । संक्रमण के बाद, संरोप के लिए माउस को वितरित जीवाणु cfus निर्धारित क्रम में चढ़ाया जाता है । जांचकर्ताओं के लिए भी संरोप थाली करने के लिए पहले विवो संक्रमण में बैक्टीरिया की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने और संरोप की खुराक की पुष्टि करने के लिए चुन सकते हैं ।

संक्रमण के बाद, बैक्टीरियल सीपस एक पूर्व निर्धारित timepoint पर बलिदान चूहों से अनुमन्य पृथक ऊतक द्वारा इनमेंटेड हैं । इस विधि के लिए एक नुकसान चूहों के एक निर्धारित सेट के लिए गतिकत: रोगज़नक़ cfus ट्रैक करने के लिए अपनी असमर्थता है । शोधकर्ताओं ने टीका-प्रेरित बैक्टीरियल प्रतिबंध की जांच करने के लिए विभिन्न timepoints पर बलिदान पशुओं के कई समूहों का उपयोग करना चाहिए । प्रत्येक प्रयोग में चूहों की संख्या की जांच करने के लिए timepoints की संख्या और वांछित प्रभाव आकार के आधार पर भिन्न हो जाएगा । यह वृद्धि हुई जैविक भिन्नता का परिचय दे सकता है. ब्याज की रोगज़नक़ में एक bioluminescent या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन का एकीकरण संक्रमण३५के दौरान विवो में विकास और प्रसार की गैर आक्रामक निगरानी की अनुमति देगा । इस विधि जैविक भिन्नता को कम कर देता है और प्रयोगात्मक जानवरों की आवश्यक संख्या को कम करता है, के बाद से अनुदैर्ध्य डेटा जानवरों के एक ही समूह से प्राप्त कर रहे हैं.

ऊतक वियोजन और एकरूपता प्रोटोकॉल श्वसन पथ के ऊतकों के लिए यहां कार्यरत जिगर, गुर्दे, आंत के रूप में अन्य ठोस ऊतकों की कॉलोनी गणना के लिए भी लागू होता है, और/या मूत्राशय संक्रमण की साइटों से पूछताछ करने के लिए और ब्याज के रोगाणुओं का प्रसार

cfu गणना के साथ, इस प्रोटोकॉल प्रतिरक्षण और प्राकृतिक संक्रमण द्वारा हासिल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है । विशेष रूप से, साइटोकिन्स का परिमाणन प्रणालीकृत उत्पादन और स्थानीय रूप से प्रभावयुक्त प्रतिरक्षा से उत्पंन प्रोफाइल के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं । साइटोकिन्स immunomodulators हैं जो प्रभावित ऊतकों और सेलुलर प्रतिरक्षा के सक्रियण के लिए सेलुलर आमद को बढ़ावा देते हैं, साथ ही ह्यूमोरल प्रतिक्रियाओं के उत्पादन के लिए मदद प्रदान करते हैं10,४०,४१। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, विभिन्न ऊतक डिब्बों में उत्पादित साइटोकिन्स, जैसे फेफड़े और प्लीहा का पता लगाया जाता है । हालांकि यहां नहीं दिखाया गया है, उत्तेजना प्रोटोकॉल भी draining लिम्फ नोड्स में प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए लागू है ।

elisa विश्लेषण की अनुमति देता है पता लगाने और मीडिया supernatants या मिश्रित निलंबन में साइटोकिन्स के परिमाणन (यानी, homogenates या सीरम), जनसंख्या के स्तर पर जानकारी उपज और antigen विशिष्ट साइटोकाइन प्रतिक्रियाओं से एक की विशेषता नामित timepoints पर मिश्रित सेल संस्कृति । इसके विपरीत, एलिस्पॉट या फ्लो साइटोमेट्री जैसे तरीके, एक विश्लेषण और अभिव्यक्ति के स्तर प्रति सेल४२,४३का उत्पादन करने वाले कोशिकाओं की संख्या के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं । यद्यपि यहाँ वर्णित नहीं, ये विधियाँ antigen-विशिष्ट B कक्षों का पता लगाने के लिए भी लागू होते हैं । cfu गणना और इम्यूलोलॉजिकल assays के संयोजन टीकाकरण के जवाब की पूरी तस्वीर प्रदान करते हैं ।

अंय विश्लेषण है कि इस संक्रमण प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है पश् चजात या transcriptomic विश्लेषण शामिल है जब डीएनए और आरएनए ब्याज४४के ऊतकों से प्राप्त की है । इस प्रकार, उचित टीका संरचना, प्रतिरक्षण, और रोगज़नक़ डिलीवरी मार्ग के विचार के साथ, यह प्रोटोकॉल इसके कार्यान्वयन में बहुमुखी है और आसानी से संक्रमण के विभिन्न मॉडलों के लिए उपयुक्त है । इन तकनीकों को भी गैर संक्रामक रोगों (यानी, कैंसर, मल्टीपल स्केलेरोसिस, अस्थमा, स्व-प्रतिरक्षित रोगों) जहां टीके एक चिकित्सीय साधन के रूप में इस्तेमाल किया जाता है पर लागू होते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम 1r01ai125560-01 और शुरू हुआ धन ओहियो राज्य विश्वविद्यालय से समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2L induction chamber Vet Equip 941444
Fluriso Vet One V1 501017 any brand is appropriate
Bordet Gengou Agar Base BD bioscience 248200
Casein Sigma C-7078
Casamino acids VWR J851-500G Strainer Scholte (SS) media components
L-Glutamic acid Research Products Int G36020-500
L-Proline Research Products Int P50200-500
Sodium Chloride Fisher BP358-10
Potassium Phosphate monobasic Fisher BP362-1
Potassium Chloride Fisher P217-500
Magnesium Chloride hexahydrate Fisher M2670-500G
Calcium Chloride Fisher C75-500
Tris base Fisher BP153-1
L-cysteine HCl Fisher BP376-100 SS media suplements
Ferrous Sulfate heptahydrate Sigma F-7002
Niacin Research Products Int N20080-100
Glutathione Research Products Int G22010-25
Ascorbic acid Research Products Int A50040-500
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific 11875093
FBS Sigma F2442-500mL  any US source, non-heat inactivated
gentamicin ThermoFisher Scientific 15710064
B-mercaptoethanol Fisher  BP176-100
15mL dounce tissue grinder Wheaton 357544 any similar brand is appropriate
Cordless Hand Homogenizer Kontes/Sigma  Z359971-1EA any similar brand is appropriate
Instruments - scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders any brand is appropriate
3mL syringes BD bioscience 309657
15mL conical tubes Fisher  339651
1.5mL microfuge tubes Denville C2170
70um cell strainers Fisher  22363548
60mm plates ThermoFisher Scientific 130181
48-well tissue culture plates ThermoFisher Scientific 08-772-1C
1mL insulin syringe 28G1/2 Fisher Scientific/Excel Int. 14-841-31
Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-173-21
Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-173-77
Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit Invitrogen / eBioscience 50-172-09

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References

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
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