Summary
Her præsenterer vi en elegant protokol i vivo evaluering af vaccine effektivitet og vært immunrespons. Denne protokol kan tilpasses for vaccine modeller, at studere viral, bakteriel eller parasitære patogener.
Abstract
Vacciner er en 20th århundrede medicinske marvel. De har dramatisk reduceret den sygelighed og dødelighed forårsaget af smitsomme sygdomme og bidraget til en markant stigning i middellevetiden i hele verden. Bestemmelse af vaccine effekten ikke desto mindre en udfordring. Nye beviser tyder på, at den nuværende acellulær vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) inducerer suboptimal immunitet. Derfor er en stor udfordring at designe en næste-generations vaccine, der inducerer beskyttende immunitet uden bivirkninger af en helhed-celle vaccine (wPV). Her beskriver vi en protokol, som vi brugte til at teste effekten af en lovende, Roman adjuvans, der forvrænger immunrespons til en beskyttende Th1/Th17 fænotype og fremmer en bedre frihøjde B. pertussis udfordring fra murine luftvejene. I denne artikel beskrives protokollen for musen immunisering, bakteriel podning, væv høst og analyse af immunrespons. Ved hjælp af denne metode, inden for vores model, har vi med succes belyst afgørende mekanismer fremkaldes ved en lovende, næste-generations acellulær pertussis vaccine. Denne metode kan anvendes på enhver infektionssygdom model for at bestemme vaccine effektivitet.
Introduction
Vacciner udgør en af de største offentlige sundhed resultater af 1900-tallet, men vi stadig helt forstår ikke de mekanismer, hvorved vellykkede vacciner stimulere beskyttende immunitet. Identifikation af molekylære signaturer (fx., celle aktivering markører, udvidelse af cellulære undertyper og mønstre af genekspression) induceret efter vaccination giver et væld af oplysninger til at forudsige og generere et virkningsfuldt immunrespons. Kompleksiteten af vært-patogen svar kan ikke replikeres tilstrækkeligt, ved hjælp af in vitro celle kultur systemer1. In vivo vaccine modeller er designet til samtidig vurderer flere immun celletyper i værten. Dette giver en fordel når kendetegner vaccine antigen behandling og præsentation, differential cytokin sekretion og udvidelse af immunceller. Protokollen beskrevet her giver en detaljeret metode til at bestemme vaccine effektivitet gennem evaluering af de systemiske og lokale immunrespons og kvantificering af patogenet byrde i væv af interesse. Den her viste eksempel tester effekten af en eksperimentel vaccine for patogenet Bordetella pertussis (B. pertussis).
B. pertussis er en gram-negative bakterie, der er den ætiologiske agent for luftvejssygdomme kighoste (pertussis)2,3. Tæt kontakt med inficerede personer (symptomatisk eller asymptomatisk) fører til transmission, kolonisering og sygdom. Trods betydelig global vaccine dækning4, pertussis betragtes en resurging sygdom i mange lande rundt om i verden og er en væsentlig årsag til forebyggelige barndom dødsfald5,6,7, 8. i 2015, B. pertussis og pertussis blev optaget i det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme (NIAID) emerging infektionssygdom patogen liste, understreger behovet for udvikling af en bedre vaccine, som giver langlivede beskyttende immunitet.
I øjeblikket er et aktivt område for undersøgelsen til at styre pertussis genopblussen udviklingen af en næste-generations acellulær pertussis vaccine (aPV) med en optimal kombination af roman adjuvanser og antigener til at efterligne immunresponset fremkaldes ved hele-celle kighoste vaccine (wPV)9. Ved hjælp af protokollen beskrevet, rapporteret vi for nylig, at ændring af et gældende FDA-godkendt aPV ved tilsætning af en roman adjuvans, Bordetella kolonisering faktor A (BcfA), resulterede i mere effektive reduktion af B. pertussis bakteriemængde fra musen lungerne10,11. Denne forstærkede beskyttelse var ledsaget af skævvridning af en alun-induceret Th1/Th2 immunrespons på de mere beskyttende Th1/Th17 immun profil10. Denne protokol er detaljeret og omfattende, at aktivere investigator at opnå maksimal oplysninger gennem samtidige evaluering af værten og immunrespons til en bred vifte af patogener.
Protokollen beskrevet her følger den repræsentative vaccine tidsplan, vist i figur 1, at sikre optimal vært immunrespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg med levende dyr blev gennemført efter en protokol, der er godkendt af The Ohio State University IACUC i overensstemmelse med IACUC retningslinjer. C57BL/6 mus blev brugt i alle vaccinationer og infektioner. Både mandlige og kvindelige mus er brugt i hver gruppe ifølge NIH retningslinjer. Antallet af dyr pr. gruppe blev bestemt ved magt beregninger baseret på de forudsagte forskelle i resultaterne blandt eksperimentelle grupper. For eksempel, 8 mus pr. gruppe vil give 80% strøm på α = 0,05 (2-sidet) for en 2-prøve t- test til at opdage forskelle i resultaterne af renter af 1,33 standardafvigelser (SDs).
1. immunisering af mus
- Forberede en master vaccine mix i en steril fysiologisk buffer som saltvand eller UP'ER.
