Summary
Hier präsentieren wir eine elegante Protokoll für in Vivo Evaluierung der Impfstoff Wirksamkeit und Host Immunantworten. Dieses Protokoll kann für Impfstoff-Modelle, die studieren, virale, bakterielle oder parasitäre Erreger angepasst werden.
Abstract
Impfstoffe sind ein 20th Jahrhundert medizinische Wunder. Sie haben drastisch reduziert die Morbidität und Mortalität durch Infektionskrankheiten verursacht und trugen zu einem markanten Anstieg der Lebenserwartung rund um den Globus. Bestimmung der Impfstoffwirksamkeit bleibt jedoch eine Herausforderung. Anzeichen dafür deutet darauf hin, dass die aktuelle azelluläre Impfstoff (aPV) für Bordetella Pertussis (B. Pertussis) suboptimal Immunität induziert. Daher ist eine große Herausforderung einen nächsten Generation Impfstoff entwerfen, der schützende Immunität ohne die negativen Nebenwirkungen von einer ganzen Zelle Impfstoff (wPV) induziert. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das wir verwendet, um die Wirksamkeit von vielversprechenden, neuartigen Adjuvans zu testen, die verzerrt Immunantworten auf einen schützenden Th1/Th17-Phänotyp und fördert eine bessere Clearance von B. Pertussis Herausforderung aus murinen Atemwege. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für Maus-Immunisierung, bakterielle Inokulation, Gewebe zu ernten und Analyse von Immunreaktionen. Mit dieser Methode, innerhalb unseres Modells haben wir entscheidende Mechanismen ausgelöst durch eine vielversprechende, nächste Generation azellulären Pertussis-Impfstoff erfolgreich aufgeklärt. Diese Methode kann auf jede Infektionskrankheit Modell angewendet werden, um Impfstoffwirksamkeit zu bestimmen.
Introduction
Impfstoffe sind eines der größten öffentlichen Gesundheit Errungenschaften des 20. Jahrhunderts, doch wir immer noch nicht vollständig verstehen die Mechanismen, durch die erfolgreiche Impfstoffe schützende Immunität anregen. Die Identifizierung von molekularen Signaturen (zB., Zelle Aktivierungsmarker, Erweiterung der zellulären Subtypen und Muster der Genexpression) induziert nach der Impfung bietet eine Fülle von Informationen für die Vorhersage und erzeugen eine wirksame Immunantwort. Die Komplexität der Wirt-Pathogen-Antworten kann nicht angemessen mit in-vitro- Zelle Kultur Systeme1repliziert werden. In Vivo Impfstoff Modelle sind entworfen, um damit auch mehrere Immunzelle Arten innerhalb des Hosts zu bewerten. Dies bietet einen Vorteil, wenn Impfstoff Antigen Verarbeitung und Präsentation, differenzielle Zytokin-Sekretion und Ausbau der Immunzellen zu charakterisieren. Das hier beschriebene Protokoll sieht eine detaillierte Methode zum Bestimmen der Impfstoffwirksamkeit durch Auswertung der systemische und lokale Immunantwort und Quantifizierung der Erreger Belastung in Geweben von Interesse. Das hier angegebene Beispiel testet die Wirksamkeit von einer experimentellen Impfstoff gegen den Erreger Bordetella Pertussis (B. Pertussis).
B. Pertussis ist ein gramnegatives Bakterium, das die ätiologische Agent der Erkrankung der Atemwege Husten Keuchhusten (Pertussis)2,3ist. Engen Kontakt mit infizierten Personen (symptomatisch oder asymptomatisch) führt zur Übertragung, Kolonisierung und Krankheit. Trotz erheblichen globalen Impfstoff Abdeckung4Keuchhusten gilt eine aufrappelte Krankheit in vielen Ländern auf der ganzen Welt und ist die Hauptursache für vermeidbare Kindheit Todesfälle5,6,7, 8. 2015, B. Pertussis und der Pertussis wurden in das National Institute of Allergy und infectious Diseases (NIAID) emerging Pathogen/Infektionskrankheiten Liste, unter Betonung der Notwendigkeit für die Entwicklung besserer Impfstoffe zur Verfügung stehen, das verleiht langlebige schützende Immunität.
Derzeit ist ein aktives Gebiet der Untersuchung, Pertussis Wiederaufleben Steuern Entwicklung von einer nächsten Generation azellulären Pertussis-Impfstoff (aPV) mit einer optimalen Kombination von neuartige Adjuvantien und Antigenen, die Immunantwort ausgelöst durch die ganze Zelle zu imitieren Pertussis-Impfstoff (wPV)9. Mit dem Protokoll beschrieben, berichtet wir kürzlich, dass die Änderung von einer aktuellen FDA-zugelassene aPV durch die Zugabe von ein neuartiges Adjuvans Bordetella Kolonisation Faktor A (BcfA), führte eine effizientere Reduzierung von B. Pertussis Keimbelastung von Maus Lunge10,11. Diese erhöhte Schutz wurde durch die Schiefstellung einer Alaun-induzierte Th1/Th2-Immunantwort, die schonender Th1/Th17 immun Profil10begleitet. Dieses Protokoll ist detailliert und umfassend, die Ermittler maximale Informationen durch gleichzeitige Auswertung von Host und immunen Antworten zu einer Vielzahl von Krankheitserregern zu ermöglichen.
Das hier beschriebene Protokoll folgt der repräsentativen Impfstoff Zeitplan, in Abbildung 1gezeigt, um optimale Host Immunantworten zu gewährleisten.
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Protocol
Alle Experimente mit lebenden Tieren wurden nach ein Protokoll genehmigt von der Ohio State University IACUC nach IACUC-Richtlinien durchgeführt. C57BL/6 Mäusen wurden in alle Impfungen und Infektionen eingesetzt. Sowohl weibliche als auch männliche Mäuse sind in jeder Gruppe nach NIH-Richtlinien verwendet. Die Anzahl der Tiere pro Gruppe wurde durch macht Berechnungen auf Grundlage der prognostizierten unterschiedlichen Ausgang unter experimentellen Gruppen bestimmt. Beispielsweise ergibt 8 Mäuse pro Gruppe 80 % Leistung bei α = 0,05 (2-seitig) für einen 2-Sample t- Test, um zu erkennen, Unterschiede in den Ergebnissen des Interesses von 1,33 Standardabweichungen (SDs).