Bemærk: Det samlede volumen i blandingen bør omfatte 10% mere end der kræves til immunisering af hele gruppen. Koncentrationer af vaccine sammensætning er nærmere beskrevet nedenfor i trin 1.1.1 og 1.1.2. Transport af poster til vivarium på is.- B. pertussis undersøgelser, omfatte følgende vaccine grupper: aPV og aPV + BcfA. Derudover bruge alun, vaccine antigen alene (FHA og Prn) og naiv (ikke-vaccineret) mus som kontrolgrupper.
Bemærk: aPV er 1/5th den menneskelige dosis af en FDA-godkendt aPV, som er sammensat af tetanustoksoid, reduceret difteri toxoid, pertussis toxoid (PT), trådformede hemagglutinin (FHA) og pertactin (Prn) adsorberet til aluminium salte. En human dosis af nuværende pertussis aPV er 0,5 mL, 1/5th af en dosis er derfor 0,1 mL. Diskenheder for aPV + BcfA er 0,1 mL af aPV (1/5th den menneskelige dosis) + 0.046 mL af BcfA (30 µg) pr. mus. Den maksimale lydstyrke, der kan leveres sikkert til en muskel er 0,1 mL. Fordi den aPV + BcfA vaccine volumen er større end 0,1 mL, vaccinen skal afleveres i begge skuldre, delt omtrent ligeligt, for at blive administreret sikkert. - For at forberede en eksperimentel vaccine, for én dosis Kombiner 1 µg FHA og 0,5 µg Prn med 50 µg aluminium hydroxid gel i steril PBS. Tillade en eksperimentel aPV blande i et laboratorium roller i 15 min. ved stuetemperatur (RT). Bagefter, spin tube på 18.000 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspend indholdet i 1 mL steril PBS.
- B. pertussis undersøgelser, omfatte følgende vaccine grupper: aPV og aPV + BcfA. Derudover bruge alun, vaccine antigen alene (FHA og Prn) og naiv (ikke-vaccineret) mus som kontrolgrupper.
- I vivarium, oprette anæstesi maskine (figur 2).
Bemærk: Sikre, at der er tilstrækkelige niveauer af ilt og isofluran i deres respektive tanke før brug. Vejer isofluran skyllevæske kardæsker og udskiftes, når dens vægt stiger af 50 g. - Grundigt rense den biologiske sikkerhed kabinet (BSC) og placere den rene induktion kammer inde BSC. Forbinde linjerne i anæstesi og skyllevæske fra anæstesi maskine til induktion kammer. Åbn den ilt tank via regulator til at sikre ilt flyder og indstilles til 1,5-2 L/min.
- Placere mus i den ønskede alder (6-12 uger) i induktion kammer. Drej på isofluran til 2,5-3% for at let bedøver musene. Overvåge dyrene, indtil de ikke bevæger sig i salen og deres vejrtrækning er aftaget.
- Test niveauet af induktion af tå-klemme, observere for enhver refleksive bevægelser. Hvis der ingen er, så er musene klar til at injicere.
Bemærk: I dette eksperiment, dyr hele buret var anesthetized på én gang. Man kan vælge bedøver dyrene individuelt til injektion eller injicere dyr uden bedøvelse. En af disse metoder er hensigtsmæssige. - I mellemtiden Forbered 1 mL insulin sprøjter (28G 1/2) med 0,1 mL af vaccine hver. Når dyr er fuldt induceret, fjerne dyr fra salen og lå musen ventrally på et håndklæde eller bænk pad.
- Administrere vaccinen intramuskulært. Med sprøjte med en 45° vinkel og med facet opad, indsætte sprøjte ~ 5 mm i deltoid af musen og injicere vaccinen.
Bemærk: Hind kvartal/flanke kan bruges som en injektionsstedet i stedet for deltoid. - Hold nålen indsat i musklen for ~ 5-10 s efter injektion. Når diskenheden er leveret, skal du dreje sprøjten på 180°, så facet ansigter væk for at skabe en forsegling og forhindre udsivning af vaccinen. Derefter, træk langsomt kanylen ud af injektionsstedet.
- Returnere musen til buret. Gentag proceduren for med alle dyr i den udpegede gruppe.
- Slukke for isofluran og skylle induktion kammer med ilt før bedøve den næste bur af mus.
- Overvåge dyrene, indtil de er alle alert og bevæger sig i buret. Tilbage i buret til lokationen boliger.
- Monitor dyr hver 12 h post vaccination, op til 48 h, for kliniske symptomer på sygelighed som ru/usoigneret frakke, langsom gangart eller anstrengt åndedræt. Hvis symptomerne vedvarer, rådføre sig med den institutionelle dyrlæge og fjerne mus fra undersøgelsen, hvis det er nødvendigt.
- Fire uger efter første vaccination, boost mus ved at bedøve og administration af Intramuskulære injektioner i det rigtige deltoid mus med den samme vaccine formulering, der fik tidligere.
- Igen, overvåge dyrs for nogen kliniske symptomer. Hus dyr for yderligere 2 uger, og derefter fortsætte med infektion.
2. vækst af B. pertussis stammer og forberedelse af infektion inokulum
- Fra frosne lagre [befrugtede ved-80 ° C i 15% glycerol, frosne fra planktoniske vækst i Stainer-Scholte (SS) medier12], streak ud B. pertussis på Bordet-Gengou (BG) agar13 plader suppleret med 10% defibrinated får blod og 100 µg/mL streptomycin (10% BG + Sm) for udvælgelsen. Inkuber plade ved 37 ° C i 4 dage.
- Vælge ~ 8-10 individuelle kolonier af stammen eller stammerne fra pladen og podes 3 mL af SS media suppleret med 22,8 mM L-Cystein, 3,6 mM jernholdige sulfat, 3,3 mM niacin, 48,8 mM glutathion, 227 mM ascorbinsyre, 1 mg/mL heptakis og 100 µg/mL streptomycin. Vokse kultur ved 37 ° C i en roller tromle ved 60 rpm i 16-24 timer.
- Den næste dag, fortyndes primære kultur 1:600, 1: 300, 1:120, 1:60, 1:30 og 1:15 i 3 mL af suppleres med SS medier. Inkuber kultur ved 37 ° C i roller tromle ved 60 rpm i 16-24 timer.
- Udføre optisk tæthed målinger på 600 nm (OD600) for de bakterielle kulturer. Bruger spektrofotometrets kuvetter, fortyndes kulturer 1:10 ved at tilføje 0,1 mL flydende kulturer til 0,9 mL steril PBS.
- Vælg en kultur med OD600≈ 0,8-1,2. Beregne den diskenhed, der er nødvendig for at opnå 1 OD (figur 3). Spin ned for lydstyrken i 1,5 mL microcentrifuge rør ved 6000 x g i 5 min. ved 25 ° C. Opsug supernatanten og resuspend bakteriel celle pellet i 1 mL steril PBS til at opnå en tæthed af 1 OD/mL [1-3 x 109 kolonidannende enheder (CFU) /mL].
- At forberede en inokulum ~ 5 x 105 1,5 x 106 CFUs/mus i 40-50 µL, vortex og seriefremstillede fortyndes den bakterielle løsning (fra trin 2,5) 100 i 1 mL steril PBS til at opnå ~ 1-3 x 107 CFUs/mL (figur 4A). Transportere inokulum til vivarium på is.
3. murine Intranasal infektion Model
- Angiv ilt og anæstesi betingelser i vivarium, som beskrevet i trin 1.3 og 1.4. Som beskrevet i trin 1,5, placere mus i salen til bedøver. Overvåge dyrene indtil anæstesi træder i kraft.
- Når musene er bedøvede, fjerne et dyr på et tidspunkt fra induktion kammer. Afhente mus af harmoniske af den dorsale thorax, bag skulderbladene og nakke. Placer musen oprejst for at få adgang til næsen.
- Bruger en 200 µL pipette tip, langsomt anvendelse 40-50 µL af den bakterielle inokulum nares mus (20-25 µL i hver nare). Hold musen, indtil det hele inokulum har været indåndes af dyret. Hvis nogle af inokulum bobler ud, indsamle boblerne og re indgyde ind i nares. Levere et tilsvarende beløb af steril PBS til en gruppe af mus som negativ kontrol.
- Som gjort i trin 1.10-1.12, returnere de vaccinerede dyr til deres bur og overvåge dyr, indtil de er opmærksomme og bevægende. Vende buret tilbage til sin oprindelige bolig plads på rack. Skyl induktion kammer med ilt til at fjerne de resterende isofluran før bedøve det næste sæt af dyr. Overvåge dyr for 48 h efter infektionen.
- I laboratoriet leveret plade serielle fortyndinger af inokulum i steril PBS til at kontrollere de faktiske CFUs til mus. Plade 0,1 mL af fortyndinger på 10% BG + Sm plader (figur 4A). Læg pladerne i 37 ° C inkubator og vokse i 4 dage. Tælle og beregne CFUs fra inokulum leveret til musen (fig. 4B).
4. høst af animalsk væv efter infektion
- Forberede mus dissektion og væv høst.
- Sterilisere alle værktøjer (grove og fine saks, buet saks, fine pincet, pellet pestles og trekant spredere) nødvendig til forarbejdning af væv i en autoklave. Forsegle værktøjer i sterilisation poser. Wrap glas dounce homogenizers i folie og tilføje autoklave tape for at angive sterilitet.
- Forberede agar plader 1 eller 2 dage inden høsten i væv til at sikre, at pladerne er størknet før brug. For B. pertussis, skal du bruge 10% BG + Sm. etiket plader til næseskillevæggen, luftrøret og lungerne for hver mus med de ønskede fortyndinger, bestemmes empirisk for hvert forsøg.
- Fyld og etiket CFU fortynding rør. Tilføje 0,9 mL steril PBS til sterile 1,5 mL microcentrifuge rør baseret på antallet af organer til proces og fortyndinger pr. orgel.
- Fyld og etiket rør til væv samling:
- Næseskillevæggen og luftrøret: Fyld en sterile 1,5 mL microcentrifuge tube med 0,3 mL sterilt 1% kasein i PBS (Ca2 + og Mg2 +-fri). Opbevares ved 4 ° C.
- Lunger: tilsættes 2 mL sterilt 1% kasein i PBS til en steril 15 mL konisk rør og opbevares ved 4 ° C. For at høste lungerne for histologi, tilsættes 2 mL 10% neutrale bufferet formalin (NBF) og gemme på RT.