(1) Immunisierung von Mäusen
- Bereiten Sie eine master-Impfstoff-Mischung in eine sterile physiologische Puffer wie Kochsalzlösung oder DPS.
Hinweis: Das Gesamtvolumen in der Mischung sollte 10 % umfassen mehr als erforderlich, die für die Immunisierung der gesamten Gruppe. Konzentrationen der Impfstoff Zusammensetzung sind Sie unten in den Schritten 1.1.1 und 1.1.2. Transportieren Sie die Elemente, die das Vivarium auf Eis.- Für B. Pertussis Studien umfassen die folgenden Impfstoff-Gruppen: aPV und aPV + BcfA. Darüber hinaus verwenden Sie Alaun, Impfstoff Antigene allein (FHA und Prn) und naiv (geimpft) Mäuse als Kontrollgruppen.
Hinweis: aPV ist 1/5th die menschliche Dosis von einer FDA-zugelassene aPV, das Tetanus-Toxoid, reduzierte Diphtherie-Toxoid, Pertussis Toxoid (PT), filamentöses Hämagglutinin (FHA) und Pertactin besteht (Prn) adsorbiert, Aluminiumsalze. Eine menschliche Dosis von aktuellen Keuchhusten aPV ist 0,5 mL, 1/5th einer Dosis deshalb 0,1 mL. Volumen für aPV + BcfA sind 0,1 mL des aPV (1/5th die menschliche Dosis) + 0,046 mL BcfA (30 µg) per Mausklick. Die maximale Lautstärke, die sicher an einem Muskel geliefert werden kann beträgt 0,1 mL. Weil der aPV + BcfA Impfstoff Volumen größer als 0,1 mL, der Impfstoff muss in beiden Schultern, ebenso grob einteilen, um sicher verabreicht werden geliefert werden. - Um einen experimentellen Impfstoff vorzubereiten, für eine Dosis kombinieren Sie 1 µg der FHA und 0,5 µg Prn mit 50 µg von Aluminium-Hydroxid-Gel in sterilen PBS. Lassen Sie die experimentelle aPV auf einem Labor-Walze für 15 min bei Raumtemperatur (RT) mischen. Danach drehen Sie das Rohr auf 18.000 x g für 5 min bei 4 ° c Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Inhalt in 1 mL sterile PBS.
- Für B. Pertussis Studien umfassen die folgenden Impfstoff-Gruppen: aPV und aPV + BcfA. Darüber hinaus verwenden Sie Alaun, Impfstoff Antigene allein (FHA und Prn) und naiv (geimpft) Mäuse als Kontrollgruppen.
- Das Vivarium gegründet Anästhesiegerät (Abbildung 2).
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass ausreichende Mengen an Sauerstoff und Isofluran in ihren jeweiligen Tanks vor Gebrauch. Wiegen Sie den Isofluran-Scavenger-Kanister und ersetzen Sie, wenn das Gewicht von 50 g erhöht. - Gründlich reinigen Sie der biologischen Sicherheitsschrank (BSC) und legen Sie die sauberen Induktion Kammer im Inneren des BSC. Verbinden Sie die Anästhesie und Schnitzeljagden Linien von der Anästhesiemaschine zur Induktion Kammer. Offen der Sauerstoff-Tank über den Regler um Sauerstoff zu gewährleisten, fließt und stellen Sie den Pegel auf 1,5-2 L/min.
- Legen Sie Mäuse gewünschtes Alter (6-12 Wochen) in der Induktion-Kammer. Schalten Sie Isofluran auf 2,5-3 % um die Mäuse leicht zu betäuben. Überwachen Sie die Tiere, bis sie nicht sich in der Kammer bewegen und ihre Atmung hat sich verlangsamt.
- Testen Sie die Induktion durch Zeh kneifen, für jede reflexive Bewegung beobachten. Wenn es keines gibt, sind die Mäuse für die Injektion bereit.
Hinweis: In diesem Experiment der ganze Käfig Tiere wurden betäubt auf einmal. Man kann wählen, um Tiere einzeln für die Injektion zu betäuben oder die Tiere ohne Betäubung zu injizieren. Eine der folgenden Methoden eignet. - Unterdessen bereiten Sie 1 mL Insulinspritzen (28 1/2) mit 0,1 mL Impfstoff jedes. Wenn Tiere voll induziert werden, ein Tier aus der Kammer zu entfernen und die Maus ventral auf ein Handtuch oder Bank Pad legen.
- Verabreichen Sie den Impfstoff intramuskulär. Mit der Spritze in einem 45°-Winkel mit der Fase nach oben legen Sie die Spritze ~ 5 mm in den Deltamuskel der Maus und injizieren Sie den Impfstoff zu.
Hinweis: Die hinteren Viertel/Flanke als eine Injektionsstelle anstelle der Deltamuskel verwendet werden. - Halten Sie nach der Injektion die Nadel in den Muskel für ca. 5-10 s. Sobald das Volumen geliefert wird, drehen Sie die Spritze um 180°, sodass Abschrägung entfernt steht, um eine Dichtung zu schaffen und zu verhindern das Austreten des Impfstoffs. Ziehen Sie dann langsam die Nadel aus der Injektionsstelle.
- Die Maus in den Käfig zurück. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Tieren in der angegebenen Gruppe.
- Schalten Sie die Isoflurane und spülen Sie die Induktion-Kammer mit Sauerstoff vor den nächsten Käfig von Mäusen zu betäuben.
- Überwachen Sie die Tiere, bis sie alle Warnungen und beweglichen im Käfig sind. Den Käfig an der Gehäuse-Position zurück.
- Monitor Tiere alle 12 h nach der Impfung, bis zu 48 h für die klinischen Symptome der Morbidität wie rau/ungepflegten Mantel langsam Gang oder Atmung gearbeitet. Wenn Symptome fortbestehen, beraten Sie sich mit der institutionellen Tierarzt und entfernen Sie die Mäuse aus der Studie zu, wenn nötig.
- Steigern Sie vier Wochen nach der ersten Impfung Mäuse durch betäuben und Verwaltung intramuskuläre Injektionen in die richtigen Deltamuskel der Maus mit der gleichen Impfstoff Formulierung, die zuvor gegeben wurde.
- Wieder, Monitor Tier keine klinischen Symptome. Haus Tiere für weitere 2 Wochen und dann mit einer Infektion.
2. Wachstum von B. Pertussis Stämmen und Vorbereitung der Infektion Inokulum
- Aus gefrorenen Beständen [kryokonserviert bei-80 ° C in 15 % Glycerin, gefroren von planktonischen Zunahme Stainer-Scholte (SS) Medien12] Streifen, B. Pertussis auf Agarplatten13 Bordet-Gengou (BG) mit 10 % Defibrinated Schafe ergänzt Blut und 100 µg/mL Streptomycin (10 % BG + Sm) zur Auswahl. 4 Tage inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C.
- Nehmen Sie ~ 8-10 einzelnen Kolonien von der Angabe von der Platte und impfen Sie 3 mL SS Medien mit 22,8 mM L-Cystein, 3,6 mM Eisensulfat, 3,3 mM Niacin, 48,8 mM Glutathion, 227 mM Ascorbinsäure, 1 mg/mL Heptakis und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt. Wachsen Sie die Kultur bei 37 ° C in einer Bandage bei 60 u/min für 16-24 h.
- Am nächsten Tag, verdünnen die Primärkultur 1:600, 1: 300, 1: 120, 1: 60, 01:30 und 01:15 in 3 mL ergänzt SS-Medien. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C in Bandage bei 60 u/min für 16-24 h.
- Messungen der Extinktion bei 600 nm (OD600) für die Bakterienkulturen. Verdünnen Sie verwenden Spektrofotometer Küvetten, die Kulturen 01:10 durch Zugabe von 0,1 mL der flüssigen Kulturen auf 0,9 mL sterile PBS.
- Wählen Sie eine Kultur mit OD600≈ 0,8-1,2. Berechnen Sie das Volumen erforderlich, um 1 OD (Abbildung 3). Drehen Sie die Lautstärke in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch bei 6000 X g für 5 min bei 25 ° C. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen Bakterienzelle Pellet in 1 mL sterile PBS, eine Dichte von 1 OD/mL zu erhalten [1-3 x 109 Koloniebildenden Einheiten (KBE) /mL].
- Zur Vorbereitung einer Inokulum von ~ 5 x 105 bis 1,5 x 106 KBE/Maus in 40-50 µL, Wirbel und verdünnen Sie die bakterielle Lösung (aus Schritt 2.5) seriell 100fach in 1 mL sterile PBS, ~ 1-3 x 107 KBE/mL (Abb. 4A) zu erreichen. Transportieren Sie das Inokulum, das Vivarium auf Eis.
(3) murinen intranasale Infektionsmodell
- Festlegen Sie im Vivarium Sauerstoff und Anästhesie Bedingungen wie 1.3 und 1.4 beschrieben. Wie in Schritt 1.5 beschrieben, setzen Sie die Mäuse in der Kammer zu betäuben. Die Tiere zu überwachen, bis die Betäubung wirksam wird.
- Wenn die Mäuse betäubt sind, entfernen Sie ein Tier zu einem Zeitpunkt aus der Induktion Kammer. Heben Sie die Maus durch das Genick des dorsalen Thorax, hinter den Schulterblättern und Hals. Positionieren Sie die Maus aufrecht um die Nase zu gelangen.
- Mit einer 200 µL Pipettenspitze, langsam zuweisen Sie 40-50 µL bakterielle Inokulum die Nasenlöcher der Maus (20-25 µL in jeder Nare). Halten Sie die Maus, bis das gesamte Inokulum durch das Tier eingeatmet worden ist. Wenn einige das Inokulum Blasen heraus, die Bläschen zu sammeln und wieder in die Nasenlöcher zu vermitteln. Liefern Sie eine gleiche Menge von sterilen PBS zu einer Gruppe von Mäusen als Negativkontrolle.
- Wie in Schritten 1.10-1.12, die geimpften Tiere in ihren Käfig zurück und die Tiere zu überwachen, bis sie wach und bewegt werden. Den Käfig zurück zu seiner ursprünglichen Wohnraum auf dem Gestell zurück. Spülen Sie die Induktion-Kammer mit Sauerstoff, um die verbleibende Isofluran entfernen, bevor Sie betäuben den nächsten Satz von Tieren. Beobachten Sie die Tiere für 48 Stunden nach der Infektion.
- Im Labor Platte Verdünnungsreihen des Inokulums in sterilen PBS, um die tatsächliche KBE geliefert um die Mäuse zu überprüfen. Platte 0,1 mL Verdünnungen auf 10 % BG + Sm Platten (Abb. 4A). Legen Sie die Platten im Inkubator 37 ° C und für 4 Tage wachsen. Zählen Sie und rechnen Sie die KBE aus das Inokulum an der Maus (Abbildung 4B) geliefert.
4. Ernte von tierischem Gewebe nach der Infektion
- Maus-Dissektion und Gewebe Ernte vorbereiten.
- Alle Werkzeuge (grob- und Scheren, gebogene Schere, feine Pinzette, Pellet Stößel und Dreieck Streuer) benötigt für die Verarbeitung von Gewebe im Autoklav zu sterilisieren. Verschließen Sie die Werkzeuge in Sterilisation Beutel. Wickeln Sie die Glas-Dounce-Homogenisatoren in Folie und fügen Sie Autoklaven Band um Sterilität anzugeben.
- Bereiten Sie Agar-Platten 1 oder 2 Tage vor der Ernte Gewebe, um sicherzustellen, dass die Platten sind erstarrte vor dem Gebrauch vor. Verwenden Sie für B. Pertussis 10 % BG + Körperlänge Label Platten für die Nasenscheidewand, Luftröhre und Lunge für jede Maus mit der gewünschten Verdünnungen, empirisch ermittelt für jedes Experiment.
- Füllen Sie und beschriften Sie KBE Verdünnung Röhren. Fügen Sie 0,9 mL sterile PBS, sterile 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen basierend auf Zahl der Organe zu verarbeiten und Verdünnungen pro Organ.
- Füllen Sie und beschriften Sie Rohre für Gewebe-Sammlung:
- Nasenscheidewand und Luftröhre: füllen Sie einen sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 0,3 mL steril 1 % Kasein mit PBS-Puffer (Ca2 + und Mg2 +-frei). Shop bei 4 ° C.