- Milt: Tilføj 3 mL af RPMI + 5% FBS til en 15 mL konisk slange. Opbevares ved 4 ° C.
- Blod: label to sæt af sterile 1,5 mL microcentrifuge rør, et til fuldblod og et for serum.
- Frisk 70% ethanol bør være parat til at fylde bægre og spray flasker til dissektion.
- Transportere alle materialer til vivarium på en vogn på dagen for høsten. Rengør BSC og konfigurere anæstesi maskine som i trin 1.3 og 1.4.
- Placere mus for at blive dissekeret i salen, induktion og ilt flyder, slå isofluran til 5% og vente, indtil dyrene er ubevidste. Fjerne mus én ad gangen, og cervically splitte dyret som en sekundær metode til at sikre død. Efter cervikal dislokation, dødshjælp bør bekræftes ved fravær af en respirationsfrekvens og/eller manglende tilbagetrækning refleks (tå knivspids test).
- Placer musen, ventrale side opad i dissektion bestyrelsen og pin arme og ben åben. Spray ned i kroppen af mus med 70% ethanol.
- Brug af pincet, spænde i huden under maven, i midten af bækkenet. Brug skarpe saks, lave et lodret snit op til underkæben. Derefter, dissekere hud væk fra peritoneal væggen ved at skubbe de to lag fra hinanden, ved hjælp af små bevægelser med saksen lukket. Sted hud til siderne af kroppen til at oprette en uhindret inden for steril orgel høst.
- Forstå den intakte bughinden under brystkassen på eller omkring leveren og sprættede den op mod brystkassen. Udsætte lavere fordøjelseskanalen og flytte til venstre afslørende milten, tyktarmen. Bruger buet pincet, forstå milten og dissekere væk bindevæv med saks. Sted milt i en 15 mL konisk tube indeholder 3 mL af RPMI + 5% FBS og sted rør på is.
- Bruge pincet til at stabilisere brystkassen på formet som et sværd proces og skar mellemgulvet. Lungerne skal deflatere og falder mod rygsøjlen. Skære åbne brystkassen på siderne til at fjerne brystet plade.
- Isolere og fjerne den overlegne lap af den højre lunge14, skære de pulmonale arterier og vener. Placer lap i en 15 mL konisk rør indeholdende 10% NBF og sted rør på RT i mindst 24 timer for at lave væv. Isolere de resterende kamre af højre lunge og den venstre lunge. Placer lapper i en 15 mL konisk rør indeholdende 2 mL 1% kasein i PBS og placere den på is.
- Efter opskæring pulmonal venerne og arterierne til at dissekere ud af lungerne, tillade brysthulen at fylde med blod som musen exsanguinates. Ved hjælp af en 1 mL pipetman med tip, indsamle blod og overføre det til forud mærket 1,5 mL microcentrifuge tube. Røret anbringes på is.
- Fra nakken, fjern derefter den bløde væv (parotideale, sublinguale og mandibulære kirtler og lymfeknuder), der dækker luftrøret. Åbn og fjern de beskyttende membraner omkring luftrøret. Fint, ved hjælp af saks og fine pincet, adskille luftrøret fra spiserøret og alle andre bindevæv fra toppen af collarbones til bunden af mandiblen.
- Brug af pincet, hold på luftrøret og skar luftrøret øverst på kravebenet. Trække luftrøret ned for at maksimere elasticitet og skar luftrøret i bunden af mandiblen lige over strubehovedet, isolere så meget som muligt (~ 1 cm). Placer orglet i en forud mærket 1,5 mL microcentrifuge tube med 0,3 mL 1% kasein i PBS og placere den på is.
- Unpin musen og lægge den ventrally, med musen vender forsker for klar adgang til næsen. Spray hovedet af musen med 70% ethanol, og bruger hænder, forstå mus direkte bag kraniet.
- Ved hjælp af saks, skåret væk bløde kød af snuden, starter fra bunden af næsen og bevæger sig opad. Derudover fjerne pels, hud og knurhår omkring næsen. Derefter, med buet saks og pincet, Indsæt spidsen af saksen i nares med kurver pegede udad, og skar den nasale passage mod øjne, at skabe en V-lignende formation.
- Bruger fine pincet, indsamle næseskillevæggen og blødt væv i den oprettede dannelse. Placer vævet i en forud mærket 1,5 mL microcentrifuge tube med 0,3 mL 1% kasein i PBS og placere den på is.
- Bortskaffe slagtet i en biohazard taske. Før dissekere det næste dyr, skyl værktøjer med deioniseret vand og derefter anbringes i et baegerglas fyldt med 70% ethanol. Fjern værktøjerne, ryste overskydende ethanol, og derefter gå videre med næste dissektion
- Dissekere hver mus følge trin 4.3-4.14.
- Behandle væv, som beskrevet nedenfor.
5. behandling af milt
- For at adskille milt, skal du placere en 70 µm celle si i et 60 mm vævskultur parabol. Hæld milt og ledsagende medier i filteret, ved hjælp af stemplet en 3 mL sprøjte. Omhyggeligt mash orglet, indtil det er helt adskilt og filtreret gennem celle si.