- Lunge: Fügen Sie 2 mL steril 1 % Kasein in PBS eine sterile 15 mL konische Rohr und speichern bei 4 ° C hinzu. Lungen für Histologie ernten, 2 mL 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF) hinzufügen und speichern bei RT
- Milz: Fügen Sie 3 mL RPMI + 5 % FBS eine 15 mL konische Röhrchen. Shop bei 4 ° C.
- Blut: beschriften Sie zwei Sätze sterile 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen für Vollblut und Serum.
- Frische 70 % igem Ethanol sollte bereit sein, füllen Becher und Flaschen für Dissektion sprühen.
- Transportieren Sie alle Materialien für das Vivarium auf einem Wagen am Tag der Ernte. Reinigen der BSC und Einrichten der Anästhesiemaschine wie in den Schritten 1.3 und 1.4.
- Legen Sie die Mäuse werden in der Induktion Kammer seziert und mit Sauerstoff fließt, schalten Sie die Isofluran auf 5 % und warten Sie, bis die Tiere bewusstlos sind. Entfernen von Mäusen eine zu einem Zeitpunkt, und Zervikal verrücken das Tier als eine sekundäre Methode, um Tod zu gewährleisten. Nach zervikale Dislokation sollte Sterbehilfe durch das Fehlen einer Atemfrequenz und/oder fehlender Rückzug Reflex (Zehe Kneiftest) bestätigt werden.
- Positionieren Sie die Maus, die Bauchseite nach oben, auf dem Brett Dissektion und stecken Sie die Arme und Beine geöffnet. Sprühen Sie den Körper der Maus mit 70 % Ethanol.
- Mit Pinzette, Verschluss der Haut unter dem Bauch, in der Mitte des Beckens. Mit einer scharfen Schere, machen Sie einen vertikalen Schnitt bis zu den Unterkiefer. Dann die Haut von der peritonealen Wand durch auseinanderdrücken der zwei Schichten zu sezieren, mit kleinen Bewegungen mit der Schere geschlossen. Legen Sie die Haut an den Seiten der Karkasse, eine freie Feld für sterile Orgel Ernte zu erstellen.
- Fassen Sie das intakte Bauchfell unterhalb des Brustkorbs auf oder um die Leber und Aufschneiden in Richtung des Brustkorbs. Setzen Sie den unteren Verdauungstrakt und bewegen Sie den Doppelpunkt enthüllt die Milz links. Mit gebogenen Pinzette, greifen Sie die Milz und entfernt sezieren Sie das Bindegewebe mit einer Schere zu. Ort der Milz in eine 15 mL konische Röhrchen mit 3 mL RPMI + 5 % FBS und Ort das Rohr auf dem Eis.
- Verwenden Sie Zange um den Brustkorb am Xiphoid Prozeß zu stabilisieren und das Zwerchfell aufgeschnitten. Lungen sollten entleeren und fallen in Richtung der Wirbelsäule. Schneiden Sie den Brustkorb an den Seiten, die Brustplatte zu entfernen.
- Isolieren und Entfernen des überlegenen Lappens der rechten Lunge14, schneiden die pulmonalen Arterien und Venen. Legen Sie den Lappen in eine 15 mL konische Röhrchen mit 10 % NBF und Ort der Röhre bei RT für mindestens 24 h um das Gewebe zu beheben. Isolieren Sie die verbleibenden Lappen der rechten Lunge und der linken Lunge. Lappen in eine 15 mL konische Röhrchen mit 2 mL 1 % Kasein mit PBS-Puffer und legen Sie ihn auf Eis.
- Nach dem Schneiden der Lungenvenen und Arterien, die Lunge zu zergliedern, erlauben Sie die Brusthöhle mit Blut zu füllen, da die Maus exsanguinates. Mit einer 1 mL Pipetman mit Spitze, sammeln Sie das Blut und in den bereits beschrifteten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen. Platzieren Sie das Rohr auf dem Eis.
- Dann vom Hals, entfernen Sie das Weichgewebe (Parotis, sublinguale und Submaxillardrüsen Drüsen und Lymphknoten), das die Luftröhre abdeckt. Öffnen Sie und entfernen Sie die Schutzhäuten, die rund um die Luftröhre. Zart, mit feinen Pinzetten und Scheren, trennen Sie die Luftröhre von Speiseröhre und jede andere Bindegewebe von oben auf das Schlüsselbein nach unten des Unterkiefers.
- Mit Pinzette, halten Sie sich an der Luftröhre und schneiden Sie die Luftröhre am oberen Rand des Schlüsselbeins. Herunterziehen der Luftröhre zu maximieren Elastizität und die Luftröhre an der Unterseite des Unterkiefers rechts oberhalb des Kehlkopfes, so weit wie möglich zu isolieren (~ 1 cm) schneiden. Die Orgel in einen bereits beschriftete 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 0,3 mL 1 % Kasein mit PBS-Puffer und auf Eis legen.
- Lösen Sie die Maus und ventral, mit der Maus vor der Forscher für freien Zugang auf die Nase legen. Sprühen Sie den Kopf der Maus mit 70 % Ethanol und mit Händen greifen Sie die Maus direkt hinter dem Schädel.
- Mit Schere, Schnitt entfernt weiches Fleisch des Mauls, ausgehend von der Unterseite der Nase und Bewegung nach oben. Darüber hinaus entfernen Sie das Fell, Haut und Barthaare um die Nase. Dann, mit Zange und gebogene Schere, stecken Sie die Spitzen Schere Nares mit den Kurven nach außen zeigte, und aufschneiden den Nasengang auf die Augen, a V-wie Anordnung zu schaffen.
- Mit feinen Pinzette, sammeln Sie die Nasenscheidewand und weiches Gewebe innerhalb der erstellten Formation. Legen Sie das Gewebe in einem Pre-beschrifteten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 0,3 mL 1 % Kasein mit PBS-Puffer und auf Eis legen.
- Entsorgen Sie den Kadaver in einer Biohazard-Tasche. Spülen Sie bevor das nächste Tier sezieren die Werkzeuge mit entionisiertem Wasser, und legen Sie dann in einen Becher gefüllt mit 70 % Ethanol. Entfernen Sie die Werkzeuge, überschüssige Ethanol abzuschütteln Sie, und fahren Sie dann mit der nächsten Dissektion
- Jede Maus, die folgenden Schritte 4.3-4.14 zu sezieren.
- Verarbeiten Sie das Gewebe, wie unten beschrieben.
(5) die Verarbeitung der Milz
- Um die Milz zu distanzieren, legen Sie ein 70 µm Zelle Sieb in der Kulturschale 60 mm Gewebe. Gießen Sie die Milz und die zugehörigen Medien in den Filter mit den Kolben der Spritze 3 mL. Pürieren Sie sorgfältig die Orgel bis es vollständig dissoziiert und durch Zelle Sieb gefiltert.
- Spülen Sie den Filter mit 3 mL RPMI + 5 % FBS in der Kulturschale Gewebe. Sammeln Sie die Zellsuspension und legen Sie sie in ihrer ursprünglichen 15 mL-Tube. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 450 X g für 5 min bei 4 ° C zu die Zellen zu Pellets.
- Aspirieren oder den Überstand abgießen und lyse der roten Blutkörperchen durch das Pellet in 2 mL Ammoniumchlorid Kalium (ACK) Puffer (Ammoniumchlorid 150 mM, 10 mM Kaliumbicarbonat, 0,1 mM Natrium EDTA) resuspending. 3 min bei RT (25 ° C) inkubieren.
- Füllen Sie die Rohre bis zu 8 mL RPMI + 5 % FBS und Zentrifuge Röhren 450 X g für 5 min bei 4° C. Aspirieren oder den Überstand abgießen. Aufschwemmen der Zelle Pellets in 5 mL RPMI + 5 % FBS und zählen die Splenocyten mit einem Hemocytometer und einem Mikroskop.
- Berechnen Sie das Volumen der Zellen benötigt, 2,5 x 106 Zellen pro Bohrloch zu stimulieren. Samen Sie in einem 48-Well-Platte Zellen in 0,5 mL der T-Zell-Medien (RPMI 1640 + 10 % FBS 10 µg/mL Gentamicin und 50 µM β-Mercaptoethanol) pro Bohrloch.
- Basierend auf der obigen Berechnung, legen Sie die erforderliche Menge der Zellsuspension in ein frisches Tubus und Pellet-Zellen bei 450 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Das Pellet in das erforderliche Volumen der T-Zell-Medien aufzuwirbeln. Für ein B. Pertussis -Infektion-Modell testen die Antigen-spezifische Zytokin-Antwort auf Impfstoff Antigene: Pertactin (Prn) und filamentöses Hämagglutinin Adhäsion (FHA). Daher sind 3 Behandlungen erforderlich: (1) keine Stimulation (NS, als Negativkontrolle), Prn (2) und (3) FHA. Für den Assay beträgt 7,5 x 106 Zellen in 1,5 mL T-Zell-Medien erforderlich (2,5 x 106 Zellen je 0,5 mL).
- Aliquoten 0,5 mL Zellsuspension in einem 48-Well-Platte.
- Um Zellen zu stimulieren, mischen Sie Antigene auf 2 Mal die gewünschte Konzentration in T-Zell-Medien. Endkonzentrationen Prn und FHA = 1 µg/mL und 0,5 µg/mL, beziehungsweise. Daher mischen Sie 2 µg/mL Prn oder 1 µg/mL FHA in 0,5 mL. Dann, aliquoten 0,5 mL des Mediums Stimulation in jeder bestimmt gut, verdünnen die Antigen-Behandlung auf 1 X in einem Endvolumen von 1 mL in jede Vertiefung.
- Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in 5 % CO2. Sammeln Sie Überstände am 7. Tag und aliquoten 0,5 mL der Überstände in bereits beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen. Speichern Sie die Proben in einem-20 ° C bis bereit zu testen, Antigen-spezifische Zytokine durch ELISA (Abbildung 6).
6. Verarbeitung der Lunge
- Übertragen Sie die Lunge (in 2 mL 1 % Kasein mit PBS-Puffer) in eine sterile, 15 mL Dounce-Homogenisator. Verwendung Stößel zu Gewebe zu homogenisieren. Distanzieren Sie, bis keine große Partikel des Gewebes bleiben. Legen Sie die homogenisierte Suspension wieder in der ursprünglichen 15 mL Tube.
- Entfernen einer 0,3 mL aliquoten für Galvanik KBE und Zentrifugieren Homogenat 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Sammeln und aliquoten Röhren der Überstand in 0,5 mL Aliquots in bereits beschriftete Microcentrifuge. Speichern Sie die Proben in einem-20 ° C bis zur Analyse von Zytokinen durch ELISA.
- Bereiten Sie gewählte Verdünnungen durch Verdünnen seriell 0,1 mL der Suspension homogenisierte Lunge in Verdünnung Röhren (0,9 mL sterile PBS vor). Platte 0,1 mL empirisch gewählte Verdünnungen auf bereits beschriftete 10 % BG + Sm-Platten und Ausbreitung mit sterilen Dreieck Streuer.
- 4 Tage inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in Raumluft.
- Zählen Sie und rechnen Sie KBE/Lunge (Abbildung 6). Kurz, multiplizieren Sie wiederhergestellten KBE Zahlen durch den Verdünnungsfaktor der Platte, dann auch durch das Gesamtvolumen, in dem die Orgel verarbeitet wurde. Die KBE-Berechnungen sind dann Log10 -Werte für jedes Tier verwandelt und grafisch dargestellt.
- Platten mit 30-300 Kolonien sind leicht und genau gezählt. Platten mit weniger als 6 Kolonien sollte nicht für Berechnungen verwendet werden, da solche niedrigen Kolonie Zahlen Fehler15einzuführen. Um eine Untergrenze der Erkennung zu erhalten, ist das Gesamtvolumen, in denen ein Organ homogenisiert wurde, dividiert durch das Volumen, die verwendet, um vor Ort auf einen Teller aus dem unverdünnten Homogenat (zB., 2 mL Gesamtvolumen geteilt durch 0,1 mL der unverdünnten Homogenat entspricht die untere Grenze des 20 KbE nachweisbar).