- Skyl filteret med 3 mL af RPMI + 5% FBS i vævskultur skål. Indsamle cellesuspension og placere den i sin oprindelige 15 mL tube. Der centrifugeres rør ved 450 x g i 5 min. ved 4 ° C for at sammenpresse cellerne.
- Opsug eller den dekanteres og lyse røde blodlegemer af resuspending pellet i 2 mL af ammoniumklorid kalium (ACK) buffer (150 mM ammoniumklorid, 10 mM kaliumbicarbonat, 0.1 mM natrium EDTA). Inkuber i 3 min på RT (25 ° C).
- Fylde rørene op til 8 mL med RPMI + 5% FBS og centrifugeres rør på 450 x g i 5 min. ved 4° C. Opsug eller den dekanteres. Resuspend celle pellets i 5 mL af RPMI + 5% FBS og Grev splenocytes ved hjælp af en hemocytometer og mikroskop.
- Beregne omfanget af celler for at stimulere 2,5 x 106 celler pr. brønd. I en 48-godt plade, seed celler i 0,5 mL af T-celle media (RPMI 1640 + 10% FBS, 10 µg/mL gentamicin og 50 µM β-mercaptoethanol) pr. brønd.
- Baseret på ovenstående beregning, placere cellesuspension krævede mængde i en frisk tube og pellet-celler ved 450 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Resuspenderes i den krævede mængde i T-celle medier. For en B. pertussis infektion model, teste antigen-specifikke cytokin respons til vaccineantigener: pertactin (Prn) og fintrådede hemagglutinin vedhæftning (FHA). Derfor, 3 behandlinger er nødvendigt: 1) ingen stimulation (NS, som negativ kontrol), 2) Prn og 3) FHA. Til analysen er 7,5 x 106 celler i 1,5 mL af T-celle medier påkrævet (2,5 x 106 celler pr. 0,5 mL).
- Alikvot 0,5 mL cellesuspension til en 48-godt plade.
- For at stimulere cellerne, bland antigener på 2 gange den ønskede koncentration i T-celle medier. Endelige koncentrationer af Prn og FHA = 1 µg/mL og 0,5 µg/mL, henholdsvis. Derfor, Bland 2 µg/mL Prn eller 1 µg/mL FHA i 0,5 mL. Derefter, alikvot 0,5 mL af stimulation medium i hver udpeget godt, fortynding af antigen behandling til 1 x i en endelige mængden af 1 mL i hver brønd.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2plader. Indsamle analysere på dag 7 og alikvot 0,5 mL af analysere i forvejen afmærket microcentrifuge rør. Opbevare prøverne i en-20 ° C indtil klar til at teste antigen-specifikke cytokiner ved ELISA (figur 6).
6. behandling af lungerne
- Overføre lunger (i 2 mL 1% kasein i PBS) til en steril, 15 mL dounce homogeniseringsapparat. Brug pistil at homogenisere væv. Adskille indtil ingen store partikler af væv forbliver. Sted homogeniseret suspension tilbage i den oprindelige 15 mL tube.
- Fjerne en 0,3 mL alikvot for plating CFUs og centrifugeres homogenatet på 450 x g i 5 min. ved 4 ° C. Indsamle og alikvot supernatanten i 0,5 mL alikvoter i forvejen afmærket microcentrifuge rør. Opbevare prøverne i en-20 ° C indtil analyse af cytokiner ved ELISA.
- Forberede valgte fortyndinger ved seriel fortynding af 0,1 mL af homogeniseret lunge suspension i fortynding rør (0,9 mL steril PBS). Plade 0,1 mL af empirisk valgte fortyndinger på forud mærket 10% BG + Sm plader og spredes ved hjælp af steril trekant sprederen.
- Inkuber plader ved 37 ° C i rumluft i 4 dage.
- Tælle og beregne CFUs/lunge (figur 6). Kort, multiplicere gendannede CFU tal af fortyndingsfaktoren af pladen, så også af den samlede mængde, hvori orglet blev forarbejdet. CFU beregninger er derefter omdannes til Log10 værdier for hvert enkelt dyr og grafen.
- Plader med 30-300 kolonier er let og præcist tælles. Plader med mindre end 6 kolonier bør ikke bruges til beregninger, da sådanne lave koloni numre indføre fejl15. For at opnå en lavere grænse på opdagelse, den samlede mængde, som en orgel blev homogeniseret er divideret med volumenet bruges til spot på en tallerken fra den ufortyndede homogenatet (fx., 2 mL samlede volumen divideret med 0,1 mL af ufortyndet homogenatet er lig med den nedre grænse for 20 CFUs påvises).
7. behandling af næseskillevæggen og luftrør
- Homogeniseres vævet i 1% 0,3 mL PBS/kasein med pellet støder cordless motor homogenizers. Homogeniseres væv til 0,5-1 min. indtil væv er i vid udstrækning adskilles. Bakterier skal blive kastet i suspensionen.
- Forberede valgte 10 x fortyndinger ved seriel fortynding af 0,1 mL af den homogeniserede suspension i fortyndinger rør indeholdende 0,9 mL steril PBS. Dot 0,1 mL af hver fortynding på forud mærket 10% BG + Sm plader og sprede suspensionen ved hjælp af en trekant sprederen, der er blevet steriliseret ved en 70% ethanol vask og flamme.