7. Verarbeitung der Nasenscheidewand und der Trachea
- Homogenisieren des Gewebes in der 0,3 mL von 1 % PBS/Kasein mit Pellet zerstoßen schnurlose motor Homogenisatoren. Homogenisieren des Gewebes für 0,5-1 min bis das Gewebe weitgehend getrennt ist. Bakterien sollten in die Suspension vergossen werden.
- Vorbereiten der gewählten 10 x Verdünnungen durch serielle Verdünnung von 0,1 mL der homogenisierte Suspension in Verdünnungen Röhrchen mit 0,9 mL sterile PBS. Dot 0,1 mL jeder Verdünnung auf beschriftet vorab 10 % BG + Sm-Platten und verbreiten die Suspension mit einem Dreieck-Spreader, die mit 70 % igem Ethanol waschen und Flamme sterilisiert worden.
- 4 Tage inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in Raumluft.
- Zählen Sie und rechnen Sie KBE/Orgel wie in Schritt 6.5 (Abbildung 6). Um eine Untergrenze der Erkennung zu erhalten, ist das Gesamtvolumen, in denen ein Organ homogenisiert wurde, dividiert durch das Volumen, die verwendet Punkt auf einer Platte aus dem unverdünnten Homogenat (zB., 0,3 mL Gesamtvolumen geteilt durch 0,1 mL der unverdünnten entspricht der untere Grenzwert der 3 KBE Detecta BLE).
8. Verarbeitung von Blut
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit isolierten Vollblut bei 18.000 x g für 30 min bei 4 ° C zu roten Blutkörperchen Pellets.
- Das Serum überstand und Pipettieren zu einem bereits beschriftete Serum Microcentrifuge Schlauch vorsichtig abnehmen. Speichern Sie die Rohre bei-20 ° C bis bereit für weitere nachgelagerte Analyse (i.e., total und spezifische Ig ELISA).
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Representative Results
Das Modell beschrieben zeigt eine Methode zur Bewertung von Impfstoff Effizienz und Immunreaktionen während Wirt-Pathogen Interaktionen. Abbildung 1 zeigt die repräsentative Impfstoff Zeitplan zu immunisieren und Mäuse zu infizieren und zu ernten Gewebe für die Analyse verwendet. Abbildung 2 zeigt das Setup des Systems, Anästhesie, Mäuse, induzieren Ermittler Impfungen und bakterielle Befallsdruck zu ermöglichen. Abbildung 3 zeigt Beispiel OD600 Messungen und Berechnungen zu einem 1 OD Bakteriensuspension zur Vorbereitung 100-fold verdünnte bakterielle Inokulum an Mäusen ausgeliefert werden. Abbildung 4 zeigt die Inokulum-Vorbereitung für die Infektion verwendet, Beschichtung Schema die serielle Verdünnungen und die Beispielrechnungen zur KBE aufzählen an Mäusen je nach Beschichtung Verdünnungsreihen geliefert. Abbildung 5 zeigt antigenspezifischen Rückruf Reaktionen nach sieben Tagen Stimulation mit dem Impfstoff Antigen FHA entlockte. Impfen Sie Milzzellen von der Kombination-Impfstoff-Gruppe, Alaun/FHA/BcfA, produzierte IFNγ und IL-17, während deutlich Downregulating IL-5. Dieser Effekt fördert eine Th1/Th17-Polarisierung der Immunantwort bei B. Pertussis -Infektion. Hintergrundwerte für Zytokine wurden durch Inkubation von immunisierten Milzzellen mit Medien allein, darauf hinweist, dass die Zytokine entdeckt Rückruf Reaktionen auf die Impfung (Daten nicht gezeigt) wurden produziert. Abbildung 6 zeigt ein Beispiel KBE-Enumeration von Bakterien, die Atemwege Gewebe einer immunisierten Maus erholt, mit seriellen Verdünnungen von B. Pertussis Gewebe Homogenates vernickelt auf 10 % BG + Sm Platten. Rohe Grafen waren die Verdünnung Faktor und Total Volumen des Gewebes lysate multipliziert und die Daten waren Log umgewandelt. KBE von immunisierter Tiere sind nicht geimpft (naive) Tiere zu bestimmen, die Schutzwirkung des Impfstoffs dann gegenüber.
Abbildung 1 : Repräsentative Impfstoff Zeitplan. Mäuse sind geimpft am Tag 0 und dann verstärkt ~ 4 Wochen später (d28) mit den entsprechenden aPV. Infektion der Mäuse mit B. Pertussis tritt ~ 2 Wochen (d42) nach Steigerung der Mäuse. Nach der Infektion sterben die Tiere an verschiedenen Tagen (d43-56) nach Inokulation. Gewebe und Blut wird für die nachgelagerte Analyse gesammelt (zB., KBE Enumeration, Zytokine und Antikörper ELISAs). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Anästhesie Maschine einrichten. Dargestellt ist eine Narkose Verdampfer mit angeschlossenen Kammer und Schnitzeljagden Ansaugsystem (im inneren biologischen Sicherheitsschrank). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Vorbereitung von 1 OD600 Bakteriensuspension. OD600 Werte stammen aus verdünnten primäre B. Pertussis Kulturen. Eine Kultur in Log-Phase wurde verwendet, um Volumen erforderlich, um eine Kultur auf 1 OD600 Kultur für Infektion zu berechnen. Kurz, teilte ein OD600 1 berechnete OD600 der gewünschten Kultur zu einem Volumen entspricht 1 OD für Infektion verwendet werden. Kurz, teilte ein OD600 von 1 berechneten OD600 von die gewünschte Kultur zu einem Volumen entspricht 1 OD für Infektion verwendet werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Berechnung der gelieferten intranasale Inokulum. (A) schematische Darstellung der serielle Verdünnung der Infektion-Inokulum, das 10-410-5und 10-6verdünnt wird. Diese Verdünnungen sind auf 10 % BG + Sm vernickelt, für 4 Tage bei 37 ° C inkubiert und dann gezählt. (B) die Grafen von 10-410-5und 10-6 Verdünnungen werden dann verwendet, um intranasal gelieferten KBE berechnen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Produktion von Zytokinen durch Milzzellen immunisiert mit Alaun/BcfA/FHA FHA, Alaun/FHA und BcfA/FHA. Dissoziierte Zellen wurden mit FHA 7 Tage kultiviert. Überstände wurden von Sandwich ELISA für (A) IFN-γ, (B) IL-17 und (C) IL-5 getestet. Fehler-Bars werden ausgedrückt als Standardabweichung des Mittelwerts der einzelnen Gruppen, n = 5 pro Gruppe. p < 0,001. Die Figur ist aus einer früheren Veröffentlichung10angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : B. Pertussis KBE und Berechnungen aus geernteten Gewebe von Mäusen. (A) B. Pertussis KBE aus homogenisierten Maus Gewebe. 0,1 mL Verdünnungsreihen für 4 Tage bei 37 ° C inkubiert. (B) die Berechnungen basieren auf KBE homogenisierte Luftröhre entnommen. KBE wurden multipliziert mit dem jeweiligen Verdünnung und dann multipliziert mit 10 KBE pro mL zu erreichen. Um KBE pro Organ zu erhalten, wurden das Gesamtvolumen der KBE pro mL multipliziert die Orgel wurde homogenisiert (0,3 mL). Die KBE pro Organ waren dann Log umgewandelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das umfassende Protokoll hier beschriebenen um Impfstoff induzierte Immunität gegen B. Pertussis -Infektion zu studieren wird auch Bewertung der Host Antworten auf eine Vielzahl von anderen Krankheitserregern ermöglichen. Das Protokoll beschreibt Methoden liefern Impfungen, bestimmen Impfstoff Wirksamkeit folgende Erreger Herausforderung und parallele Dissektion der Immunfunktion. Bei der Anpassung des Protokolls um andere Krankheitserreger zu studieren, müssten mehrere Parameter geändert werden. Diese beinhalten, aber beschränken sich nicht auf die Art der tierischen Anästhesie, Impfstoff Zusammensetzung, Dosierung und Art der Verabreichung. Darüber hinaus sind die Dosis und Art der Verabreichung der herausgeforderten Erreger von Interesse, ausgewählte Gewebe für Ernte und nachgelagerten Bewertung der Immunantworten Faktoren, die für die Erreger/Krankheit von Interesse geändert werden können.
Die Maus-Modell von B. Pertussis -Infektion ist weit verbreitet und ist ein hervorragendes Modell für Pathogenese und Impfstoffentwicklung Studien16,17,18,19,20. Murine Modelle weisen viele Ähnlichkeiten mit Infektionen beim Menschen, einschließlich: (i) Bakterien beschränken sich auf die Atemwege und vermehren sich rasch, Ii) Jungtiere display vergleichsweise schwere Infektionen, Iii) gute Übereinstimmung zwischen Impfstoffe, die schützen Kinder gegen Pertussis und diejenigen, die Mäuse gegen Infektionen und iv zu schützen) B. Pertussis-spezifischen T-Zellen und Antikörper vermitteln Natur- und Impfstoff-induzierte schützende Immunität21,22, 23 , 24. daher die Mausmodell erlaubt das Studium der Immunisierung Auswirkungen auf bakterielle Abstand25. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Mäusen Modell B. Pertussis Infektionen ist die Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Knockout und transgenen Tieren, kritische Spieler in der Impfstoff-induzierte Immunantwort19,26zu studieren.
Die meisten Impfungen verabreicht werden parenteral, speziell über die intramuskuläre (i.m.)-Route. Diese Route wird bevorzugt, da es systemische Immunität mit minimalen lokale Reactogenicity27,28,29entlockt. Alternativen zu intramuskuläre Injektionen sind subkutane (s.c.) oder intraperitoneal (i.p.) Lieferung, die auch systemische Reaktionen auslösen. Subkutane Routen sind auch attraktiv, da gibt es eine große Population von resident antigenpräsentierende Zellen (APC) in der Dermis mit Zugriff auf das Gefäß- und lymphatischen Systems30. Intradermale Lieferung ist jedoch nicht für die Pertussis-Impfstoff erforscht worden. Intraperitoneale Lieferung von experimentellen aPV ähnliche Immunität gegen intramuskuläre Immunisierung31 erzeugt und ist eine zuverlässige Injektion Route für murinen Studien allerdings unpraktisch für den klinischen Einsatz.
Dieses Protokoll nutzt die i.m. Immunisierung Route, die Schutz in der Lunge, aber nicht den Nasenrachen32bietet. Jüngste Studien haben gezeigt, dass ein intranasale (i.n.) Impfstoff eine lokale, mukosalen Immunantwort fördert, das schützt die obere und unteren Atemwege, insbesondere der Nase, dient als Reservoir für Bakterien, die anschließend auf andere übertragen werden können Gastgeber-33. Darüber hinaus nachweislich i.n. Immunisierung Gewebe Residenten Speicher zu generieren, die nicht durch systemische Immunisierung33,34erzeugt wird. Daher hängt die Wahl der Impfstoff Verwaltung Route stark von der Art des Impfstoffs und Immunantwort benötigt, um gegen Krankheiten zu schützen.
Die intranasale Route der bakteriellen Lieferung beschrieben in diesem Protokoll ist eine weit verbreitete Methode für respiratorische Erreger, die sicher und konsequent eine bakterielle Inokulum direkt in die Atemwege von narkotisierten Mäusen liefert. Unser Protokoll verwendet eine Volumen-Dosis (40-50 µL), die in den Nasopharynx und Reisen in die unteren Atemwege inhaliert wird. Besiedlung der Lunge werden minimal35jedoch ein geringes Volumen Inokulum (10-20 µL) würde Nasopharynx besiedeln. Aber das Einatmen von B. Pertussis-mit Luft Tröpfchen gilt die Eigenform der Infektion von Einzelpersonen und Übertragung. Diese Art der Verabreichung wurde in verschiedenen Tiermodellen36,37verwendet. Um vergleichbare Infektion i.n. Impfung direkt zu erreichen, sind wesentlich höhere Konzentrationen an das bakterielle Inokulum (109-1011 KBE/mL) und Lieferzeit erforderlich38.