- Inkuber plader ved 37 ° C i rumluft i 4 dage.
- Tælle og beregne CFUs/orgel som skridt 6,5 (figur 6). For at opnå en lavere grænse på opdagelse, den samlede mængde, som en orgel blev homogeniseret er opdelt af den anvendte mængde til prik på en plade fra den ufortyndede homogenatet (fx., 0,3 mL samlede volumen divideret med 0,1 mL af ufortyndet er lig med den nedre grænse for 3 CFUs detecta ble).
8. behandling af blod
- Der centrifugeres rør indeholdende isolerede fuldblod på 18.000 x g i 30 min. ved 4 ° C til pellet røde blodlegemer.
- Tag forsigtigt serum supernatanten og afpipetteres i et forud mærket serum microcentrifuge rør. Gemme rør i-20 ° C indtil klar for videre downstream analyse (dvs., samlede og specifikke Ig ELISA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modellen beskrevet viser en metode til at evaluere vaccine effektivitet og immunrespons under vært-patogen interaktioner. Figur 1 viser repræsentative vaccine skema bruges til at immunisere og inficere mus og høste væv til analyse. Figur 2 viser opsætningen af anæstesi systemet ansat til at fremkalde mus, gør det muligt for efterforskerne at levere immunizations og bakterielle inoculums. Figur 3 viser eksempel OD600 målinger og beregninger for at opnå en 1 OD bakteriel suspension for at forberede 100-fold fortyndet bakteriel inokulum leveres til mus. Figur 4 viser inokulum præparatet bruges til infektionen, plating ordningen af de serielle fortyndinger, og eksempel beregningerne bruges til at optælle CFUs leveret til mus baseret på plating serielle fortyndinger. Figur 5 viser antigen-specifikke hjemkalde svar fremkaldte efter syv dages stimulation med vaccineantigen FHA. Immunisere milt celler fra gruppen kombination vaccine FHA-Alum-BcfA, produceret IFNγ og IL-17, mens betydeligt downregulating IL-5. Denne effekt fremmer en Th1/Th17 polarisering af immunresponset under B. pertussis infektion. Baggrundsværdier af cytokiner blev produceret af inkubation af immuniserede milt celler med medier alene, der angiver, at de cytokiner opdaget var hjemkalde svar til immunisering (data ikke vist). Figur 6 viser et eksempel CFU tælling af bakterier inddrives fra luftveje væv af en immuniseret mus, ved hjælp af serielle fortyndinger af B. pertussis væv homogeniseret belagt på 10% BG + Sm plader. Rå tæller blev ganges fortynding faktor og det samlede volumen af vævet lysate og dataene blev log omdannet. CFUs fra immuniseret dyr er derefter sammenlignet med ikke-vaccineret (naivt) dyr til at bestemme den beskyttende effekt af vaccinen.
Figur 1 : Repræsentant vaccine tidsplan. Mus er immuniseret på dag 0 og derefter boostet ~ 4 uger senere (d28) med en passende aPV. Infektion af mus med B. pertussis opstår ~ 2 uger (d42) efter styrke mus. Efter infektion aflives dyrene på forskellige dage (d43-56) efter podning. Væv og blod er indsamlet for downstream analyse (fx., CFU optælling, cytokin og antistof ringprøver). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: anæstesi MASKINOPSÆTNING. Vist er et bedøvelsesmiddel vaporizer med vedlagte induktion kammer og skyllevæske system (indvendig biologiske sikkerhed kabinet). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Forberedelse af 1 OD600 bakteriel suspension. OD600 værdier var fremstillet af fortyndet primære B. pertussis kulturer. Én kultur i log fase blev brugt til at beregne mængden nødvendig for at opnå en kultur på 1 OD600 kultur for infektion. Kort, en OD600 1 blev divideret med den beregnede OD600 af de ønskede kultur til at opnå en volumen, equaling 1 OD anvendes til infektion. Kort, var en OD600 af 1 divideret med den beregnede OD600 af den ønskede kultur til at opnå en volumen, equaling 1 OD anvendes til infektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Beregning af leverede intranasal inokulum. (A) skematisk af seriel fortynding af infektion inokulum, der er fortyndet til 10-4, 10-5og 10-6. Disse fortyndinger er belagt på 10% BG + Sm, inkuberes i 4 dage ved 37 ° C og derefter tælles. (B) tæller fra 10-4, 10-5og 10-6 fortyndinger bruges derefter til at beregne intranasalt leverede CFUs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Cytokin produktion af milten celler immuniseret med FHA, alun/FHA, BcfA/FHA og Alum/BcfA/FHA. Dissocierede celler blev kulturperler med FHA i 7 dage. Analysere blev testet af sandwich ELISA for a IFN-γ, b IL-17 og c IL-5. Fejl barer er udtrykt som standardafvigelse af gennemsnittet af hver gruppe, n = 5 pr. gruppe. p < 0,001. Tallet er tilpasset fra en tidligere publikation10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : B. pertussis CFUs og beregninger fra høstede væv fra mus. (A) B. pertussis CFUs fra homogeniseret mus væv. 0,1 mL serielle fortyndinger inkuberes ved 37 ° C i 4 dage. (B) beregninger baseret på CFUs fremstillet af homogeniseret luftrøret. CFUs blev ganget med de respektive fortynding og derefter ganges med 10 for at opnå CFUs pr. mL. For at opnå CFU pr. orgel, blev CFUs pr. mL ganget med det samlede volumen, hvor orglet var homogeniseret (0,3 mL). CFUs pr. orgel blev derefter log omdannet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omfattende protokollen beskrevet her til at studere vaccine-induceret immunitet til B. pertussis infektion vil også tillade evaluering af vært svar på en række andre patogener. Protokollen diskuterer metoder til at levere immunizations, bestemme vaccine effekten følgende patogen udfordring og parallelle dissektion af immunforsvaret. I forbindelse med tilpasning af protokollen for at studere andre patogener, ville flere parametre skal ændres. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, tilstanden af animalske anæstesi, vaccine sammensætning, dosis og administrationsvej. Derudover er dosis og administrationsvej af udfordret patogenet af interesse, valgte væv til høst, og efterfølgende evaluering af immunrespons faktorer, der kan redigeres for patogenet/sygdom af interesse.
Musemodel af B. pertussis infektion er udbredt og er en fremragende model for patogenesen og vaccinologi undersøgelser16,17,18,19,20. Murine modeller udviser mange ligheder med human infektion, herunder: i) bakterier er begrænset til luftvejene og formere sig hurtigt, ii) unge dyr viser forholdsvis svære infektioner, iii) god korrespondance mellem vacciner, der beskytter børn mod kighoste og dem, der beskytter mus mod infektion, og iv) B. pertussis-specifikke T-celler og antistoffer mægle naturlige og vaccine-induceret beskyttende immunitet21,22, 23 , 24. derfor murine modellen tillader undersøgelse af immunisering virkninger på bakteriel clearance25. En anden fordel ved at bruge mus til model B. pertussis infektioner er tilgængeligheden af genetisk modificerede knockout og transgene dyr at studere kritiske spillere i vaccine-induceret immunrespons19,26.
Fleste vaccinationer gives parenteralt, specielt via ruten intramuskulær (i.m.). Denne rute er at foretrække fordi det fremkalder systemisk immunitet med minimal lokal reactogenicity27,28,29. Alternativer til Intramuskulære injektioner omfatter subkutant (s.c.) eller intraperitoneal (i.p.) levering, som også fremkalde systemisk svar. Subkutane ruter er også attraktivt, da der er en stor population af hjemmehørende antigen præsentere celler (APC) i dermis med adgang til de vaskulære og lymfe-systemer30. Intradermal levering er dog ikke blevet undersøgt for kighoste vaccine. Intraperitoneal levering af eksperimentelle aPV genererer lignende immunitet til intramuskulær immunisering31 og er en pålidelig injektion rute for murine undersøgelser, omend upraktisk til klinisk brug.
Denne protokol udnytter i.m. immunisering rute, som giver beskyttelse i lungerne, men ikke nasopharynx32. Nylige undersøgelser har vist, at en intranasal (i.n.) vaccine fremmer et lokale, slimhinde immunrespons, der beskytter øvre og nedre luftveje, især næse, der fungerer som et reservoir af bakterier, der efterfølgende kan overføres til andre værter33. Derudover har i.n. immunisering vist sig at generere væv bopæl hukommelse, der ikke er genereret af systemisk immunisering33,34. Derfor afhænger valget af vaccine administration indgivelsesvej i høj grad på typen vaccine og immunrespons forpligtet til at beskytte mod sygdom.
Ruten intranasal af bakteriel levering beskrevet i denne protokol er en udbredt metode til respiratorisk patogener, der sikkert og konsekvent leverer en bakteriel inokulum direkte ind i luftvejene af bedøvede mus. Vores protokol bruger en høj-volumen dosis (40-50 µL) der inhaleres ind i nasopharynx og rejser ind i de nedre luftveje. En lav lydstyrke inokulum (10-20 µL) ville kolonisere nasopharynx, men kolonisering af lungerne vil være minimal35. Men, indånding af B. pertussis-indeholdende luft dråber er betragtet som den naturlige tilstand for infektion af enkeltpersoner og transmission. Denne administrationsvej har været brugt i forskellige dyremodeller36,37. For at opnå sammenlignelige niveauer af infektion til direkte i.n. podning, er betydeligt højere koncentrationer af den bakterielle inokulum (109-1011 CFUs/mL), og leveringstiden påkrævet38.
For at etablere kolonisering af musen luftveje, bruger denne protokol friske bakterier, dyrket i flydende kultur for at bakterier anvendes til podning er i fasen for ondskabsfulde og er replikerende i stadiet log. Eksperimentatorer kan også bruge et inokulum fra pre titreret, frosne bestande. Dette giver mulighed for en viden om CFUs administreret til musen. Bakterier i disse inoculums kan dog i den ikke-virulente fase, som kan reducere effektiviteten af luftveje kolonisering39. Efter infektion, er inokulat belagt for at bestemme den bakterielle CFUs leveret til musen. Efterforskere kan også vælge at plade inokulum inden i vivo infektion at sikre levedygtigheden af bakterier og bekræfte dosis af inokulat.