Um Besiedlung der Atemwege Maus herzustellen, verwendet dieses Protokoll frische Bakterien, gewachsen in Flüssigkultur um sicherzustellen, dass Bakterien verwendet für die Impfung in der virulenten Phase und werden in der Log-Phase repliziert. Experimentatoren können auch ein Inokulum aus Pre-betitelten, gefrorene Aktien. Dies ermöglicht ein Wissen über die KBE zur Maus verabreicht wird. Jedoch möglicherweise die Bakterien in diesen Befallsdruck nicht virulente phasengleich, die die Effizienz der Atemwege Kolonisation39verringern kann. Nach der Infektion ist das Inokulum überzogen, um die Bakterien zu bestimmen, die KBE an der Maus geliefert. Die Ermittler können auch Teller das Inokulum vor der Infektion in Vivo Lebensfähigkeit der Bakterien zu gewährleisten und Dosis des Inokulums bestätigen.
Nach der Infektion sind bakterielle KBE von Homogenisieren isolierte Gewebe von geopferten Mäusen in einer vorbestimmten Timepoint aufgezählt. Ein Nachteil dieser Methode ist ihre Unfähigkeit, kinetisch Erreger KBE für einen bestimmten Satz von Mäusen zu verfolgen. Forscher müssen mehrere Gruppen von Tieren geopfert an verschiedenen Zeitpunkten verwenden, um Impfstoff induzierte bakterielle Einschränkung zu untersuchen. Die Anzahl der Mäuse in jedem Experiment variiert abhängig von der Anzahl der Zeitpunkte, zu prüfen und die gewünschte Wirkung-Größe. Dies kann höhere biologische Variante einführen. Integration der Biolumineszenz oder fluoreszierende Reportergen in der Erreger von Interesse wird nichtinvasive Überwachung von Wachstum und Verbreitung in Vivo im Laufe der Infektion35ermöglichen. Diese Methode verringert biologische Variation und minimiert die erforderliche Anzahl von Versuchstieren, da Längsschnittdaten aus der gleichen Gruppe von Tieren gewonnen werden.
Das Gewebe Dissoziation und Homogenisierung Protokoll hier für Atemwege Gewebe eingesetzt gilt auch für die Kolonie Aufzählung von anderen festen Geweben wie z. B. Leber, Nieren, Darm oder Blase, Sites der Infektion zu befragen und Verbreitung der Erreger von Interesse.
Zusammen mit KBE-Enumeration ermöglicht dieses Protokolls Charakterisierung der Immunantwort durch Immunisierung und natürliche Infektion ausgelöst. Speziell, Quantifizierung der Zytokine produziert systemisch und lokal zur Bestimmung der wirksame immun Profile durch Immunisierung erlauben. Zytokine sind Immunmodulatoren, die Förderung der zellulären Zustrom betroffenen Gewebe und Aktivierung der zellulären Immunität sowie Hilfe für die Generation der humoralen Antworten10,40,41. Unter Verwendung dieses Protokolls, werden Zytokine produziert in verschiedene Gewebe Fächer, wie z. B. der Lunge und Milz, erkannt. Obwohl hier nicht angezeigt, ist das Stimulation-Protokoll auch für die Bewertung der Antworten in den Lymphknoten.
ELISA Analyse ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von Zytokinen in Medien Überstände oder gemischte Suspensionen (i.e., Homogenates oder Serum), Informationen auf Bevölkerungsebene nachgeben und Charakterisierung von Antigen-spezifischen Cytokine Antworten von einer gemischte Zellkultur an bestimmten Zeitpunkten. Im Gegensatz dazu Methoden wie ELISPOT oder Durchflusszytometrie erlauben Auswertung die Anzahl der Zellen, die ein Analyten zu produzieren und das Niveau der Ausdruck pro Zelle42,43. Obwohl hier nicht beschrieben, sind diese Methoden auch für Erkennung der Antigen-spezifische B-Zellen. Die Kombination von KBE-Enumeration und immunologischen Assays bieten Überblick über die Reaktion auf Impfungen.
Weitere Analysen, die unter Verwendung dieses Protokolls Infektion durchgeführt werden können gehören epigenetische oder transkriptomischen-Analyse bei DNA und RNA aus Gewebe von Interesse44gewonnen wird. Somit ist dieses Protokoll unter Berücksichtigung der entsprechenden Impfstoff Zusammensetzung, Impfungen und Erreger Lieferweg, vielseitig in ihrer Umsetzung und gut geeignet für verschiedene Modelle der Infektion. Diese Techniken sind auch für nicht-infektiöser Krankheiten (z.B. Krebs, Multiple Sklerose, Asthma, Autoimmunerkrankungen) wo Impfstoffe als eine therapeutische Modalität verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von 1R01AI125560-01 und Start-up-Fonds von der Ohio State University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2L induction chamber | Vet Equip | 941444 | |
| Fluriso | Vet One | V1 501017 | any brand is appropriate |
| Bordet Gengou Agar Base | BD bioscience | 248200 | |
| Casein | Sigma | C-7078 | |
| Casamino acids | VWR | J851-500G | Strainer Scholte (SS) media components |
| L-Glutamic acid | Research Products Int | G36020-500 | |
| L-Proline | Research Products Int | P50200-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-10 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Fisher | M2670-500G | |
| Calcium Chloride | Fisher | C75-500 | |
| Tris base | Fisher | BP153-1 | |
| L-cysteine HCl | Fisher | BP376-100 | SS media suplements |
| Ferrous Sulfate heptahydrate | Sigma | F-7002 | |
| Niacin | Research Products Int | N20080-100 | |
| Glutathione | Research Products Int | G22010-25 | |
| Ascorbic acid | Research Products Int | A50040-500 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | any US source, non-heat inactivated |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15710064 | |
| B-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| 15mL dounce tissue grinder | Wheaton | 357544 | any similar brand is appropriate |
| Cordless Hand Homogenizer | Kontes/Sigma | Z359971-1EA | any similar brand is appropriate |
| Instruments - scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders | any brand is appropriate | ||
| 3mL syringes | BD bioscience | 309657 | |
| 15mL conical tubes | Fisher | 339651 | |
| 1.5mL microfuge tubes | Denville | C2170 | |
| 70um cell strainers | Fisher | 22363548 | |
| 60mm plates | ThermoFisher Scientific | 130181 | |
| 48-well tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 08-772-1C | |
| 1mL insulin syringe 28G1/2 | Fisher Scientific/Excel Int. | 14-841-31 | |
| Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-21 | |
| Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-77 | |
| Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-172-09 |
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