Efter infektion optælles bakteriel CFUs ved homogenisering isoleret væv fra ofrede mus på et forudbestemt tidspunkt. En ulempe at denne metode er dets manglende evne til at kinetically spore patogen CFUs for et angivet sæt af mus. Forskere skal bruge flere grupper af dyr ofres på forskellige timepoints til at undersøge vaccine-induceret bakteriel begrænsning. Antallet af mus i hvert forsøg vil variere afhængigt af antallet af timepoints til at undersøge og den ønskede effekt størrelse. Dette kan indføre øget biologisk variation. Integration af et en bioluminescerende eller fluorescerende reporter gen i patogenet af interesse vil tillade ikke-invasiv monitorering af vækst og udbredelse i vivo i løbet af infektion35. Denne metode reducerer biologiske variation og minimerer det nødvendige antal forsøgsdyr, da tidsseriedata er fremstillet af den samme gruppe af dyr.
Væv dissociation og homogenisering protokollen ansat her for luftveje væv er også gældende for kolonien tælling af andre solid væv såsom lever, nyre, tarmen eller blæren til at afhøre lokaliteter af infektion og udbredelse af patogener af interesse.
Sammen med CFU optælling giver denne protokol karakterisering af immunrespons, som fremkaldes ved vaccination og naturlig infektion. Specifikt, kvantificering af cytokiner produceret systemisk og mulighed lokalt for bestemmelse af virkningsfuldt immun profiler som følge af vaccination. Cytokiner er hæmmende, at fremme cellulære tilstrømning til berørte væv og aktivering af cellulær immunitet samt yde hjælp til generation af humorale svar10,40,41. Ved hjælp af denne protokol, registreres cytokiner produceret i forskellige væv rum, såsom lungekræft og milt. Selv om ikke vist her, er stimulation protokollen også gældende for evaluering af svar i afdrypning lymfeknuder.
ELISA analyse giver påvisning og kvantificering af cytokiner i medier analysere eller blandet suspensioner (dvs., homogeniseret eller serum), giver oplysninger på befolkningsniveau og kendetegner antigen-specifikke cytokin svar fra en blandet cellekultur på udpeget timepoints. Derimod metoder som ELISPOT eller flowcytometri tillader evalueringen af antallet af celler, der producerer en analysand og niveauet af udtryk pr. celle42,43. Selv om ikke beskrevet her, er disse metoder også anvendes til påvisning af antigen-specifikke B-celler. Kombinationen af CFU optælling og immunologiske assays give fuldstændigt billede af reaktionen immunisering.
Andre analyser, der kan udføres ved hjælp af denne infektion protokol omfatter epigenetiske eller transkriptom analyse når DNA og RNA er fremstillet af væv af interesse44. Således, under hensyntagen til passende vaccine sammensætning, immunisering og patogen leveringsbetingelser rute, denne protokol er alsidige i sin gennemførelse og let egnet til forskellige modeller for infektion. Disse teknikker er også gælder for ikke-smitsomme sygdomme (dvs., kræft, multipel sklerose, astma, autoimmune sygdomme) hvor vacciner anvendes som et terapeutisk modalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af 1R01AI125560-01 og start-up midler fra The Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2L induction chamber | Vet Equip | 941444 | |
| Fluriso | Vet One | V1 501017 | any brand is appropriate |
| Bordet Gengou Agar Base | BD bioscience | 248200 | |
| Casein | Sigma | C-7078 | |
| Casamino acids | VWR | J851-500G | Strainer Scholte (SS) media components |
| L-Glutamic acid | Research Products Int | G36020-500 | |
| L-Proline | Research Products Int | P50200-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-10 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Fisher | M2670-500G | |
| Calcium Chloride | Fisher | C75-500 | |
| Tris base | Fisher | BP153-1 | |
| L-cysteine HCl | Fisher | BP376-100 | SS media suplements |
| Ferrous Sulfate heptahydrate | Sigma | F-7002 | |
| Niacin | Research Products Int | N20080-100 | |
| Glutathione | Research Products Int | G22010-25 | |
| Ascorbic acid | Research Products Int | A50040-500 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | any US source, non-heat inactivated |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15710064 | |
| B-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| 15mL dounce tissue grinder | Wheaton | 357544 | any similar brand is appropriate |
| Cordless Hand Homogenizer | Kontes/Sigma | Z359971-1EA | any similar brand is appropriate |
| Instruments - scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders | any brand is appropriate | ||
| 3mL syringes | BD bioscience | 309657 | |
| 15mL conical tubes | Fisher | 339651 | |
| 1.5mL microfuge tubes | Denville | C2170 | |
| 70um cell strainers | Fisher | 22363548 | |
| 60mm plates | ThermoFisher Scientific | 130181 | |
| 48-well tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 08-772-1C | |
| 1mL insulin syringe 28G1/2 | Fisher Scientific/Excel Int. | 14-841-31 | |
| Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-21 | |
| Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-77 | |
| Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-172-09 |
References
- Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
- Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
- Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
- Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
- Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
- Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
- McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
- Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
- Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
- Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
- Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
- Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
- Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
- Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
- Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
- Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
- Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
- Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
- Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
- Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
- Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
- Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178 (2010).
- Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
- Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
- Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
- Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
- Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469 (1988).
- Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
- Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
- Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264 (2013).
- Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
- Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
- Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359 (2012).
- Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
- Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
- Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
- Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
- Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
- Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
- Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
- Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
- Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009 (2018).
